
抽象的
许多昆虫依赖于共生细菌的存在,用于适当的免疫系统功能。然而,利于这种现象的分子机制尚不清楚。成人收藏苍蝇(光盘 SPP。)房子三个共生细菌,在这种昆虫独特的viviparous繁殖模式中,在母亲到后代垂直传播。幼虫在缺乏普及共生主义的情况下经历宫内发展,Wigglesworthia...,在成年期间表现出受损的免疫系统。在这项研究中,我们表征了在没有所有内源性共生微生物的情况下发展的TSetse的免疫表型。亚太怀孕收藏(光盘 morsitans morsitans [GMM.apo.])存在严重受损的免疫系统,其特征在于没有吞噬血细胞的血小细胞和免疫相关基因的非典型表达。相应地,这些苍蝇迅速屈服于对通常不管的感染大肠杆菌。展示的敏感表型GMM.apo.当在感染之前,成年人可以在接受从野生型供体苍蝇移植的血细胞时逆转。此外,免疫系统开发过程可以在宫内恢复GMM.apo.当他们的母亲喂食饮食时幼虫Wigglesworthia...细胞提取物。我们发现分子组分Wigglesworthia...TSetse内的显着免疫刺激活性代表了一种新的进化适应,使得与其宿主坚定地联系起来的贫民区。
所有美氮菜生活都与过核生物相互作用。这些关联通常导致涉及的一个或两个合作伙伴的健身优势(1, 2)。昆虫代表一组患有明确明确的细菌微生物群的高等真核生物。与他们的哺乳动物同行不同,昆虫房屋不太复杂的细菌社区,保持相对便宜的维护,并在短时间内产生大量的后代。几项研究表明了共生细菌的重要性,因为它们与昆虫宿主免疫系统的适当功能有关。例如, 果蝇 自然感染了 Wolbachia. 从几种其他有害的RNA病毒中受到保护(通过未知机制)(3)。疟疾矢量 anopheles gambiae. 对感染异常易受感染 疟原虫 当他们缺乏共谋微生物群时寄生虫。在这种情况下,共生细菌似乎介导反疟原虫 通过激活抗微生物肽(AMPS)的基础表达,诱导吞噬粒细胞的产生,直接产生抗疟活性氧物质(4–6)。
tsetse苍蝇(光盘 SPP。)涉及三个共生细菌,规范其宿主生理的重要方面。其中两个微生物,义务 Wigglesworthia... 和共同 索索里斯,通过产妇乳腺分泌物转移到发展宫内后代(7)。 tsetse的第三个symbiont, Wolbachia.,通过种系转移(8)。在没有的情况下接受宫内幼虫发展的收集 Wigglesworthia... 在成年期间是免疫功能。这种表型的特征在于显着减少的吞噬无粒细胞和循环血细胞的群体,以及对致病性锥虫感染的不寻常易感性,通常是非血管生成的 大肠杆菌 K12 (9–11)。进一步研究TSETSE /Wigglesworthia... 与宿主免疫有关的共生,由于我们无法将与这种细菌的嗜好无效重建的yssbiont无效地阻碍。
在目前的研究中,我们通过在没有所有内源性微生物的情况下产生幼虫发育的苍蝇来调查TSETSE中的免疫和共生之间的亲密关系。我们分析了亚非生物收集的免疫系统表型(光盘 morsitans morsitans; [GMM.apo.]除了微生物挑战后,并研究了是否丧失免疫力 GMM.apo. 可以通过免疫细胞的转移来自健康个体或Symbiont供应来拯救苍蝇。我们获得了加强Tsetse与之关系的义务性质的结果 Wigglesworthia... 并提供进一步的见解,进入基本的分子机制,使宿主免疫的共同成熟。
材料和方法
tsetse和细菌
G。 Morsitans Morsitans. 在24°C下在耶鲁昆虫中维持,具有50-55%的相对湿度。这些苍蝇通过人工膜馈送系统每48小时接受了血液血液(止血实验室)(12)。本研究中使用的所有Tsetse队列的名称,它们的共生群体的组成以及他们收到的治疗方法 表I..
荧光素酶表达 大肠杆菌 (rec大肠杆菌pil)通过用构建体的转化产生K12,其在转录控制下编码萤火虫荧光素酶基因 索索里斯'胰岛素酶促启动子(13)。用于量化Rec的测定大肠杆菌pil 如前所述进行体内细胞(13)。表达GFP. 大肠杆菌 K12 (rec大肠杆菌GFP.)通过用PGFP-UV质粒DNA(CLONTECH)电穿孔产生。 索索里斯 从表面灭菌中分离出来 G。 Morsitans. 蛹和培养 Aedes Albopictus. 如前所述的C6 / 36细胞(14)。 索索里斯随后在体外维持在体外,在Mitsuhashi-Maramorosch培养基中的25℃下,在体外保持〜24小时的倍增时间(1mm CaCl)2,0.2 mm mgcl2,2.7 mm KCl,120毫米NaCl,1.4毫米Nahco3,1.3毫米2宝4,22 mm d(+)葡萄糖,6.5g / l乳白蛋白水解产物,5.0g / l酵母提取物)补充有5%的热灭活FBS(14)。
tsetse感染
通过与CO的麻醉苍蝇麻醉苍蝇实现了TSETSE的系统挑战2 随后使用玻璃针和Narashige IM300微内注射器用活细菌细胞注入个体。每种细菌挑战都是通过加入500 CFU进行的 大肠杆菌 每20μL(飞行量的近似数量)总血粕。脊椎动物宿主补体系统在接种用细菌细胞接种血浆之前在热灭活(56°C)。在相应的数字及其传说中指示注入或喂食或喂养,对照组指定和样品大小的细菌细胞数目。
血淋巴收集和血细胞量化
野生型血淋巴收集 G。 Morsitans Morsitans. (GMM.WT.) 和 GMM.apo. 使用高注射/恢复方法进行苍蝇,如前所述(15)。随后使用明亮线血细胞计数进行循环血液细胞丰度的后续测定(11)。通过受到主观性量化的术式血液细胞丰富 GMM.WT. 和 GMM.apo. flies (n = 3)与蓝色荧光微球的血液尿液注射。 Postign注释十二小时,苍蝇被解剖以揭示Tsetse的背部血管(DV)。将暴露的组织用PBS冲洗三次,以除去污染的循环血细胞或未被无梗塞血细胞吞噬的任何珠粒。通过紫外线(365/415nm)激发,通过激发显微镜地显示吞噬珠。使用imagej软件量化的相对荧光表示从三个发出的平均光量 GMM.WT. 和 GMM.apo. individuals.
