关键点
在所有恢复期的COVID-19患者中均存在穗状反应性T细胞。
全国CAP和VEMP可能是治疗和诊断的目标。
在未暴露个体中无法检测到SARS-CoV-2反应性T细胞。
抽象
深入了解宿主免疫应答在病毒清除中的作用对于理解COVID-19发病机理和未来治疗策略至关重要。尽管在大流行期间很早就可以进行针对SARS-CoV-2的体液免疫反应分析研究，但细胞免疫是最近成为研究重点。对于当前的工作，我们已经调整了设计用于检测癌症患者中罕见的新抗原特异性记忆T细胞的方案，以研究针对SARS-CoV-2的细胞免疫应答。两者CD4+和CD8+在体外扩增6天后，使用代表完整病毒蛋白的重叠肽库检测到T细胞。测定读数为细胞内细胞因子染色和流式细胞仪分析，可同时检测四种功能标记（CD154，TNF，IL-2和IFN-γ）。我们能够在10例轻度症状的COVID-19患者中检测出10例SARS-CoV-2特异性T细胞。所有患者均具有针对12种分析的病毒Ag中至少1种的反应性T细胞，并且所有患者均具有Spike特异性T细胞。尽管CD4检测到一些Ag+和CD8+T细胞，VME1主要被CD4识别+T细胞。令人惊讶的是，我们无法在18名未暴露的健康个体中检测到SARS-CoV-2特异性T细胞。当我们在一夜之间刺激相同的样品时，即使在未暴露的个体中，我们也检测到了大量的细胞因子产生细胞。我们的比较表明，刺激条件可以深刻影响未暴露个体的激活读数。我们正在提供一种高度特异性的诊断工具，用于检测SARS-CoV-2反应性T细胞。
本文的特色 热门读物，第453
介绍
新型严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）是一种称为COVID-19的呼吸道疾病致病病毒，是一种与严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（市场汇率（）1–6）。
SARS冠状病毒 -2的出现导致大流行迅速蔓延。首例病例发生在2019年12月，到2020年10月1日，全世界报告了超过100万例死亡和3500万例SARS-CoV-2感染（约翰霍普金斯大学）。
SARS冠状病毒 -2的几种属性有助于其迅速传播。这些特征包括在无症状感染期已经具有传播能力，并且潜伏期约为3-14 d（S。Ma，J。Zhang，M。Zeng，Q。Yun，W。Guo，Y。Zheng，赵S.王MH和杨Z.手稿发布在medRxiv，DOI：10.1101 / 2020.03.21.20040329）（7）。此外，即使无症状和症状前的SARS-CoV-2感染个体也可以产生足够的病毒载量，足以进行人对人的传播（8–10）。
通常通过定量RT-PCR（RT-qPCR）检测鼻咽拭子中的SARS-CoV-2 RNA来常规诊断COVID-19（11）;但是，即使是有症状的SARS-CoV-2感染也经常无法识别。有症状时，COVID-19的范围从约85％的轻度，普通流感样疾病到约15％的受影响患者的严重呼吸道疾病（12, 13）。轻度COVID-19的特征是早衰，发烧，喉咙痛，咳嗽和轻度肺炎。严重的疾病表现为强烈的呼吸困难，缺氧和肺部受累的影像学证据。最终，严重的COVID-19会导致急性呼吸窘迫综合征，并伴有呼吸衰竭和多器官功能障碍（14）。
与其他冠状病毒相似，SARS-CoV-2感染会导致先天性和适应性免疫系统激活。一方面，保护性免疫是指通过活化的B细胞实现的，包括短暂的IgM和IgA以及持续的针对病毒的IgG反应。相反，激活的CD4+和CD8+ T细胞通过建立免疫记忆来促进急性感染的清除和针对再感染的保护性免疫（15）。各种研究表明，包括无症状患者在内的康复的COVID-19患者（CP）的高百分比具有针对SARS-CoV-2的IgA / IgM和/或IgG Abs，并且他们的恢复期血浆具有中和能力（16–18）（A. Wajnberg，F.Amanat，A.Firpo，D.Altman，M.Bailey，M.Mansour，M.McMahon，P.Meade，D.Rao Mendu，K.Muellers等medRxiv，DOI：10.1101 / 2020.07.14.20151126）。此外，不同的研究小组使用从回收的CP中回收的血浆来治疗重症患者（19, 20）。
