抽象的
FORKHEAD转录因子FOXP3的表达限定了从效应CD4分离的天然导致的调节性Te乐彩下载（NTREGS）的不同谱系+胸腺早期发育期间的Te乐彩下载。它仍然难以通过关闭其Foxp3表达式来抑制ntregs可以转化为效应e乐彩下载，如果是，如果是的话，TH17是否是默认的替代命运选择。在本报告中，我们提供了令人信服的证据表明，效应Te乐彩下载偏振e乐彩下载因子IL-6和IL-4可以协同作用，以诱导在小鼠NTREGs中标记的下调和灭活Foxp3基因表达的抑制性表型和功能的损失。但是，由此产生的foxp3−e乐彩下载未偏振，不表达IL-17或其他TH17相关基因。因此，NTREG FATE修订不限于TREG-TH17轴，并且可能代表具有不同结果的相当广泛的现象。
Foxp3的持续表达对于Foxp3的e乐彩下载表型，抑制功能和稳压维持至关重要+ 调节性Te乐彩下载（Tregs）。与诱导型Tregs（Itregs）不同，在其在胸腺中的发育期间印记在天然存在的调节性Te乐彩下载（NTREGS）中的FoxP3的表达，并被认为是高度稳定的（1）。然而，最近的几项研究表明，存在Foxp3 / IL-17和Foxp3 /RorγT双阳性e乐彩下载（2–7），其他人报告了IL-17的外观+Foxp3− cells from Foxp3+ NTREGS对IL-6刺激（8, 9）。然而，它仍然不确定NTREGS是否具有关闭FOXP3表达的固有电位，从而转换为效应器Te乐彩下载，以及这种转换是否主要由竞争的TH17分化计划驱动。在这项研究中，我们报告了Foxp3+ 当在IL-6和IL-4存在时，NTREGS可以丧失FOXP3基因表达及其抑制性质。尽管IL-6和IL-4可以在低程度上单独下调Foxp3表达，但它们在一起具有富抗和稳定的灭活Foxp3基因表达。通过直接在CFSE标记的NTREG中进行FOXP3蛋白表达的e乐彩下载内染色，我们证实了FOXP3的形成− e乐彩下载不是由于非Treg污染物的生长，但实际上是由于刺激的NTREGs中的FoxP3表达的真正失活，并且容易检测到具有中间水平的过渡e乐彩下载。此外，通过使用e乐彩下载周期抑制剂，我们表明Foxp3下调不需要增殖或e乐彩下载分裂。有趣的是，虽然重编程的e乐彩下载失去了富抗的e乐彩下载和抑制函数，但它们没有转化为偏振效应e乐彩下载。尽管它们获得了IL-2，IFN-γ，IL-4，T-BET和GATA-3的表达，但与正常TH1和TH2效应e乐彩下载相比，水平相当低。更重要的是，Foxp3在很大程度上缺席了Th17属性− 除了检测IL-17，RORγT或IL-21基因表达的不均匀性的e乐彩下载。因此，Th17-Treg Dichotomy不构成驱动Ntreg命运修订的默认机制，实际上，效应分化似乎不是修订过程的先验。
材料和方法
老鼠
C57BL / 6小鼠来自国家癌症研究所（Bethesda，MD）和Foxp3-GFP记者小鼠（C57BL / 6背景上的Foxp3-Ires-GFP敲入菌株;参见参考文献。 10）由Mohamed Oukka博士（哈佛医学院）提供。将小鼠菌落保持在无特异性的无病原体障碍设施中，并且符合机构动物护理和使用委员会议定书的实验程序。
Te乐彩下载纯化和e乐彩下载分选
外围CD4+ 通过CD4 MAC柱（Miltenyi Biotec，Auburn，Ca）从Coxp3-GFP小鼠的合并淋巴结和脾脏分离Te乐彩下载。富集CD4+ 用PERCP CY5.5标记的抗CD4（L3T4）染色e乐彩下载，并用凸菌e乐彩下载分选仪（BD Biosciences，San Jose，Ca）分选以获得CD4+GFP.+ e乐彩下载。为了确保不确定的纯度，e乐彩下载受到第二轮分选的影响，并得到的CD4+GFP.+ nTregs were >关于GFP以及FoxP3蛋白表达的99.9％纯度。获得CD25.+ NTREG的子集，e乐彩下载也用联合蛋白标记的抗CD25（PC61）染色，CD25高的CD4+GFP.