免疫相关基因表达的定量分析
对于免疫相关基因表达的定量实时PCR(QPCR)分析,将整个苍蝇在液氮中均化,并且使用Trizol试剂(Invitrogen)提取总RNA。用上标II逆转录酶(Invitrogen)产生随机引发的CDNA,使用SYBR绿色超混合物和BIO-RAD C1000热循环仪进行QPCR分析。扩增引物列于补充表I中。在三本生物样品上进行定量测量,并且结果相对于Tsetse的组成表达标准化 β-小管蛋白 基因(从每个相应的样品确定)。折叠变化数据表示为相对于相应未感染的对照中的表达水平的细菌感染苍蝇中平均归一化基因表达水平的分数。值表示平均值±SEM。
血淋巴移植
通过在最靠近胸部的接头处移除一个前翼腿然后将温和压力施加到腹部的远端尖端来收集未稀释的血淋巴。使用玻璃微纤维收集从伤口渗出的血淋巴,并置于冰上的微型管中。使用了四个新出现的亚脱酶受体苍蝇苍蝇,其中两个被指定 GMM.apo./WT 或者 GMM.apo./Apo 基于它们是否接受了从野生型(WT)或亚脱蛋白供体移植的血淋巴。 GMM.apo./WT 或者 GMM.apo./Apo 受体苍蝇接受1μl供体血淋巴(该体积表示从供体苍蝇收集的总体积的大约三分之一)。在第8天持续后,牺牲了三种苍蝇中的三个,以使用明亮线血细胞计计量化血细胞数。分离 GMM.WT. 供体血淋巴进入可溶性和细胞级分,样品以3000×离心 g 5分钟。将细胞组分重新悬浮在一定体积的冷却抗凝血缓冲液(70%Mitsuhashi-Maramorosch培养基中,30%抗凝血剂柠檬酸盐缓冲液[98mM NaOH,186mM NaCl,1.7mM EDTA和41mM柠檬酸(pH 4.5)v / v ])(15)等于它们收集的血淋巴总量。剩下的两个队列 GMM.apo. 用1μL细胞悬浮液注射受体苍蝇(这些苍蝇指定 GMM.apo./Cell)或1μl可溶性血淋巴部分(这些苍蝇被指定 GMM.apo./Sol)。
所有亚太怀孕受体苍蝇都挑战了10个3 CFU live rec大肠杆菌pil 或者 rec大肠杆菌GFP.。使用玻璃针和Narashige IM300微内注射器进行注射。录制的量化大肠杆菌pil 在接收者中,如上所述进行。通过感染测定移植血细胞的吞噬能力 GMM.apo./Apo 收件人用103 CFU live rec大肠杆菌GFP.。 PostChallenge 12小时,从三个个体中收集血淋巴,监测血细胞用于表达吞噬的GFP的细菌细胞。通过在2%多聚甲醛中通过2分钟孵育在玻璃显微镜上固定血淋巴样品。在使用Zeiss AxioScope显微镜可视化之前,载玻片覆盖着含有DAPI(矢量实验室)的Vectashield Hardset安装介质。
细菌互补实验
一种动画片,说明了如何进行细菌补体实验,如补充图1.三个队列(n = 120个单独/组)怀孕女性Tsetse每隔一天喂养含有四环素(40μg/ ml血液)的饮食10天。此外,在整个实验过程中,所有血粉(三/红)也含有维生素的酵母提取物(1%w / v),以恢复与缺失相关的生育能力 Wigglesworthia... (16)。介绍10天,定期喂养了两次Symbiont固化的女性队列的陪审团 Wigglesworthia... 和 索索里斯 细胞提取物。通过以这种方式进行定时处理,来自第一天气萎缩循环(GC)的幼虫在没有细菌补充的情况下经历了大部分发展,而来自第二和第三GCS的那些在细菌补充的情况下产生的。这些女性的后代被指定为 GMM.apo./WGM. 和 GMM.apo./SGM., 分别。 Wigglesworthia... 通过解剖Tsetse细菌(紧邻含有这种细菌的中间肠的器官)获得 GMM.WT. 女性,而是 索索里斯 如上所述,维持在培养中。 GMM.apo./WGM. 雌性每四名女性喂养一只菌药相当,和 GMM.apo./SGM. 女性被喂食4×107 索索里斯/ ml血液(因此,这些苍蝇摄入~1×106 索索里斯 每次他们喂食)。第三次控制综合症腌制的女性未接受任何细菌补充(他们的后代被指定 GMM.apo./NB)和第四次WT后代(GMM.WT.)作为另一个控制。为了确认来自Symbiont固化的母亲(补充图2)的后代后代的亚脱酸状态,从幼虫后代提取基因组DNA(第三龄; n 使用Holmes-Bonner方法的所有实验群体(17)。在MJ研究热循环仪中使用细菌特异性引物(补充表I)和以下循环程序中的PCR(20-μL反应),下列循环程序:95℃5分钟,然后在95,55和72°处进行30个循环C,每一个持续1分钟,72℃下最终的7分钟伸长/延伸。