关于T细胞免疫，一些报告显示SARS-CoV-2特异性CD4+和CD8+ T细胞存在于COVID-19患者中（21–23）（AE Oja，A.Saris，CA Ghandour，NAM Kragten，BM Hogema，EJ Nossent，LMA Heunks，S.Cuvalay，E.Slot，FH Swaneveld等人，手稿张贴在bioRxiv，DOI：10.1101 / 2020.06。 18.159202；以及F. Gallais，A。Velay，M.-J。Wendling，C。Nazon，M。Partisani，J.Sibilia，S。Candon和S. 法菲·克雷默，手稿张贴在medRxiv，DOI：10.1101 / 2020.06.21.20132449）。这些试验中的大多数都使用重叠肽来研究T细胞对HLA独立起作用的反应。有趣的是，几乎所有研究都能够在未接触和/或PCR阴性的患者以及无法与新型冠状病毒SARS-CoV-2接触的历史对照中检测到SARS-CoV-2特异性T细胞。 。血清阴性个体中先前存在的Spike反应性T细胞代表针对Spike蛋白的交叉反应性克隆的可能性解释了这一发现，该克隆可能是由于先前接触过其他季节性人类冠状病毒而获得的（21–23）。
在本研究中，我们应用了最初设计用于检测晚期癌症患者中罕见的肿瘤相关Ag特异性或新抗原特异性记忆T细胞的方案（24–26）。我们用重叠的肽库扩展了冷冻保存的PBMC，并通过细胞内细胞因子染色检测了病毒特异性T细胞，从而使我们能够对SARS-CoV-2特异性CD4进行功能表征+和CD8+ 记忆T细胞。
材料和方法
学习科目
总共包括18个未暴露的供体（发现队列中的9个供体和确认队列中的9个供体）和10个CP。 CP包括通过RT-qPCR检测到的鼻咽拭子中SARS-CoV-2 RNA阳性的个体以及这些个体的有症状亲属。除一名患者外（C10），所有患者均使用ELISA方法显示了Spike特异性IgG Abs。未暴露的捐献者包括通过RT-qPCR检测为SARS-CoV-2阴性的个体和与SARS-CoV-2感染者没有接触的无症状个体。未暴露的个体均未显示出穗特异性IgG抗体。从2020年2月至2020年9月在德国图宾根采集血液。所有参与者均提供了书面知情同意书。这项研究得到了Ethik-Kommission derLandesärztekammerBaden-Württemberg的批准（F-2020-111）。
PBMC隔离
全血在钠-肝素收集管（Sarstedt）中抽取。通过使用BioColl Separation Solution（Biochrom）进行密度梯度离心来分离PBMC。分离后，洗涤PBMC，并使用含有10％DMSO的冷冻培养基（VWR International）冷冻保存直至使用。
重叠肽库
获得了12种SARS-CoV-2 Ags（PepMix; JPT Peptide Technologies）的跨蛋白重叠肽段。 Ags包括Spike（在158和157个肽的两个子池中提供，子池[S1]和子池2 [S2]），NCAP（NCAP； 102个肽），蛋白质3a（AP3A； 66个肽），包膜小VME1（VEMP； 16个）肽），VME1（VME1; 53个肽），未鉴定的蛋白14（Y14; 16个肽），ORF10蛋白（ORF10; 7个肽），ORF9b蛋白（ORF9b; 22个肽），非结构蛋白6（NS6; 13个肽），非结构性蛋白7A（NS7A； 28个肽），非结构蛋白7B（NS7B； 8个肽）和非结构蛋白8（NS8； 28个肽）。
检测SARS-CoV-2特异性T细胞