+ 相应地对e乐彩下载进行分类（两轮分选）。胸腺CD25+ 通过CD25 MACS柱（Miltenyi Biotec）首先从Foxp3-GFP小鼠的胸腺中分离出Tregs。将富集的e乐彩下载进一步用PERCP CY5.5标记的抗CD4（L3T4），PE标记的抗CD8（53-6.7），以及化学键素标记的抗CD25（PC61），然后进行两轮分选以获得CD25.高的CD4+CD8−GFP.+ e乐彩下载。通过用抗Thy1.2染料珠（Invitrogen，Carlsbad，Ca）的Te乐彩下载耗尽来从C57BL / 6小鼠的脾脏制备脾脏APC，并在培养之前将所得e乐彩下载染色（30μm）。
e乐彩下载培养
Te乐彩下载培养物以完全的RPMI 1640培养基进行（RPMI 1640，补充10％FCS，2毫米 l11）用于跟踪e乐彩下载分裂。为了抑制e乐彩下载增殖，使用4μMe乐彩下载周期抑制剂霉苯酚（MPA; Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo）。
FACS分析
对于FoxP3 / GFP报告者表达分析，收获e乐彩下载并用PERCP CY5.5标记的抗CD4染色并用FACSCALIBUR获得（BD BIOSCIENCE）。为了测量Foxp3蛋白表达，使用制造商指定的FIX /烫发缓冲器和条件，将e乐彩下载与Alexa Fluor 647标记的抗Foxp3 AB（FJK-16S; eBioscience，San Diego，CA）进行进一步的e乐彩下载内染色。 ）。通过固定/烫发缓冲器处理，GFP报告器信号在很大程度上被破坏，因此对CFSE荧光检测没有干扰。对于e乐彩下载内e乐彩下载因子染色，在2μM蒙蛋白（Golgistop; BD Biosciences）存在下，用50ng / ml PMA和1000ng / ml离子霉素（Sigma-Aldrich）刺激4-5小时。首先用Fc阻断剂和PERCP Cy5.5标记的抗CD4培养刺激的e乐彩下载，用于表面染色，然后使用PE标记的抗小鼠IL-2（JES6-5H4），IFN-γ（XMG1.2）进行e乐彩下载内染色，IL-4（11B11），IL-10（JES5-16E3），IL-17A（TC11-18H10）和同种型对照（BD Biosciences或Ebioscience）。对于双色e乐彩下载因子染色，与上述其他PE标记的抗小鼠e乐彩下载因子ABS一起使用联合蛋白标记的抗小鼠IFN-γ（XMG1.2）。流式e乐彩下载术采集是用FACSCALIBUR完成的，并且数据分析进行了WIT Flowjo软件（树星，亚·亚·南部或）。
[3H]胸苷增殖测定
这 [3H]胸苷的抑制基于抑制测定如前所述（11）。具体而言，CD4+CD25−GFP.− 通过e乐彩下载分选由FoxP3-GFP小鼠制备靶e乐彩下载。靶e乐彩下载（5×104在辐照的脾脏APC存在下单独或用不同数量的Treg效应e乐彩下载培养（5×104在96孔板中，0.5μg/ ml抗CD3（145-2C11; BD Biosciences），具有完整的RPMI 1640培养基。将e乐彩下载培养72小时，并培养[ 3H]胸苷（1μCI/井; GE Healthcare，Piscataway，NJ）在培养的最后16小时中加入了72小时。结果表示为三份孔±SEM的平均值。
定量PCR.
通过使用通用PCR母系混合物（Applied Biosystems，Foster City，CA）和ABI棱镜7500序列检测器系统（PerkinElmer，Wellesley，MA），通过Sybr Green Gene表达测定进行定量PCR（QPCR），如前所述（11）。底漆序列可根据要求提供。
统计分析
GraphPad Prism 5软件（GraphPad软件，SAN Diego，CA）用于数据分析。这 p 价值来自未配对的双尾 t test with a 95% CI.