为了确定与细菌细胞提取物的补充合酶治愈的母亲是否影响其后代的免疫系统表型,使用QPCR(如上所述)来监测表达 蛇 和 菱形 在来自三个GCS中的每一个的幼虫(第一,第二和第三龄)(n = 3个个人/组/ GC)。所有剩余的后代都被允许成熟到成年期。此时,采取来自每个群组和GC的三种以确定循环血液细胞丰度(如上所述)。此外,用于比较免疫相关基因表达的qPCR 大肠杆菌 - 挑战 GMM.apo./WGM. 和 GMM.apo./SGM. individuals (n 来自Symbiont治愈母亲的第二个GC的= 3)。最后,所有剩余的成熟成年后代都受到10个挑战3 CFU live rec大肠杆菌GFP.。 PostChallenge 12小时,收集并监测血淋巴,以确定血细胞是否已吞噬GFP表达的细菌细胞(n = 3个个人/组/ GC)。如上所述固定和可视化血淋巴样品。
统计数据
各种治疗和治疗和对照中的统计学显着性在图中表明。使用JMP(v9.0)软件的日志秩分析进行生存曲线比较(http://www.jmp.com)。 QPCR数据和血液细胞丰富的统计分析由学生进行 t 使用Microsoft Excel软件进行测试。
结果
apo.symbiotic tsetse exhibit atypical hallmarks of cellular and humoral immunity
昆虫免疫系统的适当功能与微生物组的动力学之间存在正相关( 18)。为了更好地定义TSetse中的共生和免疫关系之间的关系,我们喂食孕妇患有四环素和酵母的饮食。这种抗生素处理清除了苍蝇的所有共生,而维生素的酵母提取物救出与缺乏义务相关的生育丧失 Wigglesworthia... (9, 16)。然后我们调查了在没有所有共生细菌的情况下进行宫内发育的后代(GMM.apo.)在成年期间在成年期间表现出免疫系统表型,其与其完全微生物组存在的WT对应部分不同。为此,我们开始通过量化8-D-LAND成人(以下称为“成熟”)的循环和术血细胞的数量 GMM.WT. 和 GMM.apo. 苍蝇。我们的结果表明,成熟的WT TSESE港口113倍,循环血细胞/μl血小秋仅仅是它们的暂性对应物(GMM.WT.,793±34血细胞/μl血淋巴; GMM.apo.,7±1血细胞/μl血淋巴; 图。1A)。为了确定Symbiont状态和术式血液细胞丰富的功能关系,我们透过透镜微内注射了WT和亚磷酸酯的荧光微球。在tsetse和 果蝇,无牙血细胞浓缩在飞行的前房周围的大量大量(11, 19)。因此,我们通过测量发现在该区域吞噬的注射微球的荧光发射来间接定量术式血细胞数。我们观察到这一点 GMM.WT. 苍蝇比年龄匹配更多的微球吞噬16倍 GMM.apo. individuals (图。1B,补充图3)。
apo.symbiotic tsetse display atypical hallmarks of cellular and humoral immunity. (A)成熟的循环血细胞/μl血细胞的数量 GMM.WT. 和 GMM.apo. flies (n =来自每个TSetse线的3个个人)。 (B)与成熟DV的前房相邻的术骨细胞丰度的定量分析 GMM.WT. 和 GMM.apo. flies (n =来自每个TSetse线的3个个人)。相对荧光与由无梗塞血细胞吞噬的微球的数量成比例,因此,所检查区域存在的这些细胞的数量。 (Csymbiont状态和感染途径对所选免疫相关基因表达的影响。未感染的基因表达 GMM.apo. 和 GMM.WT. 个人相对于组成思考的TSESE是标准化的 β-小管蛋白 (左侧面板)。折叠在免疫相关基因表达中的变化 GMM.apo. 和 GMM.WT. 每次操作系统后,TSETSE 3 D(中间伙计)胃内(右侧面板)挑战 大肠杆菌 K12。所有折叠变化值都表示为相对于PBS注射对照中的表达水平的细菌攻击恒定的平均归一化基因表达水平的一小部分。所有定量测量均以两份的三份生物样品进行。没有相应的棒的基因未表现出样品之间表达的倍数变化,或者通过QPCR未检测到它们的表达。将值作为手段呈现。 *p < 0.05, **p < 0.005, Student t test.
