抽象的
T细胞的激活和分化取决于受免疫环境，AG的性质以及APCs的活化状态影响的许多启动事件。在本研究中，我们研究了特定凹口配体，δ状4（DLL4）的作用。特别地，我们的数据表明DLL4通过在树突细胞上的TLR激活而不是早期反应炎症细胞因子，IL-1和IL-18的病原体相关信号诱导，所述IL-1和IL-18也通过MyD88适配器通路激活细胞。我们从体外培养的观察结果证实了早期的报道，证明DLL4抑制TH2细胞因子产生。此外，DLL4在存在另外的偏斜细胞因子，IL-6和TGF-β的情况下，影响产生IL-17产生的T细胞的产生。在没有缺口信号的情况下，即使在特异性偏斜条件下，IL-17产生显着抑制。这些研究进一步证明了DLL4上调rorc.在T细胞中表达和两者rorc.和IL17.基因启动子是直接转录的缺口靶，进一步增强Th17细胞群的分化。因此，促进有效的T细胞分化可取决于通过特异性凹口配体刺激激活T细胞。
在致病性损伤期间获得的免疫反应的诱导取决于致病信号的快速识别，然后开始引起适当的获得性免疫应答。已经显示特定信号在识别病原体相关分子模式（PAMP）后诱导这些信号2 促进强激活信号诱导先天细胞活化。 TLR在初始活化方案中涉及，迅速促进免疫应答的激活，包括先天细胞因子生产，MHC分子表达和共刺激分子活化（1, 2, 3）。在这些初始事件之后，随后的AG呈现和T细胞激活由APC决定。 TLR诱导的事件主要取决于由MyD88适配器蛋白依赖性激活引发的特定信号通路，导致树突细胞（DCS）和其他APC种群的成熟（2, 4, 5, 6）。最近鉴定在APC上诱导的MyD88依赖性分子系列是缺口配体，可以改变T细胞活化的过程（7, 8, 9, 10）。
缺口是最初显示的受体系统，可参与细胞分化和生存。陷波信令由凹口受体的配体接合引发。有四种缺口受体（N1-4）和五种缺口配体（Delta样（DLL）1,3和4;锯齿状1和2）（11, 12）。在δ样或锯齿状配体的结合后，凹口经历受Adam蛋白酶和γ分泌酶复合物催化的蛋白水解裂解，导致凹口细胞内结构域（N-ICD）易位到细胞核中。 Cononally Notch与转录抑制器RBPJ-κ（CSL）相互作用。 N-ICD与RBPJ-κ取代来自RBPJ-κ的转录核心压力的N-ICD交互，还招募了MasterMind（MAML）蛋白。 N-ICD-RBPJ-κ-MAML的新转录复合物将RBPJ-κ转换为转压缩的转录激活物（11, 12, 13）。在过去几年中，已经显示了这种复杂的信号和激活系统，以确定免疫细胞群中的命运决策，包括DC，B细胞和T细胞（13）。似乎取决于在激活期间使用DCS（δ样或锯齿状）上的配体（δ样或锯齿状）的配体，可以指定T细胞分化的特定过程（8, 14）。通过遗传模型通过条件缺失的缺陷缺陷激活遗传模型仍然是CD4上的MAML的显性负形式的表达的遗传模型。+ T细胞已经证明了Th2型，但不是Th1型响应取决于陷波信号通路和上方 Gata3 activation (7, 10, 15）。虽然通过条件缺失的RBPJ-κ或MAML的显性负形式的表达没有看到缺陷（IFN-γ）反应，但γ-分泌酶抑制剂（GSI）介导的凹口抑制缺乏IFN-γ生产（9）。最近的研究表明，δ状1和4似乎调节Th2细胞因子产生，因此调节外围效应器T细胞的分化电位（16, 17）。然而，总体而言，存在对NOTCH信令对T细胞激活事件的调节的作用的限定信息很少存在。这是通过证明凹口可以参与TH1，TH2以及TH2以及THREG细胞分化的研究进一步举例说明7, 8, 9, 10, 18, 19），取决于衍生应答的配体，免疫环境，遗传构成或疾病模型。
