抽象的
显示α-半乳糖基胺的C-糖苷类似物，用于激活人和小鼠不变的NKT（iNKT）细胞。在这些类似物中，在酰基链中具有芳环的GCK152表现出对人体的更强烈的刺激活性iNKT细胞和对小鼠的一项较弱的活动iNKT细胞比GCK127与α-半乳糖酰胺的几乎相同的脂肪酰基链。在这项研究中，我们发现了表达的不变TCR（Invtcr）iNKT细胞，但不是APC表达的CD1D，命令C-糖苷的物种特异性优先活性，以及它们对人对鼠的优先活性iNKT细胞与糖脂-CD1D复合物与各个inctcr的结合亲和力相关iNKT细胞而不是人或鼠CD1D分子的糖脂的细胞。总体而言，Invtcr的结构差异出现在形成C-糖苷类似物的生物活性强度方面的CD1D分子的结构差异。
鼠不变NKT（iNKT）3 细胞表达了不变的TCR（Invtcr），其由由A编码的α链组成 Vα14-Jα18 重新排列的基因，优先与编码的β-链相关联 Vβ8.2, Vβ2， 或者 Vβ7。在人类， iNKT细胞表达INVTCR，由编码的α链组成 Vα24-Jα18 基因段主要与Vβ11β-Clip相关（1）。海绵衍生的糖脂，α-半乳糖基（α-高铝），是第一个被人和鼠的Invtcr认识到的鉴定的配体 iNKT细胞在CD1D分子的上下文中，非分类MHC等分子。当由α - 高层激活时， iNKT细胞快速产生TH1（IFN-γ）和TH2（IL-4）细胞因子（2, 3）。最近，已经合成了α-高层的各种类似物并显示出诱导Th / Th2产生的改变比率 iNKT细胞（4, 5, 6, 7）。
在我们以前的研究中，我们发现几种具有糖和脂质部分之间具有E-烯烃接头的C-糖苷类似物，能够激活人和鼠 i体外NKT细胞（8）。有趣的是，在这些类似物中，GCK152在酰基链的尾部具有芳环，显示出有效的人体刺激 iNKT细胞分泌TH1和TH2细胞因子，但未能显着刺激小鼠 iNKT细胞在体内和体外（8）。相比之下，GCK127，一种与脂肪酰基链非常相似的类似脂肪酰基的类似物，对鼠进行了强大的刺激活性 iNKT细胞，但较弱的活性比GCK152对抗人 iNKT细胞（8）。我们假设GCK127和GCK152对人类vs鼠的独特活动 iNKT细胞可能是由于人和小鼠CD1D分子之间的结构差异，或者由于小鼠VS人类的INVTCR之间的结构差异 iNKT细胞。在目前的研究中，使用人/小鼠CD1D：IG二聚体蛋白，我们确定了GCK127和GCK152对人对小鼠CD1D分子的相对结合亲和力，以及针对人的VS小鼠 iNKT细胞。通过将表达人或小鼠Invtcr的细胞与表达小鼠或人CD1D的APC组合，我们鉴定了对两种C-糖苷类似物的物种特异性活性负责的细胞。
材料和方法
糖脂和小鼠
遵循所描述的程序（以下）遵循GCK127和GCK152（9）。六至8周龄C57BL / 6小鼠购自Taconic Farms购买，并在洛克菲勒大学实验室动物研究中心的标准条件下维持。
血清细胞因子浓度的测定
C57BL / 6小鼠施用I.v.每个糖脂的1μg。在糖脂处理后的小鼠2,6,12,24和48小时内收集血清，通过夹心ELISA（eBioscience）测量IFN-γ和IL-4的血清浓度。
分离和产生未成熟的人树突细胞（DCS）和人 iNKT细胞系
未成熟的DC和人类 i如前所述，产生了表达Vα24TCR的NKT细胞系（8）。简要介绍，vα24++ cells by FACS.