结果
在效应聚e乐彩下载因子存在下抗CD3刺激后抗CD3刺激的FOXP3表达
我们之前的研究表明，Foxp3诱导和ITRegs的形成可以通过Th1，Th2以及Th17效应 - 偏振e乐彩下载因子（11）。因此，我们调查了是否通过暴露于那些e乐彩下载因子来改变Foxp3表达和Ntregs的命运。为了确保NTREG的明确纯度，我们孤立外围FOXP3+ 来自Foxp3-GFP记者小鼠的NTREGS（10）通过两轮FACS排序CD4+GFP.+ e乐彩下载。 PostSort分析证实我们的NTREG制剂的纯度是>99.9％（补充图1）。然后用抗CD3 /抗CD28涂覆的珠子刺激纯化的NTREGs（小鼠Te乐彩下载膨胀机;染料/酰硫腈）加17-偏振e乐彩下载因子IL-6，TH1-偏振e乐彩下载因子IFN-γ或IL-12，或TH2 - 渗透e乐彩下载因子IL-4。在4-5天培养后，我们发现，尽管在没有偏振e乐彩下载因子的情况下，虽然FoxP3表达在没有偏振e乐彩下载因子的情况下，在IL-6或IL-4存在下，福索普3 / GFP报告者表达的中等但可重复的损失（10 -16％; Fig. 1A, 1C）。相比之下，在含有IFN-γ或IL-12的培养物中的GFP报告者的下调是最小的（Fig. 1A, 1C）。除了通过GFP记者测量Foxp3表达外，还通过抗Foxp3 Ab进行e乐彩下载内染色，并获得相同的结果（Fig. 2 和数据未显示）。因此，Th17-和Th2-但不是Th1-偏振的e乐彩下载因子可以选择性地诱导NTREGS中FoxP3表达的下调。实际上，QPCR分析进一步证实，MRNA水平发生了FOXP3表达的损失（见 Fig. 3）。
图1。
在IL-6和IL-4存在下在体外刺激时对外周NTREG的FOXP3表达的丧失。外围狐p3.+ nTregs were isolated from the spleen and lymph nodes of Foxp3–GFP记者小鼠通过FACS分拣。用抗CD3 / CD28体外刺激e乐彩下载–coated beads in the presence of various effector-polarizing cytokines as indicated. The stimulated cells were harvested on day 4, stained with PerCP Cy5.5-labeled anti-CD4 Ab, and analyzed for GFP expression by FACS. A 和 E，用抗CD3 / CD28涂覆的珠粒加上指示的e乐彩下载因子或无e乐彩下载因子刺激e乐彩下载作为对照。 B，仅通过珠子（仅抗CD3 / CD28）或IL-6和IL-4（仅限IL-6 / IL-4）刺激e乐彩下载，或通过珠子加上两种e乐彩下载因子（+IL-6+IL-4）。 FOXP3表达式通过CD4 / GFP密度图和GFP直方图表示的GFP报告信号确定。 C，统计结果 A，显示Foxp3的平均百分比− 不同刺激条件诱导的e乐彩下载（平均值，SEM）。表明不同治疗条件之间的差异的意义 p 价值。从四个不同的实验中汇集了数据。 D，统计结果 B。数据来自三个独立实验。
图2。
Foxp3下调和e乐彩下载增殖的时间课程研究。 NTREGS准备好了 Fig. 1 并用CFSE染料标记。用抗CD3 / CD28涂覆的珠粒加上抗CD3 / CD28涂覆的珠粒加上不同e乐彩下载因子的标记e乐彩下载。在第3,6和9天，收获刺激的e乐彩下载，用抗CD4（PERCP CY5.5）和抗FOXP3（Alexa Fluor 647）染色，并通过FACS分析e乐彩下载分裂和FoxP3表达。通过对Foxp3蛋白水平的e乐彩下载内染色直接测量FoxP3表达。 A，e乐彩下载分裂和FoxP3表达式由Foxp3 / CFSE密度图表，以及Foxp3和CFSE直方图表示。 B，foxp3的百分比−从两个独立实验平均e乐彩下载。
图3。