一系列研究检查CD4+ T细胞分化进一步根据其生产IL-17，IL-21和IL-22的能力（）进一步确定了一种新型的T细胞类T细胞（20, 21）。 T细胞的这种谱系被称为Th17，已被证明是在自身免疫，牛皮癣和其他几种慢性疾病中的致病性。 IL-17系列含有六个成员（IL-17A-F），IL-17A被指定为原型IL-17细胞因子。随着其诱导快速中性粒细胞积累的能力，IL-17的产生可以在粘膜位点的细菌感染期间提供优先先天免疫的手段。尽管Th17细胞的调节尚未完全定义，但是对于Th17分化需要IL-6和其他STAT3与TGFβ一起启动细胞因子。除细胞因子信号外，转录因子RORC还需要进行TH17分化所需的（22）。因此，已经出现了大量的文献中的作用和调节慢性免疫应答期间的作用和调节。
在本研究中，我们提供了DLL4提供了额外的偏斜信号，以通过上调驱动Th17 rorc.，同时限制Th2细胞因子生产。 IL-17生产缺陷依赖性和直接相关的CSL rorc.和IL-17 promoter regions that contained CSL binding sites. Thus, these studies may define a critical activating scheme for generation of this class of T cell during chronic diseases, such as autoimmunity, potentially via TLR-mediated signals that would specifically drive Dll4 up-regulation on APC. These data support our recent observation that treatment of mice with anti-Dll4 during mycobacteria protein-induced pulmonary granuloma formation reduces Th17 cytokine production (23）。
材料和方法
体外CD4+ T cell culture
磁珠隔离CD4+CD62L+CD25− 使用MACS系统（Miltenyi Biotec）纯化脾幼稚T细胞。简而言之，CD4+ 使用抗CD4分离T细胞+ 磁珠通过负选择。 CD62L.+ 然后从CD4中富集细胞+ 使用抗CD62L的T细胞群+ 珠子通过阳性选择。然后在平底96孔板（Luminex分析）或六孔板（蛋白质印迹和染色质免疫沉淀（芯片）测定中培养细胞。在不同的偏斜条件下激活细胞。条件：OVA肽（1μg/ ml），抗IL-4（10μg/ ml）和抗IL-12（10μg/ mL）; TH2条件：卵肽，抗IFN-γ（10μg/ mL）; TH17条件：来自BALB / C或C57BL / 6或IL-17的CD4 T细胞的板结合抗CD3（1μg/ mL）和可溶性抗CD28（1μg/ mL） - / - 用于从DO-11.10小鼠的T细胞的小鼠或OVA肽与TGFβ1（2ng / ml），IL-6（20ng / ml），抗IL-4（10μg/ ml）和抗IFN-γ（ 10μg/ ml）。使用终浓度为2.5μg/ ml的板结合重组DLL4（RDLL4）。
骨髓生成（BM）的DCS
BM从未感染的幼稚小鼠收获，并在10次以T-150组织培养烧瓶中播种624）。
量化细胞因子和转录因子
使用在制造商的指示之后使用TrizoL（Invitrogen）从CD4 T细胞中分离总RNA，并在25μL体积中逆转录。通过针对GAPDH，IL-17A和RORγ-T（Applied Biosystems）的棱镜7500序列检测系统，用棱镜7500序列检测系统用棱镜7500序列检测系统中测定mRNA表达。从Sigma-Aldrich购买DLL1，DLL4，JAG1，JAG2和GATA3的SYBR引物集，并以前描述（ 8）。结果归一化为GAPDH表达，并作为对照组的mRNA表达的折叠增加而呈现。使用从Bio-rad Laboratories购买的生物plex珠粒基（Luminex）细胞因子测定来定量细胞因子的蛋白质水平。
Western Blot.