以前,我们确定了几种与体液,细胞和上皮免疫途径相关的基因,包括编码AMPS Attacin和Cecropin的那些,以及含硫酸酯的蛋白质(TEPS)TEP2和TEP 4,PROPHENOLOXIC酶,以及诱导的没有合成酶( Inos),在显着较低的水平下表达 GMM.WGM.− 苍蝇与之相比 GMM.WT. 感染后苍蝇 大肠杆菌 (11)。在目前的研究中,我们在年龄匹配中监测了这些相同基因的表达 GMM.WT. 和 GMM.apo. 苍蝇或3 d后期(DPC)的苍蝇 大肠杆菌 K12。此外,我们还评估了表达式 PGRP-LB., 尾, 无国产, 和 DUOX.。在Tsetse和密切相关 果蝇,PGRP-LB和尾部用作NF-κB依赖性抗微生物肽表达的负调节剂(10, 20, 21),而无论如何是一种调节表达的细胞因子受体 TEP.4 通过jak / stat-signaling路径(22, 23)。最后,在 果蝇 和蚊子,Duox参与产生感染诱导的抗微生物反应性氧物质(24–26)。
我们的表达分析表明,幼虫发育过程中的共生细菌存在诱导TSETSE中的基础免疫。具体来说,我们观察到这一点 DUOX., 无国产, 和 尾 在成熟的情况下表达明显较低的水平 GMM.apo. 苍蝇与之相比 GMM.WT. flies (图1C., 左侧面板)。每次操作系统挑战 大肠杆菌,免疫相关基因表达没有显着差异(除了 伊克斯)观察到 GMM.WT. 和 GMM.apo. flies (图1C., 中间伙计)。然而,全身挑战导致我们分析的所有基因表达的显着差异。最值得注意的是,与细胞免疫相关的途径显着下调 GMM.apo. 个人比较 GMM.WT. 个体,而与体液免疫反应相关的人显着上调(图1C., 右侧面板)。这些发现表明,TSetse的共生细菌与幼虫成熟期间其宿主免疫系统的发展密切相关,并在未经充电的情况下进行其随后的功能 大肠杆菌 - 挑战成年人。
apo.symbiotic tsetse are highly susceptible to normally nonpathogenic 大肠杆菌
我们接下来决定了是否 GMM.apo. 个人更容易挑战 大肠杆菌 而不是wt tsetse或tsetse缺乏 Wigglesworthia... (GMM.WGM.−)。为此,我们将成熟成年人的生存百分比与这三条TSetse系列相比,在全身挑战之后 大肠杆菌 K12。我们确定了67%的成熟 GMM.WT. 个人和成熟的59% GMM.WGM.− 个人幸存了10岁的系统性挑战3 cfu 大肠杆菌 (图2A, 最佳 和 中间板)。相比之下,所有年龄符合匹配的 GMM.apo. 12 dpc丧失的人(图2A, 底部面板)。我们接下来有挑战性 GMM.WT. 和 GMM.apo. flies per os with 103 和 106 cfu 大肠杆菌 发现所有人都幸存了这一挑战(图2A, 最佳 和 底板)。这一发现表明成熟 GMM.apo. 苍蝇与外来微生物的全身挑战更容易受到年龄匹配的全身挑战 GMM.WT. 和 GMM.WGM.− 个人。此外,Tsetse克服每个OS挑战的能力 大肠杆菌 似乎与symbiont状态无关。
Symbiont状态调解Tsetse’s ability to survive challenge with 大肠杆菌 K12. (A)Symbiont状态对系统性和每个OS挑战后的TSetse生存的影响 大肠杆菌 K12。成人成熟 GMM.apo. 苍蝇显着易于攻击103 cfu 大肠杆菌 比年龄匹配 GMM.WT. flies (底部 和 顶面板, p < 0.001) and GMM.WGM.− flies (底部 和 中间板, p < 0.001). Both GMM.WT. 和 GMM.apo. 苍蝇在每个OS挑战中存活 大肠杆菌。使用25次苍蝇/复制,一式三份进行感染实验。 (B)REC的平均数(±SEM)大肠杆菌pil 每次收集队列随着时间的推移(n = 3个个人/队列/时间点)在系统性和每个OS挑战之后,103 细菌的CFU。灰色显示的值代表致命感染。到8 dpc,不够 大肠杆菌 - 反射 GMM.apo. 苍蝇保持量化细菌密度。
确定我们观察到的生存变异的原因 GMM.WT., GMM.WGM-, 和 GMM.apo. 挑战后的个人 大肠杆菌,我们随着时间的推移监测了这些飞行组中的每组中的细菌生长的动态。美联储时 大肠杆菌,两种成熟的亚脱基因和WT个体清除了所有 大肠杆菌。以下10个系统挑战3 cfu 大肠杆菌,成熟中的细菌密度 GMM.WT. 苍蝇达到8.3×103 细胞在被清除之前。有趣的是, GMM.WGM.− 苍蝇,在10次挑战后灭亡6 cfu 大肠杆菌 (11),能够在这种较低剂量攻击后清除所有外源细菌细胞。相比之下,细菌密度 GMM.apo. 苍蝇在7.8×10达到峰值6 在第6天的后期后,所有苍蝇很快就会被捕(图。2B)。该观察结果表明,亚育症TSESE无法控制全身感染 大肠杆菌 因此,可能因其无法耐受这种细菌在其血淋巴中的高密度而受到灭亡。占据了这些发现表明 GMM.apo. 苍蝇明显更容易受到挑战 大肠杆菌 而不是wt飞行,缺乏缺乏 Wigglesworthia....
