慢性霉菌念珠菌由Stat1 DNA结合结构域中的功能性突变引起

顺琴Takeazi., masafumi yamada, Masahiko. Kato., Myoung-Ja Park, kenichi Maruyama., Yasuhiro Yamazaki., Natsuko Chida., Osamu. Ohara., ichiro 和 Tadashi. ariga.
J免疫素 2012年8月1日， 189 (3) 1521-1526; DOI： //doi.org/10.4049/jimmunol.1200926
装载

抽象的

慢性粘膜肽（CMC）是一种异质的一次免疫缺陷疾病，其特征是慢性和复发性的念珠菌皮肤，钉子和oropharynx的感染。致功能突变stat1.最近被证明负责CMC的常染色体显性或散发病例。报告的突变已被公共定位在卷曲卷域中，导致STAT1的磷酸化受损。然而，最近的晶体分析和直接诱变实验表明影响STAT1的DNA结合结构域的突变也可能导致Stat1的持续磷酸化。据我们所知，本研究表明，第一次表明C.1153C的DNA结合结构域突变&在外显子14（p.T385M）中是两种无关的日本患者中的零星CMC的遗传原因。底层机制涉及由于在卷绕线圈结构域突变中观察到的去磷酸化受损的脱磷酸化，涉及STAT1功能的增益。

介绍

慢性粘膜肽（CMC）是一种异质的一次免疫缺陷疾病，其特征是慢性和复发性的念珠菌 皮肤，钉子和oropharynx的感染（1）。它通常与各种内分泌或自身免疫障碍有关。特别是，在含有念珠菌病和外胚层营养不良的自身免疫聚合物病变中，粘膜外念珠菌病伴随着低丙酮，肾上腺衰竭，依赖胰岛素​​依赖性糖尿病，Alopecia和吸烟综合征（2）。虽然常染色体 - 显性形式的CMC也与内分泌疾病相关，例如甲状腺功能亢进（3），这些疾病的遗传原因直到最近仍然未知。

2011年，两组据报道，常染色体占优势CMC和散发性CMC是由突变引起的 stat1. (4–6）。报告的突变已被公共定位在卷曲线圈（CC）域中，导致STAT1功能的增益由于Date1去磷酸化受损（4）。然而，结晶分析和直接诱变实验表明，DNA结合结构域（DBD）中的突变也可能导致耐磷酸化（7, 8）。为了我们的知识，这是第一项研究表明影响STAT1的DBD的突变是两种无关的日本患者孢子CMC的遗传原因。由于在影响CC结构域的突变中，还涉及DatoPration的损伤，因此涉及Dat1功能的增益，如在影响CC结构域的突变中所观察到。

材料和方法

耐心

患者1是一个12岁的男孩，出生于非通用的健康日本父母。自2岁以来，他开发了严重和复发的口腔鹅口疮，并被诊断出CMC。他还具有复发性肺炎，支气管炎和中耳炎引起的 肺炎链球菌肺炎料 自3岁以来。胸部X射线和计算机断层扫描扫描证明了5岁岁的支气管扩张的存在。他被注意到具有阳性抗甲状腺刺激激素受体ABS的甲状腺功能减退症，并且在9岁时期开始左旋甲磺胺。

患者2是一个男孩出生于非通用的健康日本父母。他出生后不久，他的体重很差。他被诊断为6岁的CMC。他还具有复发性支气管炎，肺炎和鼻窦炎 S.肺炎。他被诊断出患有7岁的支气管扩张。在13岁的时候，他开发出血糖淋巴管激菌（HLH）。他随后呈现自身免疫性溶血性贫血，具有积极的直接和间接组织的试验和血小板减少症，并且被诊断为具有evans综合征。他突然在14岁突然死亡，5月份来自传播血管内凝血和未知病因的肺不足。这两名患者无关（准备案件报告）。

患者3是一个15岁的CMC女孩。她的父亲也被诊断出患有CMC并死于脑血管炎（9）。她被证明具有影响STAT1的CC领域的杂合R274Q突变。因为由于STAT1的去磷酸化受损，这种突变最近被报告为功能性突变（4），我们研究了患者3作为调查CMC在患者的发育机制1和2.在机构审查批准的议定书中从患者，家庭成员和正常管制获得遗传分析的知情同意北海道大学医院董事会。