在制造商的协议之后，使用来自Pierce的Ne-un核和细胞质提取试剂盒制备细胞质或核提取物。通过SDS-PAGE分离等量的蛋白质并在硝酸纤维素膜上转移。用伯ABS探测膜：兔抗切割凹口1（Val 1744）（电池信号传导技术）;磷; TOTAL 3，（小区信令技术）;和抗小鼠单克隆β-肌动蛋白（Sigma-Aldrich）。随后与适当的过氧化物酶 - 缀合的次级孵育。用ECL Western印迹检测试剂（Pierce）开发膜。在所有实验中，使用β-肌动蛋白作为负载控制。
老鼠
从杰克逊实验室获得C57BL / 6，BALB / C和DO11.10小鼠。 C57BL / 6. IL17. - / - 小鼠是K. Eaton博士的礼物（密歇根大学，安娜堡，MI）。所有小鼠都在密歇根大学的实验室动物药物单位中保持了所有小鼠的特定病原体设施。实验中使用的小鼠是年龄，菌株和性别匹配。
细胞内流式细胞仪
CD4+ 将T细胞以2×10培养36小时5 在存在或不存在DLL4的TH17条件下，96孔板中的细胞/100μl。根据制造商的说明，Brefeldin A和Monensin被添加为最后6小时的文化。收获细胞，洗涤两次，并重悬于1％FCS缓冲液中，并通过加入抗CD16 / 32阻止Fc受体。然后，根据制造商的96孔板在96孔板中的最终体积为200mL的指示，用MAb染色MAb，在96孔板中在4℃下进行20分钟。对于细胞内染色，根据制造商的指示，使用Cytofix / Cytoperm以及固定/渗透试剂盒固定和透露细胞的过量表面污渍，固定和透化，并在黑暗中在4℃下使用抗IL-17 AB染色30分钟。最终洗涤细胞并重新悬浮在200μl染色缓冲液中并通过流式细胞术分析。在BD-LSRII系统流动速度仪（BD Biosciences）上，在细胞表面和细胞内分子中获得至少20,000个事件。所有试剂均购自BD Pharmingen。
芯片测定和引物
根据制造商的说明，使用测定套件（Upstate Biotechnology）进行芯片程序。简而言之，1×106 isolated CD4+ 在存在或不存在RD14持续20小时的情况下，T细胞在Th17条件下偏移。然后在37℃下将DNA-蛋白质结构通过1％甲醛交联10分钟。收集细胞并在400μLSDS裂解缓冲液中裂解并裂解。将所得裂解物超声处理以在下面的条件下使用布兰松超声器450（VWR）在200至1000bp范围内的DNA片段：每个30秒的四次。离心后，稀释含有染色质的上清液，并省去等分试样（4％体积）以指示每个样品中的输入DNA。将剩余的染色质级分含有鲑鱼精子DNA /蛋白A琼脂糖珠，其次用以下ABS免疫沉淀：抗RBPJ-κ/ CSL mAb（Cosmo Bio）或对照抗大鼠IG（杰克逊免疫研究实验室）在4°C下过夜温和旋转。交联在65℃下反转4小时，然后用蛋白酶K消化。通过标准酚/氯仿和乙醇沉淀纯化DNA，并进行SYBR绿色实时PCR。小鼠启动子引物如下 RORγ-T： 前进，5'-cccctcacctctcaatttgc;反向，5'-GCTTCTAGATGCTTCCCATACTTCTG; IL-17P1：前进，5'-TCTGCTTGACTCGATTTTCAGGTA;反向，5'-gacgtgtgatgtcatctcaaaatg; IL-17P2：前进，5'-caattgctcctccaaggacaag;反向，5'-ctggctttgagaagaacggatt; IL-17P3：前进，AATTCAAGGAGTTCATGCTTCTCA;反向，5'-gctcacacacacctctgattgc。基于如前所述的IL-17基因的启动子区衍生出这些序列（25, 26）。
重组蛋白ABS和化学品
统计数据
结果表示为平均值±SE。统计学意义由学生的决定 t 用Newman-Keuls帖子测试测试或单向ANOVA。认为显着的差异被视为 p < 0.05.