解冻后，将PBMC溶解在含有3μg/ ml DNAse I（Sigma-Aldrich）的TexMACS培养基（Miltenyi Biotec）中，并在标准培养箱（37°C； 5％CO）中培养2; Eppendorf）12小时。在最初的预温育阶段后，将细胞洗涤并放入含有48％孔板的含1％青霉素-链霉素（Sigma-Aldrich）的TexMACS培养基中。重叠肽（PepMix）的加入浓度均为1μg/ ml。细胞与肽一起培养6天。用肽培养的最初24小时后，添加10 U / ml IL-2（Miltenyi Biotec）和10 ng / ml IL-7（Miltenyi Biotec）。必要时更换了介质。用肽培养5天后，加入无细胞因子的培养基。用肽培养6天后，收集每个孔的扩增细胞，洗涤，并重新放置在96孔板的两个孔中。第一个孔用相应的PepMix重新刺激，而第二个孔则保持未刺激状态。以1μl/ ml的浓度添加高尔基抑制剂（GolgiPlug； BD Biosciences），并将细胞培养12±2h。
短期刺激测试
解冻和预温育后，将PBMC洗涤并重新放入96孔板中的TexMACS培养基中，该培养基中含有1％青霉素-链霉素（Sigma-Aldrich）。分别以1μg/ ml的浓度添加代表整个Ag的重叠肽（PepMix； JPT Peptide Technologies）。在GolgiPlug（BD Biosciences）浓度为1μl/ ml的情况下，将细胞与肽一起培养12±2 h。
流式细胞仪
统计
使用FlowJo版本10.5.3（FlowJo）分析数据。使用前向散射区对前向散射区高度图删除重复项后，通过在Zombie Aqua阴性细胞上进行门控来排除死细胞。接下来，CD4+和CD8+ 细胞在可行的CD3中门控+ 淋巴细胞并分别分析每种功能标记（CD154，IFN-γ，TNF和IL-2）。如果适用，在IFN-γ上分析CD25表达+ 和IFN-γ− 细胞。详细的门控策略可以在下面找到 补充图1。对于每个功能标记，我们评估了所有门控CD4中阳性细胞的百分比+和CD8+ 样品一（重新刺激）和样品二（未重新刺激）中的T细胞。如果任一CD8中任何功能性标记的刺激指数≥2（样本一除以样本二），则将供体定义为具有Ag特异性T细胞。+ or CD4+ T细胞。通过从样品一（再刺激）中减去样品二（未再刺激）中的细胞因子产生细胞的频率来确定产生细胞因子的细胞（或表达CD154的细胞）的频率。所有实验均由一名研究人员（D.W.）集中进行，并由另一名研究人员（H.Z.）进行分析。
总IFN-γ的频率+ T细胞和CD25+ 干扰素+ 将CP和未暴露个体中的T细胞与未配对个体进行比较 t 使用Prism 8.4.2（GraphPad软件）进行测试。
结果
患者队列的人口统计学和临床特征
该研究包括18名未暴露的供体（7名女性）和10名COVID-19患者（6名女性）。详细特征在 表一。所有CP都有轻度流感样症状。一名患者住院。最常见的症状是四肢酸痛，然后是喉咙痛和发烧。症状/ PCR之间的平均时间+ 和症状/ PCR结束− 为17±9天。症状/ PCR结束之间的平均时间−，并且抽血为42±36 d。
存在SARS-CoV-2特异性T细胞
当我们分析流式细胞仪数据而不考虑表型（CD4+ 与CD8+ T细胞）和功能（CD154，IFN-γ，TNF和IL-2），均符合预定标准（21），所有CP均具有针对至少一种病毒Ag的特异性T细胞。十名患者中有九名具有针对一种以上SARS-CoV-2 Ag的特异性T细胞。相比之下，发现队列中的九个未暴露供体中没有一个针对任何测试的Ags有特异性T细胞。患者的T细胞识别出的最常见的SARS-CoV-2 Ag是Spike，其中10名患者中有10名检测到Spike1特异性T细胞，而10名患者中有7名检测到了Spike2特异性T细胞。十名患者中有八名的T细胞能够识别NCAP和VME1。 10名患者中有2名检测到ORF10和AP3A特异性T细胞。一名患者具有ORF9b特异性T细胞。没有一个CP具有针对任何其他病毒Ag的T细胞（图1A）。根据这些结果，我们编制了与检测近期感染相关的最小SARS-CoV-2 Ag列表：Spike1，NCAP，膜和非结构蛋白8（作为阴性对照），并从第二组未暴露的个体中检测了PBMC （确认队列）。确认队列中的9位未暴露供体中没有一个针对这4种测试Ag中的任何一种具有特异性T细胞（表二）。对于CP C01，C05和C07，我们分析了第二个PBMC样本，该样本在初次抽血后约5个月（136至160 d之间）收集。尽管三分之二的患者中S1特异性IgG抗体低于检测极限 补充图2），我们能够在所有三名患者中检测到SARS-CoV-2特异性T细胞（表二）。