产生EBV转化的细胞系

通过EBV（菌株B95-8）的体外转化，如别处所述（菌株B95-8）的体外转化产生EBV转化细胞系（EBV-LCLS）（10）。根据结果 stat1. 序列分析，具有T385M和野生型（WT）等位基因和具有R274Q和WT等位基因的患者1的EBV-LCL分别被称为T385m / WT和R274Q / WT。使用两种匹配的控制EBV-LCLS，指定为WT-1和WT-2，用作对照。未获得患者2的EBV-LCLS。

刺激试剂

对于刺激，1：1000稀释的重组人IFN-γ1a（Shionogi，Osaka，日本; 1000 JRU / ml，200ng / ml），1500 u / ml重组人IFN-α（BioSource International，Camarillo，CA），20 ng / ml IL-27（R&D Systems，使用明尼阿波利斯，Mn）和100μg/ ml Curdlan（Wako，Osaka，Japan）。

DNA分离，PCR和PCR产物和Topo-Ta克隆的序列分析

按照其他地方描述的方法进行这些程序（10）。

使用Cytric胎圈阵列测量单核细胞衍生的巨噬细胞和EBV-LCL上清液中的CXCl10（IP-10）浓度

为了通过研究巨噬细胞的上清液IP-10生产来准确评估Stat1功能，首先用CD14微珠（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Germany）从PBMC纯化单核细胞以避免污染其他细胞。总共5×105 然后通过在含有10％FBS的RPMI 1640中在5ng / ml M-CSF存在下培养7d细胞/ mL单核细胞在巨噬细胞中分化为巨噬细胞（R&D Systems）。为了确定IFN-γ的效果，未刺激三份的分化巨噬细胞，用1μg/ ml LPS（Sigma，ST路易斯，Mo）刺激，或用1000 u / ml（200ng / ml）IFN- γ（Shionogi）2小时，然后用1μg/ ml LPS刺激24小时（IFN-γ-LPS刺激），收获上清液，用于IP-10测量。从EBV-LCLS学习IP-10生产，1×106 将细胞/ mL EBV-LCLS在1000 u / ml IFN-γ存在下培养6小时。通过制造商的说明，用细胞术珠阵列（BD，San Diego，CA）测量上清液中IP-10的浓度。从一式三份独立实验的数据报告为平均值±SD。

核提取物的制备

如前所述，基本上制备核提取物（11）。简而言之，用Ca洗涤收获的细胞2+ 和 Mg2+ - 用1500×以离心造成的离心造成的PBS和造粒 g 在4°C下5分钟。将所得细胞粒料重悬于细胞质提取物缓冲液（10mM HEPES [pH 7.9]，10mM KCl，0.1mM EDTA，0.1mM EGTA，1mM DTT，1mM NA中3vo.4，1mM NAF [pH8]）加入推荐的溶解蛋白酶抑制剂混合物（Roche）。在冰上孵育15分钟后，加入1:16体积的10％Nonidet P-40。悬浮液被涡旋，然后以1500×离心 g 在4°C下5分钟。用没有非特性P-40的细胞质提取物缓冲液再次洗涤颗粒，重悬于核提取物缓冲液（20mM HEPES [pH 7.9]，400mM NaCl，1mM EDTA，1mM EGTA，1mM DTT，1mM NA3vo.4，加入蛋白酶抑制剂的1mM NAF [pH 8]），并在4℃下温育30分钟。在4℃下以最大速度离心5分钟后，将上清液作为核提取物保存。通过蛋白质测定（Bio-rad，Hercules，Ca）测量蛋白质浓度。

Western印迹分析

加入SDS样品缓冲液后，将10μg核提取物分离出7.5％聚丙烯酰胺凝胶，并转移到Imobilon-P转移膜（Millipore，Billerica，MA）中。反夹层a ab（生物政策，San Diego，CA）被用作核提取物的装载控制。所有主要ABS以1μg/ ml的最终浓度使用。 HRP缀合的抗小鼠IgG二次ABS（GE Healthcare，Buckinghamshire，U.K.）用于1：2000稀释。然后通过刺穿蛋白质印迹基板（Thermo，Rockford，IL）来可视化墨水。

Stat1磷酸化状态和Staurosporine和Pervanadate细胞的研究

我们评估了EBV-LCLS中酪氨酸激酶抑制剂Staurosporine的脱磷酸化。共1×106 cells/ml EBV-LCLs was stimulated with IFN-γ30分钟然后孵育1μM staurosporine (Alomone Labs, Jerusalem, Israel) for 15, 30, or 60 min. The phosphatase inhibitor pervanadate was prepared by mixing 200 mM sodium orthovanadate (Wako, Osaka, Japan) and 100 mM H2O2 在22°C时在2：1的比例为15分钟。 EBV-LCLS用普通酸酯（0.8mm Orthovanatate，0.2mm H处理2O2）5分钟，然后用IFN-γ刺激30分钟。对每个病症的核提取物进行SDS-PAGE。用从BD购买的抗人体Stat1（PY701）AB评估STAT1的磷酸化状态。然后用抗人Stat1（Bd）和抗塑料A（BD）剥离膜并再生（生物政策）ABS。