结果
通过TLR但不是细胞因子响应的甜点配体δ样的上调
在先前的出版物中，通过致病性刺激引发DCS上的Notch配体的上调，表明δ样蛋白依赖于MyD88介导的信号（16, 18）。为了进一步验证这些响应并确定其规定的程度，我们的研究检查了许多与病毒和/或炎症反应有关的刺激。这些包括TLR特异性信号，聚（I：C）（TLR3），LPS（TLR4）和CPG（TLR9），以及通过钻机I和TLR介导的途径激活的呼吸道合胞病毒。我们以前的研究概述了DLL4在调节呼吸道合胞病毒感染期间调节TH2细胞因子反应的作用。所有这些刺激明显上调δ状4并呈较小程度的δ状1，但没有显着诱导锯齿状1和锯齿状2表达（图1⇓）。此外，我们还刺激了IL-1β和IL-18的DC，两种IL-1R系列MyD88依赖性信号，但它们没有诱导任何凹口配体的表达。这些数据共同反映了Th1诱导TLR致病信号促进δ样而不是锯齿状的陷波分子的想法。
图1。
通过TLR但不是炎症细胞因子的甜点配体δ样的上调。用不同的TLR配体或24小时刺激BM衍生的DCS或用单独的细胞因子刺激。在收获刺激后，收获总RNA，转录到cDNA的逆转，并用于不同的凹口配体的Sybr绿色实时扩增。数据被归一化为保持基因GAPDH的房屋。数据表示为平均值± SE and *, p <0.05被认为是显着的。
TLR介导的IL-17响应的刺激取决于刺激和DLL4
鉴于上述观察结果表明TLR激活后DLL4的上述调节，我们对调查可能推动特定细胞因子生产型材的TLR刺激条件感兴趣。我们使用来自TCR转基因DO-11.10小鼠的全脾细胞，并在存在或不存在抗DLL4 AB的情况下用OVA或OVA和LPS刺激它们。上述研究表明，LPS优先诱导强的DLL4表达。数据表明，用OVA刺激细胞不能驱动IL-17生产，与OVA无法诱导DL4在DC（数据未示出）中的无能为力。然而，在接受OVA和LPS（用对照AB）的基团中，IL-17生产中存在稳健增加，这是通过用抗DLL4 AB治疗细胞而显着抑制的（图2⇓）。我们还观察到使用OVA和LPS（有效的TH1诱导剂）的IFN-γ的显着增加，但是抗DLL4在调节TH1响应方面没有显着效果。在一起，数据表明DLL4在IL-17生产中的DLL4在TLR激活中调节的新颖作用。
图2。
TLR，DLL4介导的IL-17生产。 DO-11.10脾细胞用OVA或LPS刺激，或者在存在或不存在DLL4 AB中刺激48小时。使用Luminex系统测量细胞因子水平。实验以三倍一次重复两次，数据表示平均值± SE. *, p ≤ 0.02.
在随后的实验中，设立以评估特定的DLL4激动剂反应在免疫应答的分化中的作用，我们使用分离CD4+ 在存在或不存在DLL4或jagged1的情况下，在Th17偏斜条件（IL-6，TGF-β，抗IL-4和抗-IL-4）下，用抗CD3和抗CD28激活BALB / C小鼠的T细胞。 （JAG1）蛋白质，作为先前的研究已经认识到，这两个配体对T细胞分化具有差异影响。我们检查了DLL4差异改变了IL-17生产。在初级响应时，当DLL4与Th17偏斜细胞因子一起提供时，IL-17产生大大增强，并且显着抑制了Th2细胞因子IL-5和IL-13，而IFN-γ保持不变（图3⇓A）。相比之下，Notch配体jagged1对任何细胞因子没有影响，进一步证实了DLL4在IL-17生产中的特定调节作用。当使用更长的Th17偏斜状态时，使用二级CD3 / CD28刺激，使用DLL4，进一步增强IL-17生产（图3⇓B）。我们进一步检查了对DLL4产生的增加的IL-17是由于CD4的数量增加+ 产生IL-17的T细胞发现，尽管DLL4能够在初级偏移条件下略微增加产生T细胞的IL-17的数量（图3⇓C），这种增加并不统计学意义。
图3。
DLL4在Th17偏斜条件下调节T细胞应答。 A, CD4+ 在Th17条件下在培养基中或在RD14（2.5μg/ ml）存在下的条件下激活T细胞，或RjAG1（0.5μg/ ml），并分析上清液的表明细胞因子。 B, CD4+ T细胞在Th17条件下区分或不存在RDLL4的条件下5天，休息3天，然后用板结合的抗CD3和可溶性抗CD28重新诱导活细胞24小时。在刺激之后，分析了上清液的IL-17。每个实验重复至少四次，结果相似。数据表示为平均值±sem和*， p ≤0.05被认为是显着的。 C如上所述，将T细胞活化36小时，并将蛋白质转运抑制剂的混合物加入到培养物中，以在刺激的最后6小时中加入培养物中。然后通过流式细胞术收获细胞以用于CD4表面染色和IL-17细胞内染色。 IL-17. + 细胞在CD4上被静态+ T细胞。 D，Mac纯化了CD4+ 来自wt和的t细胞 IL17. - / - 在Th17条件下刺激小鼠，使用Luminex系统对48小时进行分析上清液的表明细胞因子。数据表示平均值± the SEM and *, p = 0.004.