图1。
恢复的CP中SARS-CoV-2特异的T细胞（n = 10）。根据我们预定的反应标准，不论表型如何，具有SARS-CoV-2特异性T细胞的患者人数（A）或CD4单独+和CD8+ T细胞（B）体外扩增6天后。在未暴露的个体中未检测到SARS-CoV-2反应性T细胞（n = 18).
CD4+ 与CD8+ SARS冠状病毒 -2特异性T细胞
Spike1 Ag同样被CD4认可+和CD8+ T细胞（均为10个中的9个）。 Spike2 Ag也是如此（10名患者中有7名患有CD4+ T细胞； 10人中有5人拥有CD8+ T细胞）。大多数NCAP特异性T细胞是CD4+ （10名患者中有6名，而9名CD8中有3名+ T细胞）。有趣的是，膜Ag主要被CD4检测到 + T细胞（10个中的7个，而CD8中的10个中的1个+ T细胞），而AP3A特异性T细胞仅是CD8+ （10名患者中的2名）。 VME1的免疫原性与NCAP蛋白相当，后者将Ag膜作为未来Ab研究的有趣靶标（图1B）。
SARS冠状病毒 -2特异性T细胞的频率
在没有应用针对Ag反应性T细胞存在的预定定义的情况下，我们比较了产生IFN-γ，SARS-CoV-2特异性CD4的频率+和CD8+ CP和未暴露个体中的T细胞。看着CD4+ 干扰素+ 对于S2 Ag（0.43％; IQR，0.19–0.97％），观察到T细胞是CP中特定T细胞的最高中值频率，其次是S1（0.29％; IQR，0.19–0.97％），NCAP（0.16％; IQR） ，0.002-0.93％）和VME1（0.12％； IQR，-0.06-0.49％）。在未暴露个体中，这些频率显着降低（S2，0.09％； IQR，-0.02-0.17％。S1，-0.02％； IQR，-0.17-0.07％。NCAP，-0.01； IQR，-0.07-0.04％。 VME1，0.02； IQR，-0.1–0.05％）。
在CD8中+ T细胞在CP内的最高中值频率出现在S1 Ag（0.48％; IQR，0.10–1.84％），其次是S2（0.18％; IQR，0.15–0.84％）。再次，未接触个体的频率显着降低（S1，0.00％； IQR，-0.06-0.08％。S2，0.06％； IQR，-0.09-0.19％）（Fig. 2）。
图2。
暴露之间的差异（n = 10）和未暴露的捐助者（n = 18）IFN-γ的长期刺激频率后+ CD4+ （左）和CD8+ T细胞（right) responding upon viral Ag stimulation within recovered CP (upper row) 和 unexposed individuals (lower row; discovery 和 confirmation cohort). The frequency was calculated by subtracting the frequency of 干扰素–在体外扩增6天后，从样品1（再刺激细胞）中产生样品2中的细胞（未再刺激细胞）。框–晶须图（线，中位数；方格，第25至75个百分位数；晶须最小值[Min]至最大值[Max]；所有个体显示为点）。
长期和短期刺激之间的差异
与我们的结果相反，最近的出版物报道了未严重感染SARS-CoV-2特异T细胞的个体的中高频。为了研究观察到的差异是否是供体依赖性的，我们使用短期刺激（即，将带有重叠肽库的PBMC孵育12 h，而无需使用相同的供体（CP和发现人群中未暴露的个体）进行相同的设置先前的体外扩增6 d）。当我们分析流式细胞仪数据而不考虑表型和功能时，我们在9个CP中的9个中检测到SARS-CoV-2特异性T细胞。但是，我们还从发现队列中的九个未暴露个体中的八个中检测到了SARS-CoV-2特异性T细胞（ 表二）。
