关键点
ocp.表达CX.3CR1和在不受干扰的条件下，分化为骨质骨胶。
循环CX的贡献3CR1+ OCP到OC的开发期间在宿舍期间很低。
成熟的oc可以源自循环cx3CR1+ 骨折修复期间的e乐彩下载。
抽象的
骨核苷酸（OC）源自骨髓（BM） - 敏感或循环骨髓OC祖e乐彩下载（OCP）表达受体CX3CR1。多条证据表明OCP在稳态和炎症不同。我们在稳态和骨折修复期间调查了BM居民和循环OCP对骨髓e乐彩下载发生的相对贡献。使用CX.3CR1-EGFP / TRAP TDTOMATO小鼠，我们找到了CX3CR1在单核e乐彩下载中表达，但不是在多核陷阱中+oc。但是，CX.3CR1-表达e乐彩下载生成陷阱+CX.中5 D内的骨头3Cr1creert2 / ai14 Tdtomato报道小鼠。为了定义循环e乐彩下载在稳态期间循环e乐彩下载在骨髓e乐彩下载中发挥作用的作用，我们在野生型（WT）小鼠（CD45.1）上剖析了捕获TDTOMATO小鼠（CD45.2）的C57BL / 6背景。流式e乐彩下载术（CD45.1 / 45.2）在2WK后逐渐阐述了靶肢体的丰富血e乐彩下载混合。在4周，有许多TDTOMATO+在陷阱tdtomato小鼠的股骨中，但几乎没有在wt小鼠中。类似地，培养的BM刺激以形成OC，在来自捕集Tdtomato小鼠的e乐彩下载培养物中显示多个荧光OC，但不是来自WT小鼠。最后，流式e乐彩下载术确认了慢率之间的瘫痪，但在脾脏中的显着植入之间确认了BMe乐彩下载的低水平植入。相比之下，在骨折修复期间，我们发现循环cx3CR1+e乐彩下载迁移到骨骼，丢失了CX的表达3CR1，并成为OC。这些数据表明OCP，但不是成熟的OC，表达CX3CR1在稳态和骨折修复过程中。我们得出结论，在稳态性成熟oc主要来自BM驻地OCP，而在断裂修复期间，循环CX3CR1+e乐彩下载可以变成OC。
本文介绍 在这个问题上，p。731
介绍
骨稳态是一种复杂的过程，需要在骨形成和骨干扰e乐彩下载之间精确配位。骨核苷酸（OC）是唯一可以有效地重演骨骼的e乐彩下载。 OC形成和功能的病理调节有助于疾病的发展，如炎症骨解和骨质疏松症，其产生低骨质和脆性骨折的风险增加（1）。 OC介导的骨吸收对于骨重塑至关重要，这通过更换磨损或微浆骨来保持骨架的结构完整性（1）。
OC.是一种独特的大，多核e乐彩下载，源自常见的单核骨髓前体，其也可以分化为巨噬e乐彩下载和树突e乐彩下载（2）。虽然OC的造血起源是很好的（3, 4），其直接祖e乐彩下载的鉴定没有完全解决（2, 5）。此外，还尚不清楚病变或稳态病症中的oc是否主要来自循环单核e乐彩下载前体或骨髓（BM） - 脑血管祖先，其致电OC谱系而不循环。
我们的团体表征了从BM中分离的小鼠OC祖e乐彩下载（OCP）作为CD45R− CD3− CD11b低/ - CD115+，CD117高，中间或低。这些OCP能够在体外区分和成熟>通过单e乐彩下载克隆确定的90％效率。此外，其他人证明了鼠BM中的OCP表达受体CX3CR1为趋化因子，骨干胺（CX3CL1) (6, 7）。 CX.3CR1是膜结合，用作化学反向剂和粘附分子（8）。 CX.3CL1由成骨e乐彩下载产生，并且已被证明通过其吸引OCP对吸收部位的能力发挥作用（6, 7）。反过来，这结果表明CX的作用3CR1, 它在OCP上表达（6, 9），在调节OC迁移方面。 CX持久性的初步研究3在OC成熟期间的CR1表达在体外和使用鼠BMe乐彩下载中进行（6, 7）。这些证明了CX几乎完全下调3CR1在成熟oc中的表达。但是，通过Ibáñez等人的结果，对后来发现的解释是复杂的。 （10）描述了在炎症条件下诱导的OC的单独原点。这些作者发现，炎症OC的比例（20-30％）保持CX的表达3CR1在整个成熟过程中。相比之下，他们报告了CX的表达3在非炎性条件下衍生的OC上的CR1越少（4-7％）。