以前的研究表明了δ样配体在抑制Th2反应中的作用，并且我们对改变的TH2响应是否可能是由于偏斜条件本身或直接通过IL-17介导。进一步证实，我们审查了IL-17本身的潜在监管作用。孤立的CD4.+ 来自野生型（WT）和IL-17敲除小鼠的T细胞（IL17 - / - 在Th17偏斜条件下，用抗CD3和抗CD28刺激小鼠的小鼠，并在DLL4的情况下刺激。 WT中的IL-17水平显着增加，当然，敲除小鼠没有增加（图3⇑D）。然而，我们观察了WT和IL17中的IL-13生产类似模式 - / - 老鼠。因此，IL-17本身对TH2细胞因子反应没有调节作用。
DLL4诱导IL-17生产是必需的凹口激活
为了验证DLL4的添加是通过凹口受体介导的信号传导事件诱导响应，我们的研究在TH17偏斜培养物中使用GSI。 GSI通过抑制来自膜相关的缺口受体的N-ICD的切割而特异性抑制缺口活化。我们的数据表明孤立的CD4+ 在DLL4 IL-17的存在下，将T细胞与GSI一起孵育显着降低（图4⇓A）。为了验证DLL4在TH17条件下激活凹口信令途径，从CD4制备裂解物 + T细胞并在存在和不存在DLL4中刺激。我们观察到N-ICD的核积累增加了DLL4刺激，从而表明DLL4导致N-ICD在这些条件下切割（图4⇓B）。为了验证DLL4诱导其他TH17途径细胞因子和细胞因子受体，在TH17分化中发挥至关重要的作用，我们评估了IL22和IL23R，并在DLL4时与IL17A和IL17F（IL-17系列成员）上调，当DLL4时存在（图4⇓C）。此外，为了验证在规范缺口途径中发生信令，我们还评估了HES5并观察到添加DLL4后的预期增加的表达。总的来说，我们的数据表明DLL4使用陷波信令增强早期Th17差异化。
图4。
在CD4中的DLL4增强IL-17生产是必需的凹口激活+ T细胞。 A, CD4+ T细胞是从BALB / C小鼠的脾脏纯化的MAC，并且在存在或不存在DLL4或GSI或对照（DMSO）的情况下在TH17条件下偏离48小时。分析上清液用于IL-17生产。该数据代表三份确定剂的平均值±SEM，代表四个独立实验。 *， p = 0.004; **， p = 0.002。 B, CD4+ T细胞是从脾脏BALB / C小鼠纯化的MAC，并且在存在或不存在RD14的情况下在TH17条件下偏见4小时或20小时。通过蛋白质印迹分析全细胞裂解物，用于N-ICD，β-肌动蛋白用作负载控制。实验重复两次，结果是相似的。 C，使用与上述DLL4相同的条件增强不仅增强 IL17.a 但也是mRNA表达 IL17.f, IL22，IL23R.，和陷波途径靶基因 Hes5. Data represent the mean ±来自三个单独的实验。
DLL4的RORC转录因子表达的调节
先前的研究表明，Notch / Notch配体相互作用差异地调节T细胞中特定转录因子表达的表达。特别是，最近使用小鼠在CD4上表达活性凹口的研究+ T细胞表明，没有陷波信号传导Th2细胞不能区分，而TH1响应可以进行（7, 10, 15）。使用基因改性动物的后一种研究进一步检查并得出结论，缺乏Th2显影与GATA3活化有关。在本研究中，我们对DLL4存在的IL17的增强表达是否与RORC表达有关，对于TH17分化的所需转录因子。当在分离的CD4中检查RORC表达时+ 在Th17偏斜条件下刺激的T细胞显着诱导和进一步增强，当时细胞以时间依赖的方式孵育DLL4（图5⇓A）。此外，在TH17偏斜条件下，GATA3表达的协调降低，但DLL4没有额外的变化。
图5。
转录因子的差异调节 rorc.和Gata3 通过DLL4。 A, CD4+ 在存在或不存在RDLL4的情况下在Th17条件下刺激T细胞以进行不同的时间。提取总RNA，逆转录，并使用特异性引物扩增cDNA rorc. or Gata3。数据表示为平均值±SEM。 *， p = 0.031。 B, CD4+ T cells were stimulated under Th17 conditions in the presence or absence of rDll4 for different time points as indicated. The whole cell lysate was then analyzed by Western blot for phosphorylation of STAT-3. β-Actin被用作加载控制。