一个鼠标 iNKT杂交瘤和小鼠 iNKT细胞系
一个鼠标 iNKT杂交瘤，1.2，其中包括小鼠不变Vα14-Jα18和Vβ8.2链，由Mitchell Kronenberg（La Jolla过敏和免疫学，圣地亚哥，CA）提供。一代鼠标 i先前已经描述了共同表达人类不变的Vα24-Jα18和Vβ11链的NKT杂交瘤58αβ（10, 11）。老鼠 i产生NKT细胞系，如一些修改所述（12, 13）。将来自C57BL / 6小鼠的骨髓祖细胞用10ng / mL小鼠GM-CSF培养7天以产生未成熟的DC。然后在100ng / mlα-高分子的存在下通过自体未成熟DC来加入胸腺细胞10天。用淋巴米电池-M（精确的化学）纯化后，在100ng /mlα-高分子和10μg/ ml小鼠IL-2（细胞科学）的存在下，细胞在100ng / mlα-高压运动的情况下用未成熟的DC进行1W。经过三个刺激循环，>示出了95％的NKT细胞与由FACS一起装载α-高压运动的小鼠CD1D二聚体反应。
生成表达小鼠CD1D分子的Hela细胞
编码鼠标的质粒pCDNA3-CD1.1 CD1d 基因由王汝王博士（西北大学，芝加哥，IL）提供（14）。五×105 培养野生型HELA细胞过夜，然后用4μgpCDNA3-CD1.1质粒转染，使用10μl脂质积2000（Invitrogen）。小鼠CD1D分子的表达，由与人β相关的小鼠CD1D H链组成2 通过用PE标记 - 抗小鼠CD1D AB染色转染的HeLa细胞，将微生物蛋白确认，24小时以后，然后进行FACS分析。发现超过60％的转染的HeLa细胞表达小鼠CD1D分子（数据未显示）。
量化人类产生的细胞因子水平 iNKT细胞系，鼠标 iNKT细胞系和鼠标 iELISA的NKT杂交瘤细胞
一万人 iNKT细胞，或相同数量的鼠标 iNKT细胞或鼠标 iNKT杂交瘤细胞，与2×10共携带4 Hela细胞用人转染 CD1d 基因（由史蒂文·帕尔卡利博士提供，Albert爱因斯坦医学院，Bronx，NY），Hela细胞用鼠标转染 CD1d 基因，或用小鼠转染的A20细胞 CD1d 基因（由Mitchell Kronenberg博士提供），在表明每个糖脂的表明浓度存在下。孵育24-H后，收集培养上清液，通过ELISA（eShostants）测定上清液中的人IFN-γ和IL-4和小鼠IFN-γ，IL-4的浓度。
使用18：1 PE脂质作为指示剂的竞争力的ELISA
通过竞争性ELISA测量糖脂类似物和人或小鼠CD1D分子之间的亲和力，使用18：1 Biotinyl PE（1,2-二脲-Sn-甘油-3-磷乙醇胺-N-（Biotinyl）（Bianti极性脂质），如竞争对手，如上所述（15
HCD1D：IG二聚体或MCD1D：含有糖脂的IG二聚体
HCD1D：MIGG二聚体或MCD1D：MIGG二聚体分子分别使用Lynx Rapid RPE AB共轭试剂盒（ABD Serotec）或Lynx Repid APC AB共轭试剂盒（ABD Serotec）与Pe或苯体粘蛋白缀合。每个PE或联合素蛋白标记的CD1D：MIGG二聚体分子加载1000折叠摩尔比过量的GCK127，GCK152，或α-高铝，在37℃下在37℃下通过微管离心过滤装置（Millipore）洗掉卸载糖脂。 。这些糖脂负载的PE /苯并键素标记的HCD1D二聚体或MCD1D二聚体用于染色人或小鼠 iNKT细胞。
染色 i具有连续稀释的PE标记的CD1D-甘油脂复合物的NKT细胞
人类和老鼠 i用PE缀合的CD1D染色NKT细胞：根据已发表的方案加载有糖脂的MIGG二聚体（12, 16）。简而言之，不同剂量，10 −.5 to 102.5 nM, of PE-labeled CD1d dimer-loaded with glycolipids and 10 μg / ml fitc标记的抗cd3ε mAb were incubated with 2 × 105 人类 iNKT细胞或鼠标 iNKT杂交瘤细胞在冰上30分钟。洗涤细胞后，用CD3镶环染色的细胞并用FACS LSRII仪器（BD Biosciences）进行分析。使用FlowJo V8.8软件（树星）进行流式细胞术分析。将二聚体荧光水平标准化为用FITC标记的抗CD3 AB的表面染色的水平，然后绘制二聚体浓度。 GraphPad Prism软件装订了绑定曲线。