目前，存在强有力的证据表明，循环e乐彩下载是在“开放”或扰乱BM微环境的完整性期间OCP的源。这些包括骨折（11），炎症（5），增强的吸收（12），成骨e乐彩下载死亡（13）和缺陷OC功能（14）。然而，在未受干扰或稳态条件下，BM居民和循环e乐彩下载在骨e乐彩下载发生中发挥的相对作用是有争议的。据报道，据报道，据报道了BM居民和循环e乐彩下载作为稳态期间OCP的主要来源的数据（12, 13, 15）。
在这项研究中，我们使用更新和更敏感的技术，比以前所用的技术研究oc在体内of中的oc成熟的速率以及在稳态和骨折修复过程中循环和骨头植入OCP发挥的作用。我们首先评估如何快速表达CX3CR1使用CX分为体内成熟OC3Cr1creert2 / ai14小鼠。另外，因为cx3CR1标记BM和循环骨髓OCP，我们检查了使用共用血磷化系统对骨髓e乐彩下载产生的循环e乐彩下载的贡献。该模型采用捕集TDTOMATO小鼠，其表达成熟OC中的高水平TDTOMATO荧光蛋白，以鉴定形成骨中OC的循环e乐彩下载。最后，使用双转基因CX3CR1-GFP. / TRAP TDTOMATO小鼠，我们孤立CX3CR1+ BMe乐彩下载并将其注入到接受裂缝修复的小鼠的循环中以确定循环CX3CR1+ e乐彩下载可以在该过程中掺入成熟的OC中。
材料和方法
实验动物
在C57BL / 6背景中使用雌性小鼠用于所有实验，除了采用的采用转移实验，其中使用雄性。除非另有说明，否则所有小鼠在14至15周期之间分析。 CX.3Cr1creer小鼠（16）从杰克逊实验室（020940）购买，并在标准住房条件下，在UCONN健康中心的比较医学中心。这些小鼠的外显子1 CX..3cr1 基因由表达CRE-ERT2的构建体取代。因为构建体“被淘汰” CX..3cr1 基因，其表达由内源控制 CX..3cr1 基因监管要素。 CX.3Cr1creer小鼠与来自杰克逊实验室（股票号007914）的Ai14 Cre报道小鼠交叉，以产生CX3Cr1creer / ai14小鼠。 Ai14 Cre报道鼠标线在表达活性CRE重组酶及其后代的e乐彩下载中产生红色荧光TDTOMATO蛋白。
陷阱Tdtomato小鼠是来自M. Ishii博士的礼物（17）（Osaka大学，大阪，日本的免疫学前线研究中心）。该转基因小鼠含有一种使用内源小鼠的细菌人工染色体构建体 Acp5 调节序列以推动TDTOMATO蛋白的表达。
CX.3CR1-GFP.小鼠从杰克逊实验室获得（股票号005582）（18）。表达CD45.1而不是CD45.2的C57BL / 6 CONGENIC菌株，其存在于大多数C57BL / 6小鼠线上，从杰克逊实验室（股份号002014; PEP男孩）获得。
所用的所有动物都是用于转基因的杂合（CX3CR1-GFP.或陷阱TDTOMATO）。
Uconn Health的机构动物护理和使用委员会批准了所有动物议定书。
流式e乐彩下载术和FACS
用于流式e乐彩下载术分析的ABS全部可商购。这些包括抗小鼠CD117（C-kit，克隆：Ack2，ACK2，APC共轭，目录号17-1171-83; eBioscience，Carlsbad，CA）和抗小鼠CD115（C-FMS，Clone：AFS98，生物素化，目录没有。13-1152-85; eBioscience），抗小鼠CD45.1（克隆：A20，APC共轭，目录号558701; BD Biosciences，San Jose，CA）和抗小鼠CD45.2（克隆：104 ，Fitc共轭，目录号。11-0454-85; eBioscience）。