来自WT TSetse的血细胞转移恢复GMM的能力apo. 成年人克服感染 大肠杆菌
接下来我们列出了TSetse血细胞与飞行能力与外来微生物克服攻击之间的最终相关性。为此,我们将血淋巴从成熟中移植 GMM.WT. 和 GMM.apo. 个人(供体苍蝇)进入敏感的血管 GMM.apo. 苍蝇(接受者苍蝇正在指定 GMM.apo./WT 和 GMM.apo./Apo, 分别)。此程序后五天,我们确定了 GMM.apo./WT 苍蝇覆盖330±20.4血细胞/μl血淋巴,而 GMM.apo./Apo 苍蝇患有5±3.8血细胞/μl血淋巴(图3A)。我们接下来研究了我们的血淋巴移植程序是否能够拯救 大肠杆菌-USCELIBLE表型展示 GMM.apo. 苍蝇。为此,我们挑战了 GMM.apo./WT 和 GMM.apo./Apo individuals with 103 cfu 大肠杆菌 3 D Posthemolymph移植,随后随后监测它们随时间的存活率。我们的结果表明72%的 GMM.apo./WT 在挑战下,苍蝇幸存下来。相比之下,只有2% GMM.apo./Apo 苍蝇幸存了他们的挑战(图3B., 顶面板)。这些结果表明了 GMM.apo. 苍蝇能够清除系统挑战 大肠杆菌 在他们接受来自WT供体的血淋巴移植后。
血细胞调节tsetse.’s ability to overcome challenge with 大肠杆菌 K12. (A)收集血淋巴 GMM.apo. 和 GMM.WT. 供体苍蝇并立即移植到 GMM.apo. 收件人。五天泡泡蛇移植,血液细胞丰富 GMM.apo./WT 和 GMM.apo./Apo 通过使用血细胞计数计显微化,使受体苍蝇进行显微镜。 GMM.apo./WT 苍蝇含有比循环血细胞更高 GMM.apo./Apo flies. (B) GMM.apo./WT 和 GMM.apo./Apo 接受者苍蝇受到挑战 大肠杆菌 接受血淋巴移植后3 d。更多更多 GMM.apo./WT 个人幸存下来 大肠杆菌 挑战而不是他们的 GMM.apo./Apo counterparts (顶面板, p <0.001)。然后将供体血对血淋巴分成细胞和可溶性级分。更多更多 GMM.apo./Cell 个人幸存下来 大肠杆菌 挑战而不是他们的 GMM.apo./Sol counterparts (底部面板, p < 0.001). (C)REC的平均数(±SEM)大肠杆菌pil 每 GMM.apo./WT 和 GMM.apo./Apo 收件人随着时间的推移而飞(n = 3个个人/治疗/时间点)后系统挑战103 细菌的CFU。灰色显示的值代表致命感染。 (D)PostChallenge 12小时大肠杆菌GFP.,收集血淋巴,固定在使用2%多聚甲醛的玻璃载玻片上,并在存在血细胞吞噬细菌细胞的情况下进行显微镜检查。 GMM.apo./WT 受体飞行港口吞噬细菌细胞。原始放大倍率×400。 **p < 0.005.
接下来研究了移植血淋巴中存在的血细胞或可溶性抗菌或信号分子是否负责恢复受体中呈递呈现的抗性表型。为了解决这个问题,我们从WT供体中收集血淋巴,通过离心将其分解成可溶性和细胞级分,然后将单独的部分移植成两个不同的组 GMM.apo. 苍蝇。最后,3 d以后我们系统性地挑战两组接受者苍蝇103 cfu 大肠杆菌 K12。所有亚脱鸡苍蝇都接受了来自血淋巴的可溶性分数 GMM.WT. donors (GMM.apo./Sol)在第12天的发作前丧生。相比之下,62%的 GMM.apo. 接受血淋巴细胞分数的接受者 GMM.WT. donors (GMM.apo./Cell)在细菌挑战之后存活14 d(图3B., 底部面板)。这些宿主生存曲线表示 GMM.apo. 苍蝇在挑战中幸免于难 大肠杆菌 当他们之前接受血细胞的移植时,与WT tsetse相反的话,而不是可溶性血淋巴分子。
为了确定我们在这两组之间观察到的存活率的变异的原因,我们在实验过程中监测了每组细菌生长的动态。 大肠杆菌 内 GMM.apo./Apo 逐渐复制,直到峰值密度为2.1×107 已达到6 DPC。这种发现表明细菌败血症是我们在这组苍蝇中观察到的高死亡的原因。相比之下,亚太自杀受者能够清除所有 大肠杆菌 当他们以前接受血淋巴移植时,通过8 dpc GMM.WT. donors (图3C.)。更多,显微镜检查血淋巴 GMM.apo./WT 苍蝇表明移植的血细胞吞没介绍 大肠杆菌 (图。3D)。我们的结果表明,如果他们港口从其WT对应物移植的血细胞,可以在成人亚癫痫发作中恢复免疫抗性。
补充 Wigglesworthia... 融合了雌性的女性在亚非生物后代恢复免疫系统发展
以前的实验表明,TSETSE的牛奶腺群体的牛奶腺群体的牛奶腺体 Wigglesworthia...,必须在发生未成熟的成人的未成熟阶段的开发期间表现出函数细胞免疫系统(11)。我们没有能够文化 Wigglesworthia... 因此,不能用这种细菌重新调整亚脱蛋白苍蝇。为了避难这种障碍,我们测试了我们是否可以恢复免疫系统发展的过程 GMM.apo. 通过补充孕妇的饮食,融合的女性的后代 Wigglesworthia... - 从WT女性收集的细菌组织的提取物。详细描述了我们用于测试该理论的实验设计 材料和方法 和补充图1。