关于特定T细胞的频率，最高中值CD4+ 干扰素+ 在CP内的T细胞中观察到S1 Ag（3.07％; IQR，0.18–4.83％），其次是S2 Ag（1.92％; IQR，0.89–8.75％）。在这种情况下，未接触个体的频率相似（S1，2.83％； IQR，0.35-5.13％。S2，2.44％； IQR，1.27-4.37％）（Fig. 3）。
图3。
暴露之间的差异（n = 9）和未暴露的捐助者（n = 9）短期刺激后的结果来自短期刺激。 干扰素的频率+ CD4+ （左）和CD8+ T细胞（right) responding upon viral Ag stimulation within recovered CP (upper row) 和 unexposed individuals (lower row; discovery cohort). The frequency was calculated by subtracting the frequency of 干扰素–在刺激12小时后，从样品1（重新刺激的细胞）中产生样品2中的细胞（未重新刺激的细胞）。框–晶须图（线，中位数，方格，第25至75个百分位数；根据Tukey的晶须以及以单个点显示的离群值）。
看着CD8+ T cells, highest median frequencies within CP were observed for the S1 Ag (2.08%; IQR, 0.37–4.33%), followed by S2 (1.43%; IQR, 0.91–5.40%). Again, frequencies were similar for unexposed individuals (S1, 0.09%; IQR, 0.03–3.60%. S2, 1.48%; IQR, 0.46–2.26%). IFN-α的代表性例子γ+ CD8+ 短期和长期刺激后CP和未暴露个体的T细胞显示在 Fig. 4.
图4。
IFN-α的代表性例子γ+ CD8+ T细胞IFN-γ+ CD8+ COVID-19患者的T细胞（C07；请参见 表一）和短期（上排）和长期（下排）刺激后未暴露的个体（C11）。显示了未重新刺激的（第一和第三列）和Spike1重新刺激的单元格（第二和第四列）。数字表示IFN-γ的频率+ 所有CD8中的细胞+ T细胞。
For selected samples, we repeated the short-term stimulation 和 compared CD25在IFN-上的表达γ–producing T cells between CP 和 健康未暴露的供体s (HD) after Spike2 和 金黄色葡萄球菌肠毒素B (SEB) stimulation. For S2-stimulated cells, we observed a trend toward higher frequency of CD25+ 单元（平均百分比，60.1±22.3 CP对28.2±19.5 高画质; p = 0.136）和更高的表达水平（中值荧光强度[MFI]，分别为5923±2670 CP和2859±2052 高画质； p 与未暴露个体相比，CP中产生IFN-γ的细胞= 0.190）。在SEB刺激的细胞中未观察到这些差异（平均百分比：3.8±1.0 CP对5.4±2.0 高画质; 小额信贷机构，717±490 CP对923±228 高画质）（Fig. 5, 补充图4）。
图5。
CD25在IFN-上的表达γ+ CD4+ T细胞占CD25的百分比+ （左栏）和CD25 小额信贷机构（右栏）+ 和IFN-γ− CD4+ 使用S2肽库（上排）或SEB（下排）进行短期刺激后，三个CP（三角形）和三个未暴露个体（圆形）的T细胞。显示了平均值（方框）和SD。 CD8的结果+ T细胞显示在 补充图3.