NTREG再转化体中e乐彩下载因子和转录因子基因的mRNA表达谱。进行QPCR以测量基因表达水平。数据表达为与管家基因泛素标准化的相对表达水平。 NTREG治疗如上所述 Fig. 1。此外，新鲜的孤立的ntregs，天真的cd4+ Te乐彩下载，效应Te乐彩下载与Naive CD4分化+ 将Te乐彩下载包含为对照。将每个RNA样品从至少两个独立处理的e乐彩下载制剂中合并。使用通用PCR母系混合物（Applied Biosystems），通过SybR绿基因表达测定进行QPCR进行。
IL-6和IL-4的协同效应，以及AG受体接合的要求关闭Foxp3表达
为了测试IL-6和IL-4是否可以诱导Foxp3的更强的下调，我们将e乐彩下载因子添加到培养物中，结果表现出比个体的Foxp3水平更高，而不是个体的Foxp3（40-50％; Fig. 1B, 1D）。因此，IL-6和IL-4可以在刺激的NTREG中的关闭FOXP3表达时协同作用。为了进一步研究在NTREGS中灭活FoxP3表达所需的基本信号，我们用单独的抗CD3 / CD28珠粒（仅抗CD3 / CD28）或单独使用IL-6和IL-4（IL-仅6 / IL-4）。我们发现，没有从珠子或e乐彩下载因子治疗产生的FOXP3表达下降（Fig. 1B, 1D）。因此，Ag受体和效应偏振的e乐彩下载因子刺激对于触发Foxp3基因表达的下调至关重要。
e乐彩下载因子IL-2，IL-12，IL-21，IL-1β和IL-23已涉及调节FOXP3+ Treg维护和适应几个报告（2–7）。为了检查这些e乐彩下载因子对NTREG中的富曲面表达的潜在效果，我们通过单独添加IL-2，IL-12，IL-21，IL-1β和IL-23进行进一步的实验，或与IL-6一起进行IL-4，刺激NTREGS。结果表明，只有其自身的IL-21可以诱导富申3表达的中度下调，而其他人则没有显着影响（ Fig. 1E, 上部面板）。当与IL-6和IL-4一起添加时，IL-21进一步增加了Foxp3的百分比− cells (Fig. 1E, 较低的面板）。然而，效果似乎是基本的添加剂而不是协同作用。有趣的是，虽然据报道，虽然IL-1β和IL-23在促进Th17分化中发挥作用，但在我们的实验中与IL-6和IL-4组合添加时，这两种e乐彩下载因子实际上表现出对预防的中等而可重复的效果Foxp3下调。因此，多种e乐彩下载因子的组合刺激的结果可以复杂;某些组合可能导致Foxp3表达的协同下调，其他组合只会产生添加剂效果，但其他一些组合可能以相互拮抗的方式行事。尽管复杂性，但IL-6和IL-4刺激的效果似乎在我们研究中迄今为止测试的其他e乐彩下载因子上占主导地位。
禽流保表达的丧失以及e乐彩下载增殖发生，但下调过程不需要增殖和e乐彩下载分裂
由于用抗CD3 / CD28珠子的刺激导致NTREG的增殖膨胀，因此我们希望研究FOXP3灭活是否与e乐彩下载增殖相关。为此，我们用CFSE标记纯化的NTREGS，以便可以沿着时间直接跟踪增殖和e乐彩下载分裂。为了直接测量FoxP3蛋白水平，我们用抗foxp3b与alexa flul647标记的抗foxp3b进行e乐彩下载内染色。该染色条件与从GFP报告小鼠中分离的Ntregs的CFSE检测相容，因为GFP荧光主要通过固定和透化性消除GFP荧光治疗（参见 材料和方法）。通过这种方法，我们发现可以检测到Foxp3表达的下调 +IL-6+IL-4刺激的NTREG培养在第3天开始（Fig. 2）。时间课程实验进一步表明foxp3− 随着时间的推移，人口随着时间的推移而逐渐增加。虽然都是Foxp3.− 和 Foxp3+ e乐彩下载因子在e乐彩下载因子存在下6 d刺激后，e乐彩下载在刺激的情况下分开。 +IL-6和 +IL-6+IL-4，Foxp3− 人口似乎逐步分裂（Fig. 2）。这种现象可能是由于，一旦下调FoxP3表达，逆转了干燥状态，e乐彩下载也变得不抑制（见下文）。有趣的是，虽然大多数foxp3− e乐彩下载在第6天经过几轮e乐彩下载分裂，一小部分尚未分裂的e乐彩下载（CFSE高的发现）也发现了下调的Foxp3表达（Fig. 2）。此外，检测具有中间水平的过渡e乐彩下载，其在第6天时间点特别明显（Fig. 2）。为了确定Foxp3下调是否需要增殖和e乐彩下载分裂，我们使用e乐彩下载周期抑制剂MPa进行了进一步的实验，抑制了G. 1-S相转变和活性Te乐彩下载的DNA合成（12）。 CFSE标签证实，e乐彩下载分裂在MPa的存在下完全阻塞（Fig. 4）。尽管如此，具有e乐彩下载因子刺激的大部分Ntregs下调FoxP3表达。更重要的是，抗FOXP3染色的轮廓图揭示了具有各种中间水平的FOXP3表达的过渡e乐彩下载透明谱。因此，该实验明确证明，通过Ag受体加偏振e乐彩下载因子处理刺激的NTREG中的FoxP3表达的下调与e乐彩下载增殖无关。此外，它还排除了Foxp3的任何剩余可能性− e乐彩下载源自非Treg污染物的产物。