简而言之,怀孕的两个治疗队列 GMM.WT. 女性被喂养补充有四环素和酵母提取物的饮食(16)。十天后,这些共生治疗的女性开始接受 Wigglesworthia... 或者 索索里斯 每张血液中的细胞提取物。来自这些女性后代的免疫系统表型(GMM.apo./WGM. 和 GMM.apo./SGM.分别比较来自Symbiont固化母亲的对照队员后代的对照组(GMM.apo./NB)来自的后代 GMM.WT. 母亲。我们首先评估编码转录因子蛇和锭剂的相对丰富的转录物。在 果蝇,这些分子直接血细胞分化,或血液缺陷,在胚胎发生和早期幼虫病(27)。在Tsetse中,在没有的情况下发展的幼虫 Wigglesworthia... 表达明显少 蛇 和 菱形 而不是他们的wt同行(11)。在目前的研究中,我们发现了 GMM.apo./WGM., GMM.apo./SGM., 和 GMM.apo./NB 来自第一个GC的幼虫显着较低 蛇 和 菱形 而不是 GMM.WT. 幼虫。但是,在细菌补充发生后, GMM.apo./WGM. 和 GMM.WT. 来自第二和第三个GCS的幼虫表达了相当的水平 蛇 和 菱形, 然而 GMM.apo./NB 和 GMM.apo./SGM. 幼虫表达较少(图4A)。
膳食补充 Wigglesworthia... 细胞提取物与Symbiont治愈的女性TSetse在其亚致症后代中的免疫系统发育诱导。提供了三组怀孕的女性收集,提供了四份抗生素四环素,以清除它们的所有内源性微生物群。这些共生治愈的女性的两位队列然后收到了补充的饮食 Wigglesworthia... 或者 索索里斯 细胞提取物以补充这些细菌的不存在。第三组Symbiont治愈的女性没有细菌补充。最后,第四组WT雌性没有接受四环素或细菌互补。这些女性的后代,被指定了 GMM.apo./WGM., GMM.apo./SGM., GMM.apo./NB, 和 GMM.WT.分别从三个GCS收集并随后监测以确定其免疫系统表型。 GC1以灰色表示,表示细菌补充 GMM.apo./WGM. 和 GMM.apo./SGM. 母亲开始在他们的第一个幼虫后代完全发展之后。 (A)在幼虫后代进行QPCR(n = 3幼虫/队列/ GC)以确定它们的水平 蛇 和 菱形 expression. (B)在成人后代循环血液细胞丰富(n = 3蝇/芯/ GC)使用明亮线血细胞计数定量定量定量。在(a)和(b)中,具有不同字母的条形表示统计学上显着差异(p <样品之间0.05)。 (C)折叠与免疫相关基因表达的变化 GMM.apo./WGM. 和 GMM.apo./SGM. 成年人挑战了 大肠杆菌。用于该实验的成人苍蝇来自Symbiont治愈母亲的第二个GC。所有折叠变化值都表示为相对于PBS注射对照中的表达水平的细菌攻击性恒定的平均归一化基因表达水平的一小部分。没有相应的棒的基因未在比较样品之间表达的倍数变化,或者通过QPCR未检测到它们的表达。所有定量测量均以两份的三份生物样品进行。将值作为手段呈现。 *p < 0.05, **p < 0.005.
因为 蛇 和 菱形 表达可以指示血缺陷,我们接下来比较了存在的血细胞数量 GMM.apo./WGM. 成年人在年龄匹配中发现 GMM.WT., GMM.apo./NB, 和 GMM.apo./SGM. 苍蝇。我们发现提供的 Wigglesworthia... 对Symbiont固化的女性提取导致其后代中存在的循环血细胞的数量增加。具体而言,血细胞密度在 GMM.apo./WGM. 来自GCS 2和3的成年人显着大于(113±33和127±21±21±21个血细胞/μl血细胞),而不是在年龄匹配中发现的 GMM.apo./NB (分别为7±3和9±4血细胞/μl血淋巴)和 GMM.apo./SGM. 苍蝇(10±4和4±1±1血细胞/μl血蜂蜜),但它明显不到 GMM.WT. 成人(733±104和681±68六血细胞/μl血淋巴; 图4B.)。相应地,我们观察到丙甲酸钠酶和 TEP.4,它主要用血细胞表达(28, 29),在成人中发现在显着更高的水平 GMM.apo./WGM. 苍蝇与成年人相比 GMM.apo./SGM. 在全身挑战后苍蝇(来自GC2) 大肠杆菌 (图4C.)。观察到与参与活性氧物质产生的基因相似的模式(DUOX. 和 伊克斯)。有趣的是,体液免疫相关基因(AMPS及其调节剂)以相似的水平表达 大肠杆菌 - 挑战 GMM.apo./WGM. 和 GMM.apo./SGM. adults.
我们的结果表明,喂养了Symbiont治愈的母亲补充了 Wigglesworthia... 细胞提取物诱导部分恢复在其暂性后代的免疫系统发育的生理反应。具体来说, GMM.apo./WGM. 幼虫表现出造血转录因子的表达增加 蛇 和 菱形并且,作为成年人,这些苍蝇存在一种功能性免疫系统,其特征在于存在循环吞噬血细胞。此外,增强了涉及上皮和细胞免疫的基因的表达 GMM.apo./WGM. adults.