竞争染色 iNKT细胞使用α-戈尔锥-CD1D复合物作为指示器
首先，通过用连续稀释的联合粘蛋白标记的CD1D标记的CD1D染色来测定结合人或小鼠油段的α-高压运动-CD1d复合物的次优剂量的α-高压运动-CD1D复合物的α-高压运动-CD1D复合物测定：IG二聚体充分地装有α-高利剂。在鉴定α-高效基团-CD1D复合染色的次优剂量以4nm，人体 iNKT细胞或鼠标 iNKT hybridoma cells were then stained on ice for 30 min with 10 μg / ml fitc标记的抗cd3ε mAb and 4 nM of allophycocyanin-labeled CD1d dimer loaded with α-GalCer, in the presence of a varying doses, 10−3 to 104.5 NM标记的CD1D二聚体加载糖脂类似物，作为竞争对手。洗完细胞后， i用CD3留有NKT细胞，并分析FACS LSRII仪器（BD Biosciences）的联蛋白染色染色。使用FlowJo V8.8软件进行流式细胞术分析。
数据分析
所有数据都表示为来自每个样品的三份孔的平均值±SD。实验和控制数据的统计分析由学生评估 t 测试。在所有研究中，一个值 p <0.05被认为是统计学意义。
人类主题
来自匿名血液供体的人外周血单核细胞从纽约血液中心提供的Leukopack获得。 NYBC在性别或种族的基础上没有选择捐助者，但确保所有捐助者都超过18岁。因此，我们执行的工作不需要批准制度审查委员会。
结果
α-高压糖苷，即GCK127和GCK152的两个C-糖苷类似物具有糖和脂质部分之间的E-烯烃接头。 GCK127具有几乎相同，2个碳较长，脂肪酰基链作为α-高压杆，而GCK152在酰基链条的尾部具有芳环（图1⇓A）。我们之前已经表明，GCK152对人类油墨细胞的刺激活性呈现比在体外的GCK127（8）。在鲜明对比中，与GCK127不同，GCK152未在体内给药后的任何时间点在小鼠的血清中诱导显着的IFN-γ和IL-4（图1⇓B）。
两个C-糖苷类似物，GCK127和GCK152的结构，以及它们在体内诱导细胞因子产生的能力。 A，GCK152和GCK127的化学结构。 B, The levels of cytokines in the sera of mice administered with glycolipids. One μ将GCK127或GCK152中的每种糖精，GCK127或GCK152施用于野生型C57BL / 6小鼠I.v.，并且在给药后在指定的时间点收集血清。细胞因子水平，包括IFN-γ血清中的IL-4由ELISA测定。数据表示为平均值±来自五只小鼠的血清SD。结果代表了两个类似的实验之一。
首先，我们通过使用表达人CD1D的Hela细胞或表达小鼠CD1D的A20细胞以刺激人的vs小鼠，确定在体外确定这两种糖脂的优先生物活性。 iNKT细胞（图2⇓）。我们发现Hela-HCD1D呈现的GCK152诱导近2倍的水平（p <0.05）IFN-γ和IL-4由人分泌 iNKT细胞比GCK127（图2⇓A），而A20-MCD1D呈现的GCK152诱导近一半的水平（p <由小鼠分泌的细胞因子的0.05个 iNKT细胞比GCK127（图2⇓B）。我们假设GCK152和GCK127对人对鼠标的优惠刺激活动 iNKT细胞是由于人VS小鼠CD1D分子之间的差异，鉴于先前的研究表明糖脂-CD1D相互作用与基于细胞的细胞因子产生的水平相关的糖脂-CD1D相互作用（17）。要测试这个假设，我们使用了A20-MCD1D单元来将GCK152和GCK 127呈现给人类 iNKT细胞，相反，使用Hela-HCD1D细胞将糖脂呈现给小鼠 iNKT细胞。令我们奇迹，当由由A20细胞表达的小鼠CD1D分子呈现时，GCK152诱导近2％至3倍的刺激活性（p < 0.05) against human iNKT细胞比GCK127（图2⇓C）。相比之下，由HeLa细胞表达的人CD1D分子呈现的GCK127显示出明显更强的刺激活性（p <0.05）对小鼠 iNKT细胞比GCK152（图2⇓D）。