狐p3表达的失活 +IL-6+IL-4刺激导致抑制抑制表型和功能的损失，但不需要效应e乐彩下载因子表达
Foxp3的标志+ NTREGS是抑制作用，无论和缺乏效应e乐彩下载因子表达（1）。为了调查NTREGS中FOXP3表达的灭活是否导致其命运修订，我们进行了功能分析以检查这些基本属性。使用体外CD4+ Te乐彩下载抑制测定，我们发现Ntregs受到刺激的 +IL-6+IL-4条件在很大程度上是非压抑，而 +IL-6-或 +与对照相比，IL-4刺激的e乐彩下载仅对抑制活性进行了适度降低（Fig. 5A）。与抑制功能的损失平行，干燥状态 +IL-6+IL-4刺激的e乐彩下载也逆转（Fig. 5B）。相比之下， +IL-6-或 +IL-4刺激的e乐彩下载仍然是干燥的（Fig. 5B）。因此，这些结果证明了IL-6和IL-4在驾驶NTREG在功能水平进行重编程时的协同作用。一致地，包括CD25，GITR，CD39，FR4和CTLA-4，包括CD25，GITR，CD39，FR4和CTLA-4的e乐彩下载表面表达在下降 +IL-6+IL-4刺激的NTREGs，下调似乎与Foxp3表达的减少相关（Fig. 5C）。为了进一步检查Treg Fate Revision在基因表达水平上的性质，我们对大量效应e乐彩下载因子基因进行了QPCR分析，以及关键的Te乐彩下载谱系特异性转录因子。我们发现了 +IL-6+IL-4处理的NTREGs获得了属于TH1和TH2效应e乐彩下载的e乐彩下载因子基因的混合物的表达（Fig. 3）。然而，与纯CD4产生的正常偏振TH1和TH2e乐彩下载相比，那些e乐彩下载因子基因的表达水平相当低+ Te乐彩下载。此外，与e乐彩下载因子表达谱一致，检测到TH1和TH2转录因子T-BET和GATA-3的低水平表达（Fig. 3）。然而，令人惊讶的是，诱导诱导Th17相关基因，包括IL-17，IL-21和RORγT的少量表达（Fig. 3）。因此，QPCR分析显示的基因表达模式表明FOXP3的效应偏振的缺乏− 回复e乐彩下载。然而，QPCR检测到的T辅助转录因子和e乐彩下载因子基因的低mRNA水平可能是由于仅为重编程的Foxp3的一小部分− e乐彩下载能够在高水平下表达效应Te乐彩下载基因，或者可能确实反映了大多数重编程e乐彩下载中基因的低表达。为了区分这两种可能性，我们对IL-6和IL-4刺激的Tregs进行了e乐彩下载内e乐彩下载因子染色实验。单一e乐彩下载因子染色分析显示 +IL-6+IL-4刺激，只有小百分比的e乐彩下载获得了表达IL-2，IFN-γ，IL-4和IL-10的能力（Fig. 6A）。此外，与QPCR结果一致，没有检测到明显的IL-17阳性e乐彩下载（Fig. 6A）。类似地，发现甚至较低的IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-10或IL-17产生的e乐彩下载数量均可诱导 +IL-6或 +IL-4刺激（Fig. 6A）。为了确定一些重新编程的e乐彩下载是否可能表达多于一种e乐彩下载因子，我们所需 +IL-6+IL-4处理的NTREGS与抗IFN-γ组合与第二e乐彩下载因子AB组合。实际上，IFN-γ的小部分+IL-2+，IFN-γ+IL-4+，和ifn-γ+IL-10+ 除了单阳性群体之外，还发现了双阳性e乐彩下载（Fig. 6B）。因此，e乐彩下载内e乐彩下载因子染色证实，确实是重编程的NTREGS大部分是不偏相的，只有小比例的e乐彩下载，显示e乐彩下载因子基因表达的较低水平和异质图案，这使得对常规CD4描述的TH0表型来调情+ Te乐彩下载在非极化条件下激活（13）。
图5。