CD4中细胞内IL-17a表达的流式细胞术分析+ cells

PBMC的密度为1×106 在Golgistop（BD）存在下，用20ng / ml PMA加入6小时，用20ng / ml PMA加离子霉素刺激细胞/ mL。用PECY5缀合的抗人CD4 AB洗涤收获的PBMC并染色（生物政策）在4℃下20分钟。将细胞洗涤三次并用Cytofix / cytoperm溶液（Bd）固定并在4℃下渗透和透化。然后洗涤细胞，用PE缀合的抗人IL-17a温育30分钟（生物政策）或FitC缀合的抗人IFN-γABS（生物政策用FacScalibur（BD）洗涤并分析并分析。

结果

Stat1中可能的DBD突变

我们首先在患者中进行了对CMC负责的基因的直接序列分析： 艾莉, CLEC7A, CARD9, IL17RA, IL17F, IL2Rα， 和 stat1. (4–6, 12–17）。本研究表明，患者1和患者2具有相同的杂合碱变化 stat1. (c.1154C>T, p.T385M) (图。1A），通过TOPO-TA克隆的序列分析证实了（图。1B，数据未显示）。该碱基变化尚未以国家生物技术信息数据库，Ensembl数据库或单核苷酸多态性数据库的国家中心突变或作为单一核苷酸多态性，并且它不存在于患者1的家庭成员中（图1C.）或在108个正常健康对照（未显示数据）。此外，受影响的残留物进化地保守，如图所示 图。1D。多态性表型-2（Polyphen-2）算法（http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/index.shtml），一种基于结构序列的氨基酸替代预测方法，预测P.T385M可能损害，得分为1.000（灵敏度：0.00;特异性：1.00）。从容忍算法中分类（http://sift.jcvi.org/）还预测了这种氨基酸替换为有害。这些结果强烈表示C.1153C>t（p.t385m）是一种缺乏疾病引起的突变。患者1也被证明具有未报告的杂合碱变化 CARD9 (c.661G>a，p.k221e）。但是，在他的健康父亲（数据未显示）中也检测到这种基础变化。另外，来自患者1的PBMCs响应于β-的患者显示正常的IL-6产生d - 用Curdlan（未示出的数据）葡萄糖刺激，表明C.661G的基础变化>A, p.K221E in CARD9 不是引起疾病的突变，而是一种核苷酸多态性。研究的其余基因在两种患者中都证明是正常的。

图1。
图1。

患者1和2具有C.1153C的相同杂合碱变化>导致p.t385m stat1.。 （A）直接序列分析 stat1. 在患者1（PT1）和患者2（PT2）中的外显子14。向前序列显示。 （B）Topo-Ta克隆的序列分析 stat1. EXON 14 PCR产物在患者1.突变体和WT序列。 （C）直接序列分析 stat1. EXON 14在患者1家的家庭成员。 （D）STAT1在不同物种中的氨基酸序列的比较。红盒表示对应于人类的p.t385的氨基酸。控制。

T385M与STAT1功能的增益相关联

致功能突变 stat1. 最近被证明是常染色体占优势或散发性CMC的遗传原因（4–6）。报告的突变已经专门定位在CC域中，导致由于STAT1去磷酸化受损，导致STAT1功能（4）。研究是否为C.1153C的基础变化>T，影响STAT1的DBD的P.T385M还会导致STAT1功能的增益，研究IFN-γ刺激后的STAT1，IP-10的下游靶标的产生。来自患者1（T385M / WT）和患者3（R274Q / WT）的单核细胞衍生的巨噬细胞的IP-10产生显着高于IFN-γ-LPS刺激之后的匹配对照巨噬细胞（ 图2A）。 IP-10在IFN-γ刺激之后的患者1（T385M / WT）和患者3（R274Q / WT）的EBV-LCL中也显着高于ID-LCL（图。2B）。这些结果表明T385M是导致STAT1功能增益的突变。