GCK127和GCK152在人对小鼠CD1D分子上对人VS鼠的情况下GCK127和GCK152的不同刺激活动 iNKT细胞体外。在 A 和 B，2×104 人类 iNKT细胞或鼠标 iNKT细胞与2×10共培养4 Hela-HCD1D或A20-MCD1D分别在各种浓度的每种糖脂的存在下，在96孔培养板中的0.01至1μg/ ml范围内。在 C 和 D，1×105 人类 iNKT细胞或鼠标 iNKT细胞与1×10共培养5 of A20-mCD1d or Hela-hCD1d, respectively, in the presence of various concentrations of each glycolipid, ranging from 0.01 to 1 μ在96孔培养板中的g / ml。在孵育24小时后，收集上清液，HIFN-的浓度γ and hIL-4, or mIFN-γ和Mil-4由ELISA确定。结果代表了三种类似的实验之一。
仍然可能仍然可能的是，两个糖脂的优先活性可能稍微受到APC表达的性刺激分子和/或细胞因子/趋化因子的原点的影响。为了消除这种可能性，我们产生了表达小鼠CD1D分子，Hela-MCD1D的Hela细胞，并使用该细胞系作为APC。如图3所示⇓A，GCK152对人类的优惠刺激活性 i即使使用Hela-MCD1D，NKT细胞也明显不妨碍。相比之下，GCK127能够维持更强的刺激活动（p < 0.05) against mouse i当由Hela-MCD1D呈现时，NKT细胞比GCK152比GCK152。
由人或小鼠CD1D分子呈现针对人的GCK127和GCK152的不同刺激活性 iNKT细胞体外。在 A，1×105 人类 iNKT细胞与1×10共培养5 Hela-MCD1D细胞，3×104 老鼠 iNKT细胞与3×10共培养4 在96孔培养板中分别在表明浓度的每种糖脂的存在下，HelA-MCD1D细胞。孵育24小时后，收集上清液，通过ELISA测定HIFN-γ和HIL-4，或MIFN-γ和MIL-4的浓度。在 B，5×104 cells of mouse Vα14表达小鼠invtcr或小鼠v的杂交瘤α表达人类Invtcr的24种杂交瘤与5种× 104 HelA-HCD1D，HelA-MCD1D或A20-MCD1D的细胞在96孔培养板中存在指示的每种糖脂的浓度。孵育24小时后，收集上清液，通过ELISA测定MIL-2的浓度。在所有实验中，结果代表了三种类似的实验中的一个。
为了进一步确认单独的Invtcr可以指挥GCK127和GCK152对鼠标和人类的优先刺激活动 iNKT细胞分别使用小鼠杂交瘤，所述小鼠杂交瘤共同置于人类不变的Vα24-Jα18/Vβ11链条（11），指定小鼠Vα24杂交瘤，并使用该杂交瘤作为响应细胞。如图3所示⇑B当使用小鼠Vα24杂交瘤作为响应细胞时，GCK127在小鼠Vα14杂交瘤上的卓越刺激活性完全减小。在鲜明的对比度下，GCK152表现出两倍更强的刺激活动（p <0.05）对小鼠Vα24杂交瘤，由IL-2分泌水平确定。
完全，结果如图所示。 2⇑ 和 3⇑ 表明糖脂对人VS鼠的优先刺激活性 iNKT细胞似乎受到InvtCR种类的来源而不是CD1D分子的来源。这些发现导致我们进一步研究两种糖脂对CD1D的结合亲和力，以及 i人对鼠标的NKT细胞。
为了评估糖脂-CD1D相互作用的强度，将生物素化18：1 PE脂质用作我们的测定中的指示剂，因为18：1 PE脂质，其具有与α-Galcer的脂质部分类似的二酰基甘油，但缺乏一个显示糖部分，显示结合CD1D分子（15）没有被识别 iNKT细胞。我们确实证实，装载到CD1D上的18：1 PE脂质：IgG二聚体未能染色 iNKT细胞，尽管它保留了竞争性地抑制染色的能力 i具有CD1D的NKT细胞：IgG二聚体加载αGircer（数据未示出）。因此，我们开发了一种新的竞争性结合ELISA，用于研究CD1D和糖脂，即GCK152和GCK127之间的分子相互作用，与INVTCR识别无关。通过该测定，我们能够确定GCK152和GCK127的结合到人和小鼠CD1D分子（图4⇓A）。有趣的是，GCK152一贯显示6到8倍的下部IC50（p <0.05）比竞争性结合ELISA中的人和小鼠CD1D分子比GCK127，因此表明GCK152对CD1D分子具有更强的亲和力，无论它们的原点如何。鉴于对人对鼠的两种C-糖苷类似物的不同生物活性 iNKT细胞（图2⇑ 和 3⇑），似乎糖脂对CD1D分子的结合亲和力不会转化为其活性的强度 iNKT细胞。