诱导NTREG表型和功能的修订 +IL6+IL-4刺激。如上所述，在不同条件下刺激NTREGS Fig. 1. A，抑制活性通过CD4对抑制来确定+ 靶te乐彩下载增殖。三种不同的E：T比率（1：0.1,1：0.3,1：1）用于ASSaym和[3H]胸苷摄取被标准化为仅靶e乐彩下载培养条件（1：0）。 B，治疗的NTREGs对抗CD3刺激的增殖反应。在Te乐彩下载耗尽的脾apc存在下用可溶性抗CD3 Ab（0.5μg/ ml）刺激e乐彩下载（30 gy辐照）和[3H]测量胸苷摄取。 C，FACS分析Treg表面标志物的表达。 +IL6+IL-4–刺激的NTREGS用PERCP CY5.5标记的抗CD4和PE标记的AB染色至CD25（PC61），GITR（DTA-1），CD39（24dMS1），FR4（EBIO12A5）或CTLA-4（9H1）。表明的。显示是代表实验的PE-AB / GFP密度图。
图6。
NTREG再转化剂的e乐彩下载内e乐彩下载因子染色分析 +IL-6+IL-4治疗。如上所述，在表明条件下刺激了NTREGS Fig. 1. A，通过用PE标记的同种型对照，抗IL-2，抗IFN-γ，抗IL-4，抗IL-10和抗IL-17分析e乐彩下载的单彩e乐彩下载内e乐彩下载因子染色e乐彩下载分析e乐彩下载。分别。显示是PE（FL2）与FL4（空通道）密度图。e乐彩下载因子阳性e乐彩下载的百分比在左上象限中表明。 B, +IL6+IL-4–用双色e乐彩下载内e乐彩下载因子染色与聚苯键素标记的抗体进行刺激的NTREGs分析–IFN-γ加上标记的抗–IL-2, anti–IL-4, anti–IL-10, or anti–IL-17。将含有联素胶质素和体积标记的同种型对照ABS的染色作为对照。显示的是ifn-γ（FL4）与IL-2，IL-4，IL-10和IL-17（FL2）密度图。单一e乐彩下载因子阳性e乐彩下载群的百分比分别在相应的象限中表明。
CD25+Foxp3+ NTREGS也能够进行命运修订
Foxp3+ NTREGS由CD25组成+ 和 CD25− 群体。虽然包括CD25+Foxp3+ 和 CD25−Foxp3+ NTREGS已被证明在体内同样抑制和相互互动（1），CD25标记的表达最初用于定义NTREGS和CD25+ 据报道，亚潜水病患有更稳定的Foxp3表达（14）。确定CD25是否+ NTREGS还有可能通过IL-6和IL-4刺激进行命运修订，我们分离CD25高的Foxp3+ 来自脾脏和淋巴结组织或FOXP3-GFP报告小鼠胸腺的NTREGS，我们进行了相同的实验 Fig. 1。结果表明外周和胸腺CD25高的Foxp3+ NTREGS以与Foxp3的总数类似的方式表现+ NTREGS可以通过抗CD3 / CD28加e乐彩下载因子刺激诱导FOXP3下调的NTREGS（Fig. 7）。类似于总Foxp3发生的事情+ Tregs，而IL-6或IL-4可以单独诱导低水平的下调，FoxP3表达的更广泛的失活需要两个e乐彩下载因子的协同作用（Fig. 7）。因此，关闭FoxP3表达和经历命运修订的可能性似乎是所有NTREGS的固有性质，即使命运修订的实际倾向可能因不同刺激而不同的群体之间的不同群体而变化。
图7。
外周和胸腺CD25中FOXP3表达的丧失+Foxp3+ 特雷格斯 +IL6+IL-4刺激。 A，外围CD25+Foxp3+ 通过为CD25分选，从FoxP3-GFP报告小鼠的脾脏和淋巴结分离出Tregs高的GFP.+ Tregs的亚群。用CFSE标记e乐彩下载并以与相同的方式刺激 Fig. 1。在第5天，收获刺激的e乐彩下载并用抗CD4（PERCP CY5.5）和抗FOXP3（Alexa Fluor 647）染色，以通过FACS测量FoxP3表达和e乐彩下载分裂。显示Foxp3 / CFSE密度图和FOXP3直方图。 B，胸腺CD25+Foxp3+ 通过对CD25进行分类，从FoxP3-GFP报告小鼠胸腺中分离出Tregs高的GFP.+ 特雷格的分数。刺激e乐彩下载 A 但没有CFSE标签。在第5天，收获刺激的e乐彩下载，用抗CD4（PERCP CY5.5）染色，并由FOXP3-GFP报告表达的FACS分析（GFP / CD4密度图和GFP直方图）。 C 和 D，Foxp3的平均结果− e乐彩下载百分比 A 和 B 源自三个和两个独立的实验。这 p 表示值。
讨论