图2。
图2。

T385M与IFN-之后的IP-10产量较高有关。γ stimulation in monocyte-derived macrophages and in EBV-LCLs. (A) Monocyte-derived macrophages were cultured in the presence of media, LPS, or IFN-γ–LPS 24小时。在上清液中研究了IP-10生产。显示的数据是卑鄙的± SD of triplicate independent experiments. (B) EBV-LCLs were stimulated with IFN-γ6小时，上清液中研究了IP-10生产。显示的数据是卑鄙的±三重独立实验的SD。 Con1，同时获得并分析患者1的控制; Con2，同时获得并分析患者3的控制; Pt1，患者1; Pt3，患者3; （−), media.

stat1. T385M leads to STAT1 hyperphosphorylation in response to IFN-γ, IFN-α, and IL-27 stimulation, which is due to impaired dephosphorylation

然后，我们在EBV-LCL中研究了Stat1磷酸化状态，以确定STAT1功能的增益机制。在IFN-γ刺激之后的磷酸化Stat1（Stat1P）蛋白的表达在T385M / WT和R274Q / WT EBV-LCl中较高，而不是在WT EBV-LCls中（图3A）。在用IFN-α和IL-27刺激后，还观察到STAT1的超磷酸化状态（图3B., 3C）。另外，T385M / WT和R274Q / WT EBV-LCls的核提取物中总Stat1的表达趋于高于WT EBV-LCls，特别是没有刺激（Fig. 3）。通过酪氨酸激酶抑制剂Staurosporine和Pervanadate的磷酸酶抑制剂，进一步探索Dat1超磷酸化机制。 IFN-γ-活化的T385M / WT EBV-LCLS的脱磷酸化在Staurosporine存在下损害，如在R274Q / WT EBV-LCLS中所观察到的（图4A）。相比之下，随着Pervanadate治疗，T385M / WT EBV-LCLS中Stat1的磷酸化类似于WT EBV-LCLS（图4B.）。因此，在T385M / WT EBV-LCl中的统计数据1超磷酸化的机制涉及STAT1的失磷酸化，如R274Q / WT EBV-LCls所观察到的。

图3。
图3。

T385M与IFN-的STAT1的超磷酸化有关，响应IFN-γ, IFN-α，和IL-27刺激。进行EBV-LCLS核提取物的STAT1P蛋白质印迹分析。 Lamin A被用作装载控制。 IFN- eBV-LCL中的STAT1P表达式γ (A），IFN-α（B）或IL-27（C）刺激30分钟。 （ - ），没有刺激。

图4。
图4。

由于损害的去磷酸化，T385M与Stat1的超磷酸化有关。 （A) STAT1p expression in EBV-LCLs stimulated with IFN-γ30分钟然后孵育1μM staurosporine for 15, 30, or 60 min. (B）EBV-LCL中的STAT1P表达用普通酸盐处理5分钟，然后用IFN-γ刺激30分钟。

患者1具有杂合T385m突变在Stat1中具有缺陷的Th17细胞

记录了Th17细胞的缺乏发育，与CMC的发展有关。 CMC患者具有功能性突变 stat1. 影响CC域已经显示出这个缺陷（4）。因此，我们研究了CD4的比例+IL-17A+ 细胞 among CD4+ PMA患者在PMA加离子霉素刺激6小时后细胞6小时。我们还研究了CD4的人口+IFN-γ.+ 细胞评估Th1发育。患者1具有杂合的T385m / wt突变 stat1. 可重复地证明已大幅减少CD4+IL-17A+ 细胞 (0.2% of CD4+ 细胞）和患者3具有杂合R274Q突变的患者显着降低，但稍高，CD4+IL-17A+ 细胞 (0.7% of CD4+ cells) (Fig. 5）。这 p 使用Mann-Whitney估计的价值 U 对照组和两名患者之间的测试是0.039。相比之下，患者和对照都有可比的CD4百分比+IFN-γ.+ 细胞 (Fig. 5）。

图5。
图5。

患者1和3缺乏CD4+IL-17A+ 细胞 but normal CD4+IFN-γ.+ 细胞响应于PMA加离子霉素刺激。 （A“PMA加离子霉素”刺激6小时内PMA加离子霉素刺激后细胞内IL-17A表达的流式细胞术分析。 CD4的比例+IL-17A+ 细胞 among CD4+ 细胞 was shown. (B）CD4的比例+IL-17A+ 细胞 and CD4+IFN-γ.+ 细胞 among CD4+ 正常对照和患者的细胞。水平线表示CD4的平均比例+IL-17A+ 细胞 or CD4+IFN-γ.+ 对照中的细胞。红色和蓝色圆圈表示同时获得和分析的对照，分别与患者1和3同时。这 p 使用Mann-Whitney估计价值 U 测试。 Con1，同时获得并分析患者1的控制; Con2和Con3，同时获得并分析的患者3的控制; Pt1，患者1; Pt3，患者3。