链霉抗生物素蛋白PE（目录号12-4317-87; eBioscience）用于检测CD115。通过它们掺入碘化丙糖的能力之外排除死e乐彩下载。通过e乐彩下载的前向和侧散射光特性设定白e乐彩下载浇口，并进一步分析CD45.1和CD45.2表达。未染色的样品和单染色控制用于设置每个荧光通道的栅极。在LSR II流式e乐彩下载术系统（BD Bioscience）和使用Flowjo软件（树星）或FACS Diva V8（BD Bioscience）进行的数据分析中进行流式e乐彩下载术分析。来自CX的胫骨和股骨BMe乐彩下载3分离CR1-GFP小鼠并通过GFP的表达分类−，GFP.低的和gfp.高的 并进一步培养。对配备五个激光器和18个荧光探测器的Facsaria II（BD Buoscience）进行分拣。
BM.e乐彩下载培养
通过发布方法的修改，从股骨和胫骨中分离了小鼠BMe乐彩下载（19–21）。然后培养e乐彩下载（5×104 在96孔板中的e乐彩下载，完整的α-MEM培养基（目录号12571-063; Life Technologies，Paisley，U.K.），具有10％的热灭活FBS，2毫米 l-Glutamine，100u / ml青霉素 - 链霉素（目录No.15140-122; Life Technologies）在鼠标M-CSF（目录号M2000; CONNEM，CHINESHIRE，CT）和/或NF的小鼠受体激活器的情况下κB配体（RANKL）（目录号码。R2001，Connstem）。通过在组织培养塑料上完全α-MEM中孵育过夜来制备BM巨噬e乐彩下载/单核e乐彩下载（BMM）e乐彩下载。收集非晶胞e乐彩下载，使用Ficoll-hypaque分离单核e乐彩下载（目录No.GE17-1440-02; GE Healthcare，瑞典）密度梯度离心。
坑形成测定
为了分析OC的复苏活性，通过培养分选的CX进行坑形成测定3CR1 GFP.−，GFP.低的和gfp.高的 BMe乐彩下载在紫外线灭菌，可生长的牛皮质骨切片，我们制备。这些被置于96孔板中。用M-CSF和RANKL（30ng / ml）处理e乐彩下载8d，（2）。使用光学显微镜（BX53; Olympus Scientific，Waltham，MA）和通过Cellens软件（Olympus，Tokyo，Japan）分析的图像来测量每种孔周边和面积。
体外oc形成测定
在96孔培养板上以M-CSF和RANKL（表示为30ng / ml或剂量），在96孔培养板上以5500个e乐彩下载的初始电镀密度培养小鼠BMM。小鼠整体BM（每孔50,000个e乐彩下载的96孔板），脾脏e乐彩下载（每孔50,000个e乐彩下载的96孔板），培养m -CSF和RANKL（均为30ng / ml），6天。如所述孤立OC前体群（2）对于体外OC形成测定，并在96孔培养板上以5000个e乐彩下载培养，具有M-CSF和RANKL。每3天补充培养基。在实验完成时，在使用商业套件的捕获器之前，在室温下用2.5％戊二醛在PBS中用2.5％戊二醛固定15分钟（目录No.387A-1KT; Sigma Aldrich，St.Louis，Mo）。含有超过三种核的捕获阳性e乐彩下载被计数为OC。
CX.3CR1在成熟陷阱中表达+ OCs
确定CX的表达3CR1在成熟的OCS中，我们越过CX3CR1-GFP.记者小鼠与陷阱TDTOMATO小鼠（CX3CR1-GFP. / TRAP TDTOMATO）。将动物处于3周，股骨分开，固定在10％福尔马林中的3d，转移至30％蔗糖-PBS过夜，嵌入和切割在低温恒温器（Leica，德国）。幻灯片用DAPI（目录号D-1306;分子探针，丁烯或）安装，以识别核，盖子和扫描（Axio Scan; Carl Zeiss显微镜，德国）。扫描液体后，用于识别EGFP（绿色）和TDTOMATO（红色）的报告表达和核染色，染色苏洛蛋白并重新扫描。