GCK127和GCK152对人VS小鼠CD1D分子的相对结合亲和力，以及针对人的VS小鼠 iNKT细胞。 A, A competitive ELISA against CD1d dimer, using 18:1 PE lipid. After being coated with anti-mouse IgG1 Ab overnight, Maxisorp ELISA plate was incubated with hCD1d: mIgG or mCD1d: mIgG dimer for 2 h. Serially diluted glycolpids were then added onto the plate in the presence of 1 μg / ml 18：1生物素聚合物。在37次孵育24小时后°C, bound 18:1 Biotinyl PE lipid was determined with HRP-labeled Avidin and TMB substrate. Inhibition curves were fitted with Sigmoidal dose-response formula using Prism 4.0 software. B，染色 iNKT细胞具有连续稀释的PE标记的CD1D-糖脂复合物。 PE标记的HCD1D：MIGG二聚体或PE标记的MCD1D：MIGG二聚体装载1000摩尔比过量的GCK127或GCK152。然后连续稀释糖脂-HCD1D二聚体复合物或糖脂-CMD1D二聚体复合物并与人孵育 iNKT细胞或鼠标1.2 i分别与FITC标记的抗CD3εmAb一起分别为30分钟的NKT杂交瘤细胞。洗涤两次后，用CD3留下细胞并用FACS LSRII仪器进行分析。 GraphPad Prism软件装订了绑定曲线。然后对结合等温物进行旋转转变，以进入亲密的表观平衡解离常数特性，并产生 KD 价值。 C，竞争染色 i具有糖脂-CD1D二聚体复合物的NKT细胞。用1000摩尔比过量的α-高利剂加载联素键菌素标记的CD1D二聚体以形成α-高压运动-CD1D-联合粘蛋白络合物。 PE标记的CD1D二聚体加载1000摩尔比过量的GCK127或GCK152，分别形成GCK127-CD1D-PE或GCK152-CD1D-PE复合物。人类 iNKT细胞或鼠 iNKT hybridoma cells were stained for 30 min with 10 μg / ml fitc标记的抗cd3ε用4纳米捣蛋α-galcer-HCD1D-联合蛋白复合物或3 nmα-GalCer-mCD1d-allophycocyanin complex, respectively, in the presence of serially diluted GCK127-hCD1d-PE or GCK152-hCD1d-PE complex for human iNKT细胞，或用于鼠标的连续稀释GCK127-MCD1D-PE或GCK152-MCD1D-PE复合物 iNKT hybridoma cells. After washing twice, the cells were gated with CD3 and analyzed with FACS LSRII instrument. The degree of percentage inhibition of α-galcer-HCD1D-荧光蛋白荧光或α-Galcer-MCD1D-联霉素荧光分别针对GCK127 / GCK152-HCD1D-PE或GCK127 / GCK152-MCD1D-PE复合物的浓度绘制。使用棱镜4.0软件配备抑制曲线含有乙状剂量 - 响应公式。 Asterisk根据结合曲线的计算指示预测的IC50。在所有实验中，结果表示来自每个样品的三份孔的平均值，并表示为平均值± SD. Compared two curves by t 测试统计分析， p <0.05被认为是显着的差异。