讨论区
本研究的目的是建立一种高度特异性的测定方法，该方法能够仅在遭受SARS-CoV-2感染的个体中检测病毒反应性T细胞。我们的发现证实了先前报告的结果，表明这两个CD4 +和CD8+ 在恢复的CP的外周血中可以检测到SARS-CoV-2特异性T细胞。我们能够在所有CP中检测出Spike反应性T细胞，从而确认其作为疫苗研究的主要目标Ag的作用。但是，我们观察到针对SARS-CoV-2的细胞免疫不仅限于Spike蛋白，而且还靶向NCAP和VME1。这突出了非钉蛋白在未来COVID-19疫苗设计中的潜在重要性。
尽管我们的试验显示出极好的敏感性，但令人惊讶的是，我们未在未暴露的供体中检测到SARS-CoV-2特异性T细胞。相反，Braun等人。检测到钉状反应性CD4+ 83％的CP和34％的SARS-CoV-2血清阴性健康供体中的T细胞。刺激细胞16小时，并使用CD40L和4-1BB表达检测Ag特异性T细胞（ 23）。 格里福尼等。检测到CD4+和CD8+ SARS冠状病毒 -2特异性T细胞分别在约100％和70％的COVID-19恢复期患者中发生。靶向Ags主要包括Spike，膜和NCAP蛋白。 SARS冠状病毒 -2反应性CD4+ 在未暴露个体中，有40-60％的人也检测到T细胞。 CD4+和CD8+ 分别刺激24小时和9小时后，检测到SARS-CoV-2特异性T细胞（21）。 Oja等。能够检测到CD4+ 有轻度症状的21个CP中有21个具有钉状特异的T细胞，有16个未暴露的个体中有14个为尖峰T细胞。将细胞刺激过夜，并通过上调CD154和4-1BB来鉴定SARS-CoV-2反应性T细胞（Oja等人，手稿张贴在bioRxiv上，DOI：10.1101 / 2020.06.18.159202）。
Gallais等。在9个CP中的9个和8个亲戚中的6个中检测到SARS-CoV-2特异的T细胞（针对不同的Ags），但既没有RT-qPCR结果阳性，也没有发现针对SARS-CoV-2的Abs。刺激PBMC约20小时，并通过IFN-γELISPOT分析检测出SARS-CoV-2特异性T细胞（Gallais等人，论文发表于medRxiv，DOI：10.1101 / 2020.06.21.20132449）。 维斯科普夫等。 （22）在10名COVID-10患者中的10名和8名CD4中观察到+和CD8+ T细胞分别有反应。在之前未暴露于SARS-CoV-2的10个健康对照中，有2个也检测到SARS-CoV-2反应性T细胞。刺激PBMC约20小时，并通过IFN-γELISPOT分析检测出SARS-CoV-2特异性T细胞。刺激PBMC 20小时，并通过上调CD69和CD137检测到SARS-CoV-2特异性T细胞。
Some of the authors of the previously mentioned studies assumed that those T cells represent cross-reactive common cold coronaviruses–specific T细胞。 Although early studies SUPposed that these T cells could even be protective against SARS冠状病毒 -2 和 might be responsible for a mild course of disease, recent studies were skeptical about this hypothesis, for example because SUPerspreading events would be very unlikely if cross-reactive T cells are indeed protective (27）。
The aforementioned studies have one aspect in common: PBMCs were stimulated for a rather short period of time. Viral epitopes are in principle much more immunogenic as compared with tumor neoantigens for example. Furthermore, especially the Spike protein is a very large protein (1273 aa), bearing a lot of potential class I 和 class II epitopes. The short incubation time might have led to a weak response of various naive T cells or unspecific T cell responses. Interestingly, using the short-term assay, we observed an increased expression of CD25, the IL-2R α-chain, on S2-specific T cells in CP compared with unexposed individuals. This