实时PCR
Acp5, CX.3CR1， 和 β-肌动蛋白 基因。数据作为相对基因表达呈现给 β-肌动蛋白 家务基因使用Δδ循环阈值方法计算。
谱系追踪
CX.3
粘性症
使用10-WK老雌性小鼠进行等焦吻合术手术，如先前由Donskoy和Goldschneider（22）。捕集器TDTOMATO小鼠（CD45.2）手术加入野生型（WT; CD45.1; PEP BOY）鼠标。手术后保持糖尿病对4周。在笼子的地板上提供食物颗粒和水凝胶，以尽量减少拉伸运动，同时小鼠调节曲轴。通过流式e乐彩下载术在表达CD45.1和CD45.2的e乐彩下载中，在两只小鼠的血液中的2WK在2WK术后确认共用血液循环的建立。
在4周期后，处死动物，并收获来自脾，血液和BM的e乐彩下载，用于流式e乐彩下载术分析，以确定CD45.1和CD45.2的相对表达。还收集e乐彩下载用于疏松骨溶解条件下的培养物。收获WT和TRAP TDTOMATO小鼠的股骨，并与组织学相同地处理，以用于谱系跟踪。
CX.3CR1-GFP.e乐彩下载移植在完整的动物和动物中，具有股骨骨折
CX.3CR1-GFP.小鼠与Trap Tdtomato小鼠交叉以产生CX3CR1-GFP. /捕集TDTOMATO小鼠和两种转基因的杂合子后代用作供体e乐彩下载的源，以便通过转移到WT小鼠中。从男性8-WK-over CX的长骨头收集BMe乐彩下载3CR1-GFP. / TRAP TDTOMATO小鼠，并活CX3在Facsaria II系统（BD Bioscience）上分离了碘化丙啶的阴性的Cr1-GFPe乐彩下载。这些被用作供体e乐彩下载，用于全身移植到8-WK-OR雄性C57BL / 6小鼠（杰克逊实验室）中。将八只小鼠随机分成两组四组。第一组动物没有破裂，用CX移植3CR1-GFP.e乐彩下载。第二组动物的股骨骨折，然后用CX接受3裂缝后立即CR1-GFPe乐彩下载。两组小鼠都接受了CX的第二次转移3在第一次过养转移后CR1-GFPe乐彩下载10d。在每次收养转移，5×105 将e乐彩下载注射到受体小鼠的眶窦中。对于e乐彩下载移植和骨折诱导，将动物用异氟醚麻醉。在将24号针插入髓内管中以稳定骨折后，使用滴重钝的断头台装置产生右股骨的闭孔横膈膜骨折。23）。丁丙诺啡（0.1mg / kg）被给予了S.C.在疼痛缓解的前2 d愈合期间。
统计分析
统计分析由学生进行 t 当ANOVA对多个组比较显着差异时，两组或单向ANOVA和Bonferroni的比较测试。重复所有实验至少两次，显示代表数据。使用图形棱镜6软件（GraphPad Software，San Diego，California）进行统计分析。
结果
下调CX.3BM. OCP中的CR1，差异化
确认cx3CR1可用于识别BM OCP，我们排序GFP−，GFP.低的和gfp.高的 BM. cells from CX3CR1-GFP.记者小鼠，增强GFP被淘汰 CX..3cr1 gene (16）用RANKL和M-CSF（两者为30ng / ml）培养它们5 d（图。1A, 1b）。陷阱染色证明了GFP− e乐彩下载没有区分陷阱+ OC, whereas GFP低的 e乐彩下载形成成熟OC，但它们的成熟率慢于GFP高的 e乐彩下载，因为它们在4-D培养物中展示了OC，所以要求8 d生产陷阱+ OC. (图。1A）。相比之下，GFP高的 e乐彩下载在4和8 d培养的体外产生OC。通过培养8d在牛皮质骨上培养的e乐彩下载的骨分解活性的测量发现GFP高的 e乐彩下载产生丰富的吸收。 GFP.低的 e乐彩下载在此时间点具有更少的再吸收活性，而GFP− cells had none.