确定糖脂-CD1D复合物与Invtcr的结合亲和力 iNKT细胞，我们使用了基于FACS的方法来评估糖脂-CD1D复合物和Invtcr之间的亲经，如前所述（16）。在该测定中，我们用GCK152或GCK127加载了PE标记的人或小鼠CD1D：IG二聚体。然后我们弄脏了人 iNKT细胞或鼠 iNKT杂交瘤细胞具有连续稀释量的每种CD1D二聚体 - 甘油脂复合物和以PEFFOMED FACS分析。
因为糖脂加载的CD1D二聚体污渍 iNKT细胞通过与其Invtcr相互作用，可以合理地说，该方法可以评估糖脂-CD1d复合物与TCR的结合强度。我们发现，用GCK152负载的人CD1D二聚体表现出5倍的耐酸性（p < 0.05) to human iNKT细胞比加载GCK127，并以鲜明的对比度，用GCK152负载的小鼠CD1D二聚体显示出2-3倍的耐酸性（p <0.05）与GCK127一起装载（图4⇑B）。这些结果表明GCK152和GCK127作为与CD1D分子的复合物，对人类VS鼠标的Invtcr具有不同的亲密性 iNKT细胞，GCAN152-HCD1D复合物具有比GCK127-HCD1D复合物更强的亲密性，反之亦然，GCK127-MCD1D复合物具有比GCK152-MCD1D更强的耐抗体。
进一步确认糖脂-CD1D复合物与Invtcr之间的相互作用的亲和力 iNKT细胞，我们使用了用α-高压糖（α-高压运动-CD1D-联合粘蛋白）的联素聚糖标记的CD1D：Ig二聚体，作为指示剂，并连续稀释的PE标记的CD1D：Ig，装有GCK127或GCK152，作为竞争对手。简要介绍，人类或老鼠 i在连续稀释的GCK127-CD1D-PE或GCK152-CD1D-PE复合物存在下，用4nMα-高压运动-CD1D-联合蛋白复合物染色NKT细胞。然后，通过FACS分析确定平均荧光强度，并计算它们的IC 50（图4⇑C）。
我们发现GCK127-HCD1D复合物的IC50对抗α-高利剂-HCD1D与人的复合物 iNKT细胞超过5倍（p <0.05）大于GCK152-HCD1D，而GCK127-MCD1D复合体需要3倍的量（p <0.05）比GCK152-MCD1D抑制50％的α - Galcer-MCD1D与鼠结合 iNKT细胞（图4⇑C）。这些结果表明，GCAN152-HCD1D复合物对人类Invtcr具有比GCK127-HCD1D更强的亲和力，反之亦然，GCK127-MCD1D复合物对小鼠Invtcr的亲和力比GCK152-MCD1D更强。
统称，所有结合测定都导致了结论，尽管GCK152对人和小鼠CD1D分子具有比GCK127具有更强的亲和力，但GCK152-HCD1D复合物具有比GCK127-HCD1D更强的亲和力，而GCK127-MCD1D复合物具有更强的亲和力。对鼠标Invtcr的亲和力比GCK152-MCD1D更强。
讨论
在我们之前的研究中，在α-高利剂的C-糖苷类似物中，在糖和脂质部分之间具有E-烯烃接头，显示出在酰基链尾的芳环的GCK152，显示出更强的刺激活性对人类 iNKT细胞比GCK127相比，其具有几乎相同的脂肪酰基作为α-高级剂（8）。我们还表明，与人类相反 iNKT细胞，GCK152对鼠展示了更弱的活动 iNKT细胞比Vivo和体外套（8）。这种针对人类对鼠刺激活动水平的突出差异 i通过这两种C-糖苷的NKT细胞促使我们在我们目前的研究中调查这两个结构相似的糖脂导致这种相反的活动的主要原因。
最近的晶体结构研究表明，α-高压运动器的脂质部分以几乎相同的方式以几乎相同的人CD1D和小鼠CD1D分子的粘合槽。18, 19）。最近，已经证明了Invtcr通过独特的“锁和钥匙”模式识别糖苷头（20）。类似的结构研究表明，Invtcr的CDR2β环主要与CD1D骨架相互作用，CDR1α和CDR3α环的种系编码残留物通过与CD1D和结合的α-高压糖分子相互作用来识别α-高利剂（ 21）。因此，通过这主要是刚性锁定和关键的相互作用，CDR环绕与α-Galcer-CD1D复合物联系的CDR回路在连接上的α-Galcer-CD1D复合物的最小变化构象，表明通过Invtcr的识别 iNKT细胞高度保守。早期的研究表明糖部分的α-异常构象对此至关重要 iNKT细胞活化和β-半乳糖基胺或甘露那胺酰胺未导致增殖性反应 iNKT细胞（22）。然而，最近的一些研究表明，Invtcr的识别具有多样性，尽管有限的程度，所以某些农糖α-高级糖和β-连接的糖糖脂溶脂能够激活 iNKT细胞（23, 24）。假设是Invtcr中CDR3β序列中的高度变异性 i与复合物内的这种环的位置相结合的NKT细胞可能为不同的CD1D限制AGS提供INVTCR识别的可塑性（20）。虽然半乳糖头定位在小鼠和男人的CD1D-α-高压运动骨架结构之间达到了3Å的偏移（25），一些研究表明，人和小鼠之间存在交叉反应性的差异 i具有来自两个物种的α-高压运动CD1D复合物的NKT细胞（13, 21, 26），因为Invtcr识别的可塑性。