分化Th17的第二种所需因素是Stat3蛋白激活（27, 28）。在类似的研究中，我们在Th17偏斜期间检查了STAT3的激活/磷酸化，以确定DLL4是否诱导分离CD4中活化STAT3的增加+ T细胞。图5中的数据⇑B 表明，虽然在Th17偏斜条件下提高了STAT3磷酸化，但在TH17偏置培养条件下，DLL4的存在下没有改变STAT3活化。因此，DLL4存在下的增加的IL-17似乎与RORC的表达增加相关，但不改变STAT3激活。
缺口与rorc和IL17含有CSL结合位点的启动子区域的相互作用调节IL-17生产
确定陷波可能会调节的可能性 rorc. 和/或 IL17. 直接，我们搜索了上游内部的CSL（RBPJ-κ，转录因子）绑定站点 rorc.和IL17. 推动者区域。我们检测到一个网站 rorc.和three putative sites on IL17.A 基因座。 CSL绑定站点的共识 rorc. 在翻译起始网站上游（TSS）上游为0.56 kB。引物组侧翼CSL结合区域 rorc. 设计用于通过定量RT-PCR扩增免疫沉淀的芯片DNA（图6⇓）。 CD4+ 在Th17偏裂条件下在20小时的情况下在DLL4的存在或不存在下处理T细胞，并用抗CSL mAb免疫沉淀。我们选择了20小时，因为在我们的系统中，我们在同一时间检测到强大的陷波激活。我们的数据表明推定的CSL绑定站点 rorc. 在TSS的上游对于CSL结合和CSL结合的丰富是至关重要的 rorc. 与没有DLL4的Th17偏斜组相比，在DLL4存在下，在Th17偏斜条件下显着增加。通过在免疫沉淀过程中使用对照Ig来确定相互作用的特异性。这些数据与DLL4治疗的能力相关，以增加表达 rorc. 上述mRNA表达。
图6。
rbpj-κ (CSL) directly interacts with rorc. 启动子。图表 rorc. 示出了外显子1上游的CSL结合位点（下划线）5'的启动子，并设计了向前和反向引物以扩增所示的区域。 MACS净化脾脏CD4+ 在Th17条件下刺激T细胞20小时并固定芯片。 ABS用于IP是抗CSL（αCSL）和控制Ig（CIG）。 IP之前的总输入DNA用于数据的标准化。图表表示富含富含比例的定量PCR分析 rorc. 促进剂与CSL结合位点到输入DNA。使用CSL结合位点使用 rorc.-specific promoter primers. Data represent mean ±三种独立实验的代表均以三份进行。
类似于鉴定CSL结合位点的鉴定 rorc. 我们的研究还检查了IL-17启动子区上的推定结合位点。 CSL绑定站点上 IL17. 在〜2,2.4，2.4和4.7kb上鉴定出版物的转化起始位点上游，侧翼引物组设计用于具体扩增使用定量PCR的芯片DNA（图7⇓）。如上所述，使用20-H时间点来检查抗CSL免疫沉淀的DNA，用于在存在或不存在DLL4活化的情况下结合。检查所有三种共有CSL结合位点，只有转录开始点上游的结合位点2.4kb（p2）都证明了DLL4处理后CSL结合的增加（图7⇓A）。 1.2 kB（p3）位点没有明显的效果，4.8 kB位点对指示非必要CSL结合位点的相互作用增加了更适度的增加。为了进一步研究对缺口活化的结合的特异性，在GSI的存在或不存在下，将类似的研究与DLL4治疗组建立，以阻断N-ICD切割。图7中的数据 ⇓B 证明CSL与CSL的结合增加了 IL17. 使用GSI时，TSS上游的促进剂区域显着降低。我们的观察结果表明，在CD4中调节IL-17生产中的缺口使用的两种可能的新机制+ T细胞。首先，N-ICD / CSL可以直接相互作用并增加转录因子的表达 rorc. 已显示在CD4中促进Th17分化+ T细胞第二，N-ICD / CSL可以直接与之交互 IL17. 特定推定的CSL结合位点的启动子2.4 kB在外显子1和上调上游 IL17. expression.