讨论

据我们所知，这项研究表明，第一次表达了C.1153C的Novo杂合突变>在外显子14（P.T385M）中，影响DET1的DBD，是两种无关的日本患者中孢子CMC的遗传原因。由于在CC域突变中观察到，因此潜在机制涉及Dat1功能的增益，如在CC结构域突变中所观察到的（4）。

近期对STAT1分子的广泛研究揭示了影响DBD的突变与STAT1功能的增益之间的关联。基于晶体分析，Darnell的组（7, 8）提出了在离开DNA之后将磷酸化的“平行”STAT1二聚体的重新定向的模型，其允许CC结构域的互敏关系和DBD的用于去磷酸化的袋残余物。它们进一步证明了直接诱变实验，即DBD，Q340A或Q340W，G384A或G384W，G384A或G384W和Q408A或Q408W的捕获残基的突变导致STAT1的去磷酸化受损（8）。 T385，在我们两个患者中改变的氨基酸的事实是进化地保守的并且定位在袋残余物G384旁边，可以表明它在与CC结构域的互敏关系中也是至关重要的，以稳定反平行结构和去磷酸化。该DBD的这种突变也可能导致与DNA的解离，这也可能导致DET1分子的去磷酸化抗性。来自T385M / WT和R274Q / WT EBV-LCLs的核提取物中核提取物的总体1的表达可能反映由于抗突变体STAT1分子的抗磷酸化抗性导致的核导出损失（18），尽管在本研究中未确定确切机制。

考虑到具有大量患者的患者，可能有更多患有CMC的CMC患者携带函数突变的突变 stat1. 来自世界各地的突变（4–6）。另外，结晶分析和诱变研究表明，N-末端结构域（AA 1-130）中的突变也导致持续磷酸化（7, 8）。这表明影响N-末端结构域的突变也可以是CMC的遗传原因。

我们证明了Th17细胞缺乏（CD4的0.2％+ 患者1中的杂合子T385m突变，其与患者3中观察到的杂合R274Q突变相似或更严重（0.7％CD4 + 细胞）。 Th17细胞的缺乏发育可以解释增加的易感性 念珠菌 感染。 IFN-γ，IFN-α和IL-27是通过小鼠和/或人类的Dat1（19–21）。因此，响应于我们患者观察到的IFN-γ，IFN-α或IL-27的ID1功能的增益可能与Th17细胞发育有关。然而，仍然可以确定Stat1功能的增益如何导致缺陷Th17细胞。

目前尚不清楚DBD突变患者与CC结构域突变之间的临床频谱或疾病的严重程度是否存在差异。值得注意的是，两名患有T385M的DBD突变的患者在他们的早期幼儿时期发育支气管扩张，其中一个最终开发了HLH;这些患者患有CC结构域突变的患者尚未描述。

关于HLH，最近显示抗IFN-γB的给药在人遗传性HLH的两个小鼠模型中具有治疗效果：穿孔素缺陷和RAB27A缺陷小鼠（22）。对结果的仔细评估表明T385M可以与响应各种刺激的STAT1P的更高表达相关联（Fig. 3）。因此，具有T385M的DBD突变的CMC患者可以更容易受到可能与增强的IFN-γ-Stat1信号相关的条件，例如HLH。应进行对这两个群体的临床谱的详细研究。

披露

作者没有财务利益冲突。

致谢

我们感谢D.M.斯图尔特（新陈代谢分公司，国家癌症研究所，国家卫生学院，贝塞斯达，MD）用于审查这项研究的稿件，患者及其家庭，以及H.Kanegane博士（医学研究生院儿科，富山大学，富山，日本协调患者招聘。

脚注

  • 这项工作是部分支持的，授予日本卫生部，劳工和福利和北海道大学前沿基金会的难治性疾病研究。

  • 本文中使用的缩写：

    CC.
    卷绕线圈
    CMC.
    慢性霉菌念珠菌病
    达德
    DNA结合结构域
    HLH.
    血小杂性淋巴管激菌症
    stat1.p
    磷酸化的Stat1
    WT.
    野生型。

  • 已收到 2012年3月28日。
  • 公认 2012年5月25日。

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