GMM.apo./WGM. 苍蝇是抵抗力的 大肠杆菌 challenge
我们观察到这一点 GMM.apo./WGM. 后代表现出增强免疫力的标志。因此,我们接下来测试了是否成熟 GMM.apo./WGM. 成年人会抵抗系统性挑战 大肠杆菌 K12,而年龄匹配 GMM.apo./SGM. 和 GMM.apo./NB 苍蝇不会。为此,我们观察到38和43%的人 GMM.apo./WGM. 来自GCS 2和3的成年人,分别犯了10个挑战3 大肠杆菌 (图5A)。相应地,微观检查血淋巴 大肠杆菌-抵抗的 GMM.apo./WGM. 成年人揭示了吞噬内化的吞噬血细胞的存在 大肠杆菌 cells (图5B.)。相比之下, GMM.apo./NB 和 GMM.apo./SGM. 苍蝇非常敏感 大肠杆菌 挑战,而且,像他们一样 GMM.apo. 同行,所有人都在14-D实验期内被捕(图5A)。这种敏感的表型可能是由此产生的 GMM.apo./NB 和 GMM.apo./SGM. 成年人缺乏吞噬血细胞(图。 4B., 5B)。这些发现表明,亚非生物的Tsetse可以用另一种致命剂量来生存感染 大肠杆菌 如果他们在母亲喂食饮食时完成了宫内发育 Wigglesworthia... 细胞提取物。这种免疫活性表型展出 GMM.apo./WGM. 成年人可能来自血小淋巴中的吞噬血细胞的存在。
GMM.apo./WGM. 苍蝇表现出抗攻击 大肠杆菌。 (A)成熟的百分比存活 GMM.apo./WGM., GMM.apo./SGM., GMM.apo./NB, 和 GMM.WT. 在挑战之后,来自三个GCS的成年人3 cfu 大肠杆菌 K12。更多更多 GMM.apo./WGM. 来自第二个GC的苍蝇幸存下来比年龄匹配的挑战 GMM.apo./SGM. 和 GMM.apo./NB individuals (p <0.01)。然而,显着较少 GMM.apo./WGM. 来自这些GCS的苍蝇幸存下来的挑战,而不是他们的wt同行(p <0.01)。灰色显示的值代表致命感染。样本尺寸如下:GC1(n = 25苍蝇/复制所有TSetse Cohorts)和GC2(n = 25蝇/复制 GMM.WT. 和 GMM.apo./WGM. 苍蝇; n = 20 GMM.apo./SGM. 和 GMM.apo./NB 苍蝇)感染实验一式三份进行所有TSetse组。 GC3用星号表示,因为不够 GMM.apo./SGM. 和 GMM.apo./NB 制备后代以进行三份进行实验(即使在存在酵母提取物中,Symbiont固化的女性的繁殖力随时间降低)。因此,不进行这两组之间的统计比较。 (B)PostChallenge 12小时大肠杆菌GFP.,血淋巴被所有人收集(n = 3蝇/组/ gc)以监测吞噬血细胞的存在。如前所述处理样品。原始放大倍率×400。在(a)和(b)中,GC1以灰色表示,表示细菌补充 GMM.apo./WGM. 和 GMM.apo./SGM. 母亲始于他们的第一个宫内幼虫后代在他们的第三次发展瞬间中间大约中途。
讨论
共生细菌正在增加对昆虫免疫力的有效调节剂的识别增加(18, 30)。在目前的研究中,我们提供了证据表明,TSetse的共生细菌与在青少年发展期间与宿主免疫系统的成熟密切相关,并在成年期间随后的适当功能。我们确定了亚太自杀(GMM.apo.)来自Symbiont治愈的母亲的苍蝇存在严重受损的细胞免疫系统,因此,对通常是不管性的 大肠杆菌。这种免疫功能化表型可以颠倒 GMM.apo. 成年人接受从WT个体移植的血细胞。此外,免疫系统发展过程 GMM.apo. 当他们的Symbiont治愈的母亲喂食饮食时,幼虫可以恢复 Wigglesworthia... 细胞提取物。我们的结果表明,进化时间稳定地锚定了TSETSE和 Wigglesworthia... 这样这种细菌直接针对免疫力,因此最终是其宿主的繁殖力。作为回报,Tsetse提供 Wigglesworthia... 具有保护性和富含代谢物的利基,使这种细菌能够在这种环境中存活≥50万年(31)。
在缺乏的情况下,收到宫内幼虫发展 Wigglesworthia... (GMM.WGM.−)与WT飞跃相比,表现出受损的免疫系统(GMM.WT.),其特征在于吞噬血细胞数量减少70%(11)。在目前的研究中,我们发现消除了来自女性的所有共生细菌明显增强了它们后代的免疫功能性表型。实际上, GMM.apo. 成年人几乎没有循环(比99%) GMM.WT. 成年人)或术式血细胞,并且相应地更容易受到全身感染的影响 大肠杆菌 而不是wt tsetse和tsetse缺乏 Wigglesworthia.... GMM.WGM.− 苍蝇在存在时经历宫内成熟 索索里斯 和 Wolbachia.,房子〜40倍循环血细胞比其致剂对应物更具循环血细胞,并且更容易耐受 大肠杆菌 挑战 (11)。增强的免疫力表现出 GMM.WGM.− 与其亚太自杀的对应物相比的个体表明存在 索索里斯 和 Wolbachia. 宫内发育期间可在其TSETSE宿主中诱导有限程度的免疫系统成熟。尽管没有实验证据表明这种性质的功能作用 索索里斯, Wolbachia. 在其他昆虫模型中展示免疫调节性质。例如, 果蝇 用抗生素治疗以清除他们的 Wolbachia. 感染易受一系列RNA病毒(32, 33)。此外,蚊子 AEDES AEGYPTI. 可以稳定地用外源性菌株进行转染 Wolbachia. (wMelpop)(34)。存在 wMelpop似乎激活了来自Transinfected雌性的后代的免疫系统,随后随后对一系列病原体具有增强的免疫力(35, 36)。有趣的是,与我们的实验室殖民地不同,许多自然人群体没有港 索索里斯 和/或 Wolbachia. 但显然仍然是免疫表现(37)。如果这些共生在刺激TSetse的自然群体中,这些共生在刺激免疫系统发展中的作用仍有待观察。