图7。
rbpj-κ (CSL) directly interacts with IL17. 特异性结合位点上的启动子。 A, CD4+ 在Th17偏斜条件下在存在或不存在的情况下激活T细胞。然后将细胞固定为芯片。使用抗CSL AB进行IP。将IL-17启动子（P1，P2和P3）上的三个CSL结合位点进行扩增并通过定量RT-PCR分析。数据在IP之前表示相对于输入DNA的归一化百分比量。数据表示为平均值±SE，代表三个独立实验中的一个。 B, CD4+ 将T细胞用RDLL4处理，在GSI的存在下，通过在芯片之后通过定量RT-PCR分析P1，P2和P3。数据表示为平均值±SE。
讨论
T细胞分化的调节可以受到多种分子信号的影响，所述多种分子信号在一起致电T细胞应答。这些研究中产生的数据证明了Notch配体DLL4在Th17分化中的增强。我们还提供了拟议机制的证据，其中DLL4决定了Th17分化。从许多研究中可以清楚地看出，在激活期间，Notch家族分子可以具有多种作用在确定T细胞的命运方面。使用遗传模型的研究表明，TH2但不是TH1的反应需要凹口（7, 10, 15），而其他结果取决于配体和/或免疫环境（8, 14, 16, 17, 29）。在本研究中，我们已经证实DLL4能够在特定于AG特异性响应中改变Th2细胞发育。事实上，使用致病刺激，LPS（TLR4），它出现了远离主要TH1响应和朝向混合细胞因子环境的偏斜响应的整个表型，包括高水平的IL-17，当DLL4是显着降低的被封锁了。有趣的是，仅当强烈的致病（TLR）信号应用于T细胞激活时，才检测到IL-17产生，这可能是由于如前所述的适当偏斜信号的上调（ 18），包括IL-6，TGF-β和现在DLL4。要遵循这些研究，我们检查了DLL4在天真CD4中的作用+ T细胞培养物在Th17偏斜条件下，发现DLL4，但不是锯齿状1，可以增强T细胞对IL-17生产的偏移。这似乎在开发期间表现出来（传入）以及在先前激活的T细胞仍然可以区分和偏斜的次要响应中。虽然陷波信号响应不太可能与自己引起免疫应答的倾斜（30），GSI完全抑制了DLL4增强的IL-17生产，进一步证实了Notch信号传导在这方面的关键作用。
T细胞亚群的分化取决于特定转录因子的表达。表达 rorc. 将划分Th17细胞在DLL4存在下显着上调。同时减少 Gata3 表达，TH2细胞因子的标志性调节转录因子在TH17偏斜条件下显示DLL4的存在下没有额外的改变。以前的研究表明DLL4下调 Gata3 在th2偏斜条件下（16）。有趣的是，这些后一种观察表明了一个复杂的监管模式 Gata3，作为两个独立研究表明，表达需要陷波信令 Gata3和Th2 cytokines (7, 15）。未来的调查肯定需要定义不同的凹口配体和受体如何相互作用并控制用于调节T细胞应答的发散反应。本研究中的另一种可能性是IL-17本身以自分泌或旁静脉时尚直接调节TH2细胞因子。但是，我们的数据与CD4+ 来自的细胞 IL17. - / - 小鼠证明，即使在偏斜条件下，IL-17在Th17偏斜条件下也不会在下调调节Th2细胞因子的作用。协调的时间下调 Gata3 随着表达的增加 rorc. 在Th17下，偏斜条件可能表明 rorc. 可以如建议的直接调节TH2响应（31）。