bm ocps表达cx3CR1. (a）GFP的分布+ cells in CX3CR1-GFP.小鼠。电镀GFP后，96孔板的OC的数量−，GFP.低的和gfp.高的 每孔5000个e乐彩下载的e乐彩下载，并用M-CSF和RANK1处理4或8天。 GFP消极（GFP−），低，培养高，培养高群体以确定用M-CSF和RANKL培养8 d后的凹坑形成（n = 3 per group). (b）GFP.−，GFP.低的和gfp.高的 在相腺和荧光（前三个图像）下成像的e乐彩下载培养物，并且仅荧光光（底部三个图像）展示GFP表达。大型多核OC由GFP中的破折号概述高的 相位对比度和荧光图像的培养。图像在原始放大倍数×10下拍摄。
培养物的荧光成像证明了GFP– 文化没有成为GFP+ 与文化。相比之下，在GFP中高的 4 D后培养，未成熟单核GFP+ cells were present (图。1B）。显着性，GFP在GFP的4D培养中的成熟OC中的表达高的 e乐彩下载缺乏最小。这个结果并不意外，如CX3CR1表达先前证明了作为OCP成熟变为OCS（6, 24）。有4 d文化，GFP低的 单核e乐彩下载在等于GFP的水平下表达GFP高的 e乐彩下载在4 d培养。此外，它们在培养的第8天通过酶组织化学捕获阳性。这些结果认为，用M-CSF和RANKL处理4 D的处理诱导了GFP的开关低的 cells to GFP高的 e乐彩下载，其可以部分解释GFP的较慢成熟低的 与GFP相比，e乐彩下载进入OC高的 cells.