在我们目前的研究中，尽管GCK152和GCK127具有相同的α-烯烯键，但是当与人和小鼠CD1D分子的复合物呈现时，它们向人和小鼠Invtcr显示出不同的亲和力。因为GCK152和GCK127之间的唯一差异是它们的脂质部分，所以脂质链与CD1D分子结合应导致糖脂的糖头的次要构象偏移。这种转变可能超出了Invtcr识别的可塑性，优先识别人类对鼠标Invtcr的这种转变。我们的研究意味着如果不是人类和老鼠的识别之间的识别之间应该存在显着，如果不是一个重要的差异 iNKT细胞。此外，这种差异可能部分地考虑了一些α-高压运动类似物对小鼠的不同生物活性 iNKT细胞。虽然Invtcr认可被认为是高度保守的，但我们的研究呈现出仍有一些限制特异性的功能证据 iNKT通过Invtcr激活。在这方面，在设计下一代CD1D绑定时，不应忽略Invtcr限制的效果 iNKT刺激糖脂。最后，鉴于对小鼠invtcr-glycolipid-mcd1d复合物结构的最新X射线晶体学研究，其中通过Vβ8.2和Vβ7半invtcr对CD1d-α-高压运动的差异识别 iNKT细胞已被揭示（27）我们的发现进一步意味着，在阳性选择时，小鼠或人类invtcr用于保守内源性脂质的亲和力可以塑造两种物种中的不同Vβ使用。
总之，具有除酰基链之外具有相同结构的两个C-糖苷类似物，GCK152和GCK127，显示出对人VS鼠的不同生物活性 iNKT细胞。通过一系列结合测定，发现这种不同的活性与糖脂-CD1D复合物与人类VS鼠的inctcr的结合亲和力相关 iNKT细胞而不是人或鼠CD1D分子的糖脂的细胞。通过实验，其中人和小鼠之间的交叉反应性 i检查了来自两个物种的糖脂呈递APC的NKT细胞，我们发现了 iNKT细胞，但不能表达CD1D的APC，影响物种依赖性，优先活性的C-糖苷。此外，使用表达小鼠CD1D的HeLa细胞，作为表达人类Invtcr的APC和小鼠杂交瘤，作为响应细胞，我们能够确定Invtcr种类的起源，但不具有CD1D分子，命令C-的生物活性糖苷。这些研究表明，对InVTCR而不是CD1D分子的亲和力似乎治理了塑造C-糖苷类似物的生物活性的强度 i不同物种的NKT细胞。
致谢
我们感谢Drs。 Vincent Sahi和Raquel Garcia-Navarro有助于FACS分析。我们还感谢Drs。 Mitch Kronenberg，Chyung-Ru Wang，Steven Porcelli和Kirin Brewery提供鼠标 iNKT杂交瘤1.2和A20-MCD1D，PCDNA3-CD1.1，Hela-HCD1D或α-高层。
披露
作者没有财务利益冲突。
脚注
本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此，本文必须明白 广告 按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
↵1 这项工作由国家卫生院校资助R21 AI062842和R56 AI070258（至MT），Cytheris，Otsuka制药公司，艾琳钻石基础，比尔和梅林达盖茨基金会，来自N01-AI-25456-MODNO.5的分包（到rwf）和意大利癌症研究和意大利卫生部协会（GC和PD）。
↵2 地址对应和转载对M. Tsuji，HIV和疟疾疫苗计划，奥朗·钻石艾滋病研究中心，罗克费尔大学，纽约，NY 10016.电子邮件地址： mtsuji {at} adarc.org
↵3 本文中使用的缩写： iNKT，不变的NKT细胞; Invtcr，不变的T细胞受体; α-高压糖，α-半乳糖基胺; DC，树突细胞。
- 已收到 2009年3月31日。
- 公认 2009年7月24日。
- 版权所有©2009由美国免疫学家，Inc。