许多昆虫,包括 果蝇, 按蚊, 和 曼努卡,可能依靠他们的细胞免疫系统作为具有致病细菌的系统性感染的有效第一线(38–41)。同样,Tsetse易受感染的影响 大肠杆菌 通过血细胞功能通过聚苯乙烯微球吸收(11)。在这项研究中,我们提供了进一步的证据表明,采取了克服全身感染的能力 大肠杆菌 还取决于功能性细胞免疫系统的存在。第一的, 大肠杆菌 杀戮 GMM.apo. 成年人尽管他们的表现得多大地表现出更多的安培 Cecropin. 和 attacin. 而不是抗性wt飞。这一发现表明,仅针对TSETSE克服全身感染的放大器不足 大肠杆菌。其次, GMM.apo. 如果他们以前接受从WT供体移植的血淋巴,则成年人幸存下来。但是,当在移植之前将WT供体血淋巴分离成细胞和可溶性级分, GMM.apo. 接受蜂窝级分(血细胞)的接受者展示了一个 大肠杆菌-Resistant表型。因此,血淋巴可溶性因子,例如安培,造血分子或反应性氧物质,可能是不诱导的 大肠杆菌 移植到时的抵抗力 GMM.apo. 苍蝇。相反,抗性出现在血细胞介导的吞噬作用的细胞免疫相关活性。
人体肠道中的有益微生物会产生与致病微生物产生的疾病导致的毒力因子不同的共生因素,促进有利的健康相关结果(42)。例如,人类的共生, 伯曲面脆弱,产生一种称为多糖A(PSA)的这样的这样的分子。用这种细菌恢复CD4的无菌小鼠的定植+ T细胞群体到常规发现的小鼠中的水平,这些小鼠占据了本地微生物群。这个过程一致 B. Fragilis. PSA诱导次级淋巴组织的发育。 B. Fragilis. PSA突变体未能诱导这些在无菌动物中的这些系统反应(43)。类似地,小鼠肠道微生物群用作肽聚糖(PGN)的来源,其增强吞噬中性粒细胞对致病细菌的疗效(44)。没有免疫调节共生因子是从昆虫相关的微生物的特征。在这项研究中,我们证明免疫系统发展 GMM.apo. 当母亲喂食补充有提取物时,幼虫被激活 Wigglesworthia... 细胞。该发现表明,这种迫使细菌的分子组分可以在Symbiont固化的女性的宫内幼虫中致动转基因灌注反应。该反应在没有乳腺相关的情况下恢复幼虫的免疫系统成熟过程 Wigglesworthia...。 Tsetse拥有两个不同的人群 Wigglesworthia...,其中的第一个在女性乳腺分泌物中发现细胞外。这些细菌细胞大概殖民大学发展宫内幼虫,在TSetse的独特viviparous繁殖模式期间接受母乳用于营养(7)。 Tsetse的第二个人口 Wigglesworthia... 存在于专用菌细胞的细胞溶胶内,其共同抑制位于邻近含细菌的器官,称为细菌组(45)。有趣的是, GMM.WGM.− 成年人,由女性收集的雌性收集的细菌组相关 Wigglesworthia... 但缺乏他们的牛奶腺,是免疫功能的影响(11)。因此,这个人口 Wigglesworthia... 不足以刺激宫内的免疫系统发展 GMM.WGM.− 幼虫。然而, Wigglesworthia... - 促进补充在Symbiont治愈的母亲饮食中的细菌组提取物可以刺激免疫系统开发 GMM.apo. 幼虫。细菌相关的 Wigglesworthia... 似乎产生所需的分子来解决免疫系统发展所需的分子 GMM.apo. 后代,但它们隐藏在细菌细胞的细胞溶胶中。
其中的机制 Wigglesworthia... 提取物诱导免疫系统发展 GMM.apo. 幼虫未知。在哺乳动物体系中,共生因子从肠腔悬垂到外周靶免疫组织。在鼠标模型中 B. Fragilis. 细胞,或者 B. Fragilis. PSA,大概由肠道相关的树突细胞造成,随后随后迁移到远处淋巴组织,其中它们用于分化T细胞谱系(43)。以类似的方式,小鼠肠道微生物群的PGN脱落从肠道上皮的腔侧转移到循环系统中。宿主血清和中性粒细胞功能中存在的PGN浓度之间存在正相关(44)。在TSetse系统中需要进一步的实验以确定免疫刺激 Wigglesworthia... 分子被运输到显影幼虫,其中它们表现出直接活性,或者它们是否在肠道中局部作用,以诱导潜水衍生的全身反应,随后诱导幼虫免疫系统发育。
细菌和昆虫之间的营养共混物有很好的记录(46, 47)。 tsetse和tsetse之间的关系 Wigglesworthia... 据推测,也具有营养成分,因为缺乏这种细菌的苍蝇是生殖的无菌(48, 9)。实际上, Wigglesworthia...高度降低的基因组编码了来自TSETSE的脊椎动物血液特异性饮食中缺失的许多维生素和辅助因子(49)。在这项研究中,我们证明了tsetse-Wigglesworthia... 共生是多维的,因为这种微生物也密切参与激活其宿主免疫系统的发展。因此,TSetse可以被利用作为一种相对简单而有效的模型,用于解密基本的分子机制,该宿主免疫诱导的宿主抗扰度。
披露
作者没有财务利益冲突。
致谢
我们感谢Yineng Wu博士为QPCR和Aksoy实验室的成员提供援助,以便对稿件进行批判性审查。
脚注
来自国家过敏和传染病研究所(AI051584),国家一般医学研究所(069449)和Ambrose Monell Foundation(全部至S.A.)的资助得到了支持。
本文的在线版本中包含补充材料。
本文中使用的缩写:
- amp.
- 抗微生物肽
- DPC.
- 后期后期
- DV.
- 背部船只
- GC
- 牙科营养周期
- GMM.apo.
- 亚偶联 光盘 morsitans morsitans
- GMM.WT.
- 野生型 光盘 morsitans morsitans
- 伊克斯
- 诱导没有合成酶
- PGN.
- 肽聚糖
- PSA.
- 多糖A.
- QPCR.
- 定量实时PCR
- rec大肠杆菌GFP.
- 表达GFP. 大肠杆菌 K12
- rec大肠杆菌pil
- 荧光素酶表达 大肠杆菌
- TEP.
- 含硫酸酯的蛋白质
- WT.
- 野生型。
- 已收到 2011年12月21日。
- 公认 2012年1月30日。
- 版权所有©2012由美国免疫医生,Inc。