另外，确定CX的表达3CR1成熟OC并确认我们的体外结果CX3在差异化期间熄灭了ocps的cr1表达，我们越过cx3CR1-GFP.记者小鼠与陷阱TDTOMATO小鼠一起使用 Acp5 监管区域推动TDTOMATO荧光蛋白的表达（17）。我们培养了3CR1-GFP. / Trap TDTomato小鼠用M-CSF和RANKL进行5 D，并检查了GFP和TDTOMATO记者的表达。我们发现表达CX的e乐彩下载3CR1没有表达陷阱，反之亦然（图2A）。正如预期的那样，TDTOMATO主要在大型多核e乐彩下载中表达，而GFP仅存在于单核e乐彩下载中。此外，确认CX的下调3CR1，我们确定表达的时间过程 Acp5 (陷阱） 和 CX..3cr1 在培养的BMM中用M-CSF和RANK1处理（两者30ng / ml）。我们发现随着BMMS的差异化，表达 Acp5 在第6天的最高水平上从未检测到较高。相比之下， CX..3cr1 表达从第0天到第6天逐渐减少（图。2B）。因为单核cx.3CR1-表达培养物中持续存在的e乐彩下载（图2A），它并不意外 CX..3cr1 mRNA表达，通过文化第6天，从未陷入过度不可检测的水平。
CX.3CR1在OCP差异期间表达。 （a来自cx的bmm3CR1-GFP. / TRAP TDTOMATO小鼠用M-CSF和RANKL培养5天。黄色箭头仅识别表达GFP的单核e乐彩下载。还存在致力于OC谱系和红色荧光多核OCP的红色荧光单核OCP。到左边的图像是明亮场，红色和绿色荧光图像的复合。 （b）用M-CSF和RANKL（两者30ng / ml）处理BMM培养物和相对mRNA表达 ACP5 /β-肌动蛋白 和 CX..3cr1/β-肌动蛋白 确定在0,2,4和6日文中（n = 3–4）。数据被呈现为相对表达式标准化为β-肌动蛋白 ± SEM. (c）来自CX股骨的复杂区域的荧光灯图像3CR1-GFP. / TRAP TDTOMATO鼠标。三个底部图像是两个上部图像中的白色框的放大。这些分别示出了合并的，绿色和红色荧光图像（左）和用苏木精染色的相同部分并在明亮的场上成像。较低的三个图像（从左到右）是相同字段的合并（绿色和红色），绿色滤波和红色滤波图像。只有一个黄色oc（陷阱和cx表达的双阳性3CR1）可以在骨骼的任何地方检测到。黄色箭头表示CX3CR1单核e乐彩下载覆盖成熟的OC或OCP融合并过渡到成熟的OC中。在任何一种情况下，如果双重表达更频繁，则图像表明GFP和TDTOMATO蛋白的水平足以鉴定额外的黄色e乐彩下载。 （c）（上）的图像在原始放大倍率×10下拍摄。秤条，500μm。在幻灯片扫描仪AXIO扫描（Zeiss）上扫描部分，拼接拼接以在Zen Pro软件（Zeiss）中创建最终图像。首先扫描骨载玻片，用于DAPI，CX3CR1-GFP.和TRAP TDTOMATO，以及常规陷阱染色的第二次。
类似于CX的BMe乐彩下载培养物的结果3CR1-GFP. / TRAP TDTOMATO小鼠，通过冷冻部分组织学检查了来自3WK古动物的股骨，并且主要在与骨相邻的大型多核e乐彩下载中观察到的TDTOMATO表达，而GFP表达仅在小梁骨和BM中的单核e乐彩下载中观察到。 。我们确实发现偶尔的双阳性e乐彩下载，其代表覆盖e乐彩下载或从OCP转换到OC（箭头， 图2C.）。因此，我们的体外和体内数据都认为CX3CR1在OCP中表达，但在稳态中不成熟。
稳态期间，OCP在体内成熟率
我们接下来检查了CX的骨骼3Cr1creer / ai14小鼠。 AI14小鼠是CRE在CRE重组后表达e乐彩下载中TDTOMATO红色荧光蛋白的CRE报告系。 CX.3CR1Creer小鼠的突变CRE重组酶插入CX中3CR1基因。该ERT2CRE基本上是无活性，直至用他莫昔芬治疗小鼠。用抗RFP AB切割并染色冷冻股骨部分，以提高TDTOMATO信号的敏感性并通过免疫荧光进行显微镜检查。重要的是，来自cx的骨骼3未用他莫昔芬治疗的CR1Creer / Ai14小鼠仅表达偶尔表达TDTOMATO的e乐彩下载（主要SPONCIOSA，衬里骨表面的所有捕集阳性e乐彩下载的10.1±2.7％TDTOMATO荧光红e乐彩下载）（Fig. 3）。这结果证明了CX中CRE重组酶的最小“漏液”3Cr1creer / ai14小鼠。