In CD4+ T细胞， rorc.和Stat3 是主要的监管机构 IL17. 基因。重要的是，这些研究表明DLL4诱导的陷波激活与 IL17. 具有RBPJ-κ/ CSL的基因调节。 N-ICD与转录因子RBPJ-κ/ CSL的NETCH激活和相互作用将RBPJ-κ/ CSL转化为转录阻遏物到转录激活物，导致缺口依赖性基因的表达。我们发现了一个共享的RBPJ-κ/ CSL绑定站点 IL17. 来自可能调节的TS的启动子2.4 KB IL17. DLL4共同激活后的表达。此外，当GSI抑制Notch信号传导时，相互作用完全丢失。以前，直接调节陷波介导的TH2分化的感应模型 Gata3和Il4 已显示通过RBPJ-κ/ CSL的基因（16）。我们的研究还揭示了DLL4诱导的RBPJ-κ/ CSL和的类似直接连接 rorc. 通过共享RBPJ-κ/ CSL绑定站点，表明DLL4通过特定多个交互式机制增强了IL-17的生产。相比之下，通过DLL4的凹口激活未改变STAT3磷酸化。
这些新方法证明了具有DLL4诱导的N-ICD释放的增强Th17倾斜的可能受到TLR刺激产生的免疫环境的影响，这将包括产生高水平的IL-6。似乎DLL4在存在其他Th17相关信号的情况下提高了偏斜效应，如使用特定偏斜条件的Th17细胞生成所示。在这方面，DLL4诱导的陷波信号可以仅通过根据提供信号的上下文性质来修改免疫应答。因此，尽管T细胞中的凹口激活是重要信号，但它可以主要用作用于激活/调节特定免疫环境的T细胞的指导。在DLL4的情况下，这取决于致病信号和PAMP通过TLR激活（16, 18），免疫环境将远离促进病原体间隙的Th2型反应。虽然在大多数情况下有益，但显然如果个体具有潜在的免疫功能障碍，例如自身免疫功能，则可能导致疾病的恶化。这将可能促进在偏向于抗病原体防御的系统中的疾病改变效果。然而，在这些相同的条件下，与自身免疫疾病的情况一样，致病挑战的恶化可能导致更糟糕的情况和严重组织/器官损失。其证据是在最近的研究中反映了观察到在操作不同缺口配体或整体封锁中，观察到自身免疫性反应的发展的差异变化（32, 33）。事实上，最近的研究在自身免疫中的特定陷波受体和IL-17生产之间引起了直接相关性（32）以及在肺肉芽肿形成期间（23）。
总体而言，这些研究延长了我们对特定的凹凸配体信号如何通过改变特定基因调控来指导免疫应答的理解。这些反应的协调，同时复杂，取决于先天免疫系统和特定致病性提示的识别。
致谢
我们感谢William Carson博士为 rorc. 本研究中使用的启动子序列和Ivan Maillard博士有用的讨论。
披露
作者没有财务利益冲突。
脚注
本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此，本文必须明白 广告 按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
↵1 地址通信和转载对尼古拉斯W. Lukacs，密歇根大学医学院，4059 BSRB，109 Zina Picker，Ann Arbor，MI 48109-2200。电子邮件地址： nlukacs {umich.edu
↵2 本文中使用的缩写：PAMP，病原体相关的分子模式; DC，树突细胞; dll，delta; N-ICD，Notch细胞内域; maml，mastermind蛋白; GSI，γ-分泌酶抑制剂;芯片，染色质免疫沉淀; RD114，重组DLL4; BM，骨髓; wt，野生型; TSS，翻译启动网站。
- 已收到 2008年12月23日。
- 公认 2009年4月7日。
- 版权© 2009 by The 美国免疫学家协会, Inc.