Ntregs可能能够区分为效应e乐彩下载的初始指示来自Foxp3的观察结果+IL-17+ 和 Foxp3+RORγT.+ 可以在小鼠中检测到双阳性e乐彩下载（2–4）人类（5–7）。补充那些调查结果，几个群体报告了IL-17生产Foxp3− 从Foxp3诱导e乐彩下载+ IL-6刺激的NTREGS（8, 9）。然而，问题仍然是那些双阳性e乐彩下载确实代表了命运修订中的NTREG，或者它们是否反映经历Th17分化的幼稚前体e乐彩下载的过渡状态。同样，它没有被仔细排除在内的IL-17+Foxp3− 在IL-6处理的NTREGS培养物中产生的e乐彩下载可能是由于非Tregs的轻微污染，因为两种单独的研究表明NTREGS可以直接幼稚CD4+ Te乐彩下载由于NTREG在Ag受体刺激上产生的TGF-β产生而成为Th17e乐彩下载（8, 15）。然而，Th17和Itregs之间存在明显的二分关系。 bettelli等。 （10）首先显示，虽然单独的TGF-β可以刺激来自幼稚前体e乐彩下载的ITREG形成，TGF-β加IL-6将诱导Th17分化。更重要的是，随后的研究进一步揭示了ITREG和Th17分化的结果通过相对丰富的TGF-β和IL-6调节。一方面，高TGF-β促进ITREGS，同时抑制TH17;另一方面，强烈的IL-6信号传导刺激Th17分化，但拮抗ITRegs的形成（2, 16）。
在这项工作中，我们发现IL-6刺激确实可以导致蛋白质和mRNA水平在高度纯化的FOXP3中的低度量降低程度+ NTREGS，这与LAL等人描述的更新研究一致。 （17）。类似地，另一种效应偏振e乐彩下载因子，IL-4显示，其显示在先前的研究中抑制ITREG诱导（11, 18, 19）也发现，在NTREGS中诱导FOXP3表达的丧失。更显着，这两个e乐彩下载因子在一起可以协同作用以驱动Foxp3基因表达的深刻失活。通过CSFE标记的NTREG中的FoxP3蛋白直接AB染色，我们确定了修复过程的过渡状态，其中Ntregs逐渐下调其Foxp3蛋白表达以及e乐彩下载增殖。然而，通过使用e乐彩下载周期抑制剂MPa，我们的研究表明，增殖或e乐彩下载分裂对于NTREG命运修订并不重要，至少是Foxp3下调的初始过程。连同，这些结果正式证明了Foxp3的外观− 由于非NTREG的任何潜在污染的产物，e乐彩下载不是由于非NTREG的任何污染。有趣的是，虽然重编程Foxp3− 由诱导的e乐彩下载 +IL-6+IL-4治疗失去了抑制函数和表型，它们似乎没有分化成极化效应e乐彩下载。相反，它们表达了低水平的IL-2，IFN-γ，IL-4和IL-10的混合物。更重要的是，在FOXP3中，IL-17或其他TH17相关基因的显着上调包括IL-21和RORγT，包括IL-21和RORγT− 回复e乐彩下载。因此，不需要由竞争Th17分化计划驱动的NTREG命运修订。显然，TH17不是NTREGS的唯一替代命运选择。
我们研究的结果与来自小鼠遗传研究的早期结果一致，这表明成熟Ntregs中Foxp3表达的遗传破坏或扰动可能导致产生不同效应e乐彩下载的混合阵列，而不仅仅是Th17 - 产生IL-2，IFN-γ和IL-4的Th2样效应e乐彩下载（20, 21）。 NTREGS可能保持多电像的概念的额外支持来自更新的工作，表明福索普3的养运会+ NTREGS进入淋巴栓塞主持人导致FOXP3的外观 − 供体来源的e乐彩下载表现出不同的效应表型，包括淋巴结和脾脏中的Th1，Th2和Th17（14, 22–24）。有趣的是，在某些解剖学位置，例如Peyer在小肠中的斑块，也发现NTREGS分为Foxp3−IL-21+ 卵泡辅助杆Te乐彩下载而不是炎症Th17e乐彩下载（23）。除了淋巴e乐彩下载环境外，周等人的优雅遗传标记研究。 （25[最近据表明，NTREG修正在正常健康动物中组成，再次编程e乐彩下载表现出混合效应e乐彩下载因子表达谱。