difference was not observed when T cells were stimulated unspecifically using SEB. Because low-dose IL-2 is present during in vitro expansion, it is possible that the rareness/absence of CD25 is the reason why T cells from unexposed individuals fail to expand. This finding is SUPported by data from 朱诺 等. (28），他观察到从回收的CP中SARS-CoV-2特异性卵泡Th细胞上CD25的表达增加。 布劳恩等。 （23）观察到CP中的Spike反应性T细胞表达高水平的CD38和HLA-DR，这是在高度活化的T细胞上共表达的两个标记。相反，未暴露个体的穗状反应性T细胞不表达CD38和HLA-DR或仅以较低频率表达，这可能反映了它们的原始来源。 维斯科普夫等。 （ 22）表明SARS-CoV-2特异性CD4+ CP的T细胞主要表现出中枢记忆表型，而CD8+ T细胞主要表现出效应记忆或终末分化的效应记忆表型。未讨论未暴露对照组的SARS-CoV-2特异性T细胞表型。和罗达等。观察到在Spike蛋白刺激下仅效应细胞和中央记忆T细胞而非幼稚T细胞增殖（LB Rodda，J.Netland，L.Shehata，KB Pruner，PM Morawski，C.Thouvenel，KK Takehara，J.Eggenberger， EA Hemann，HR Waterman等人的手稿发表在medRxiv，DOI：10.1101 / 2020.08.11.20171843）。
Regarding the absence of SARS冠状病毒 -2特异性T细胞 in unexposed individuals, our data are SUPported by a study by 鹏 等. (29），他们也没有在16 高画质中看到针对SARS-CoV-2 Ag的明显免疫反应。此外，最近的一项人类I期试验（重组腺病毒5型载体COVID-19疫苗）显示，在108位参与者中未发现接种疫苗前穗特异性T细胞应答（30）。综上所述，这些数据表明我们的结果与某些先前发表的数据之间观察到的差异与供体无关，而与测定有关，并且表明刺激条件可能会深刻影响未暴露个体的激活读数。
Our data show that the VME1 might be an interesting target for studying in-depth humoral immune responses against SARS冠状病毒 -2. A high frequency of recovered CP had membrane-specific T cells in our small cohort. Intriguingly, the phenotype of these cells was almost exclusively 受限制的 to the CD4 compartment. Our results are SUPported by a recently published study in which T cells able to recognize VME1-derived HLA-DR T cell epitopes could be detected in 21 of 22 recovered CP 和 0 of 19 unexposed individuals (31）。由于Th细胞在B细胞启动过程中起着重要作用，因此这些患者中可能存在膜特异性抗体。
我们研究的不足之处包括样本量太小，以及对轻度COVID-19病例的关注。关于这一点，我们放弃了免疫学和临床元数据之间的相关性。我们已经（据我们所知）引入了一种新颖的方法，该方法可帮助鉴定迄今具有很高特异性的以前感染过SARS-CoV-2的患者。该测定法可以独立地应用于HLA，并且不依赖于表位预测算法。特别是在疫苗接种试验后监测诱导的免疫反应时，最需要能够区分交叉反应性，天真或非特异性和SARS-CoV-2特异性记忆反应的测定方法。与中和测定相比，我们的方案不需要严格的BSL3安全条件。较大的研究将真实阳性的细胞和详细的体液免疫反应与临床数据相关联，可能有助于制定新的治疗策略。
披露事项
作者没有财务利益冲突。
脚注
本文的在线版本包含 SUPplemental material.
本文中使用的缩写：
- AP3A
- 蛋白质3a
- CP
- COVID-19患者
- 高画质
- 健康未暴露的供体
- 小额信贷机构
- 中值荧光强度
- 全国CAP
- 核衣壳
- NS6
- 非结构蛋白6
- 实时定量PCR
- 定量RT-PCR
- S1
- 穗子池1
- S2
- 秒杀子池2
- SARS冠状病毒
- 严重急性呼吸综合征冠状病毒
- SARS冠状病毒 -2
- 严重急性呼吸系统综合症冠状病毒2
- SEB
- 金黄色葡萄球菌肠毒素B
- VME1
- 膜蛋白。
- 已收到 2020年7月9日。
- 公认 2020年11月16日。
- 版权©美国免疫学家协会，2021年。