生理或病理生理病情会促进NTREG FATE修订吗？我们的研究结果表明，IL-6和IL-4一起可能是驱动Foxp3下调和抑制表型和功能丧失的最有效的e乐彩下载因子Milieus之一。这一发现符合体内研究表明，胃肠道是NTREG修订的有利部位之一。已知胃肠道轨道具有丰富的IL-6（26）和最近的研究进一步揭示了IL-6的IL-4水平可以通过共生细菌调节，并且IL-6和IL-4的升高似乎是抑制肠粘膜中ITREG形成的抑制作用（ 18, 26）。同样，肺和气道粘膜隔室也具有高水平的IL-6（26）在哮喘中严重气道炎症的情况下，同时可以发生大量的IL-6和IL-4（27），从而构成用于驱动NTREG修订的有利环境。该环境中的NTREG修订可能导致疾病发展进一步恶化。高水平IL-6和IL-4的另一个显着情况是寄生感染，其通常与强TH2偏差和慢性组织损伤有关。在该条件下调制Ntreg函数和维护被认为是平衡宿主免疫和耐受性和免疫病理学控制的重要机制（ 28）。
最近的几项研究突出了先前未被识别的Foxp3的异质性和可塑性+ tregs。已经表明，NTREGS可以至少瞬时获取各种效应Te乐彩下载e乐彩下载因子和转录因子的表达，而不会失去抑制活性或关闭FOXP3表达（29–32）。实际上，效应转录因子的表达或激活，包括T-BET，IRF4和Stat3似乎对NTREGS控制相应的效应类型特异性免疫应答的调节功能非常重要（29–31）。相比之下，NTREGS可以关闭FOXP3表达并在多个不同条件下进行命运修订。效应分化的选择和这种重编程的结果可能受到宿主状态，组织微环境，抗原刺激和e乐彩下载因子Milieus的影响（14, 22–25, 33）。有趣的是，尽管Foxp3表达与抑制性表型和功能紧密相关，但效应分化不是Foxp3下调和Ntreg命运修订的先决条件。我们从e乐彩下载内e乐彩下载因子染色分析中获得的数据显示，大多数FOXP3 − 回归者诱导 +IL-6+IL-4刺激对于效应e乐彩下载因子表达是阴性的，但是e乐彩下载的相当大部分表达低水平的TH1和TH2e乐彩下载因子。这些发现与多个不同群体报告的体内研究结果一致。在正常健康小鼠中产生的NTREG再转剂不是炎症，并且似乎缺乏偏光的明显迹象到TH1，TH2或TH17（14, 22–25）。然而，可以从NTREGS生成一些新类型的T效应器而不是未偏压的TH0e乐彩下载 +IL-6+IL-4治疗，因为有越来越多的证据指出了前所未有的多样性和CD4的多功能性 + helper T cells (34, 35）。未来工作中的全球基因表达分析将有助于解决此类问题。尽管如此，尽管这种不确定性，我们发现了 +IL-6+IL-4诱导的NTREG再转剂是高度塑料的，并且在第二轮刺激期间它们可以偏振至TH1，TH2或TH17效应e乐彩下载（数据未显示）。因此，这提出了可能性丧失FoxP3表达/抑制函数和效应e乐彩下载的分化可以独立地发生。
IL-6和IL-4如何在下调富索表达时协同作用，目前未知。因为在FOXP3中诱导RORγT或GATA-3的显着表达− 通过IL-6和IL-4处理的转化e乐彩下载，这两个T辅助谱系转录因子不太可能在关闭FoxP3基因表达方面发挥任何直接作用。相反，在暴露于IL-6和IL-4（30, 31）。因此，一个有趣的可能性是，可以通过STAT3和Stat6的强激活来驱动Foxp3下调。为了支持这种观点，之前的研究表明，STAT3和Stat6都可以在幼稚CD4中致拮抗FOXP3表达+ TGF-β刺激诱导的Te乐彩下载（11, 16, 19, 36）。因此，未来的研究是为了调查Datt3和Stat6如何合作地运作以解决并最终关闭NTREGS中FoxP3基因的活性转录。
致谢
我们感谢David Z. He和Karen Ramirez在Cell Sorting的帮助下，Mohamed Oukka博士提供Foxp3-GFP记者小鼠和Drs。 Y.-J.刘，Kui voo，eulogia罗马和shino hanabuchi进行讨论和批判读取手稿。
披露 作者没有财务利益冲突。
脚注
这项工作是由MD Anderson Cancer Center Trust Funce，国家卫生机构Grant Ai073641和美国癌症协会研究学者奖（Lib-117155）到F.x.-f.q.
本文的在线版本中包含补充材料。
本文中使用的缩写：
- Itreg.
- 诱导型调节性Te乐彩下载
- MPA.
- 霉菌酸
- ntreg.
- 天然存在的调节性Te乐彩下载
- QPCR.
- 定量PCR.
- Treg.
- 监管Te乐彩下载。
- 已收到 2009年6月18日。
- 公认 2010年9月10日。
- 版权所有©2010由美国免疫学家，Inc。