CX.成熟3在稳态条件期间CR1 OCP在体内。来自CX的股骨骨的部分的图像3CR1creer / Ai14小鼠未在牺牲之前未注射三种毒素或注射1或5d，并且组织学分析。为了确定多核e乐彩下载，将部分染成DAPI（蓝色）。将他莫昔芬注射到小鼠中后，CX3用TDTOMATO（红色）标记CR1表达的e乐彩下载。用荧光衬底ELF97（黄色）捕获捕获部分并被倒荧光可视化。所有陷阱+ CX的e乐彩下载和双阳性e乐彩下载3统计初级Spongiosa中的CR1和陷阱，以确定从CX区分的成熟OC的百分比3CR1表达e乐彩下载。我们还确定单核CX3CR1+-Expructing BM中的e乐彩下载。图像在原始放大率×10下拍摄（n = 6用于非他莫昔芬治疗的控制， n 在Tamoxifen之前= 12表示1 D，和 n = 12对于5-D Tamoxifen组）。在幻灯片扫描仪AXIO扫描（Zeiss）上扫描部分，拼接拼接以在Zen Pro软件（Zeiss）中创建最终图像。首先扫描骨载玻片，用于DAPI，CX3CR1，明亮的领域和荧光陷阱，DAPI和明亮场的第二次。使用Adobe Photoshop CS6（6.0版，Adobe Systems Inc.，San Jose，CA）并在ImageJ中进行合并相同的部分的两个图像。秤条，500μm。 **p < 0.01, ***p <0.001（显着不同）。
单莫昔芬注射液后一天，CX3CR1Creer / AI14鼠标股骨显示得明显更多TDTOMATO+ 也是陷阱的e乐彩下载+ （35.0±4.6％）在主要spongiosa和衬里小梁骨表面中，大多数这些e乐彩下载单核（Fig. 3）。
单莫昔芬注射液后五天，CX的数量 3CR1 TDTOMATO陷阱双阳性e乐彩下载进一步增加（60.8±3.4％）（Fig. 3）。此外，5-D培养物中的e乐彩下载大于第1天的e乐彩下载，大多数是多核。我们还观察到在单一的三氧肟注射后在BM中表达TDTOMATO的许多单核e乐彩下载。然而，那些e乐彩下载是捕获阴性的，暗示它们是CX3CR1+ OCP或更可能是交替谱系的单核e乐彩下载。
评估OCP的循环或BM居留
ocp.可以在血液中循环（12）。因此，在先前实验的稳态条件下，成熟的OC可能起源于循环e乐彩下载或BM居民和非循环的e乐彩下载。为了测试循环e乐彩下载是否有助于在稳态期间体内癌症发育，我们表现出剖腹症。在这些实验中，我们在相同年龄（同胞迅速）之间的雌性WT小鼠和捕集TDTOMATO小鼠（在C57BL / 6背景中）之间产生了共用血液循环系统。为了评估共享循环，CD45（CD45.1和CD45.2）的同种型被用作e乐彩下载来源的标志物。将TRAP TDTOMATO小鼠（CD45.2）削减至WT小鼠，其是CD45.1的CD45.1。在手术前，通过流式e乐彩下载术分析来自两只小鼠的血液样品。在WT和陷阱TDTOMATO小鼠中，>90％的血e乐彩下载表达了它们各自的标记物（图4A）。为了确认剖腹产的充分性，我们评估了手术后2周的流式e乐彩下载术的共同血液循环的建立（图4A）。两只小鼠的血液具有CD45.1（WT，48.5±1.8％的混合物; TRAP TDTOMATO，34.0±2.2％） - 和CD45.2（WT，35.1±2.5％;陷阱TDTOMATO，54.4±2.7％） - 阳性e乐彩下载，证明确定了糖尿病小鼠之间的共同循环。在舌苔外科手术后处死4周。收获血液，脾和BMe乐彩下载以进行流式e乐彩下载术分析。血液和脾样品（图4A, 4b）显示在两只小鼠中的CD45.1-和CD45.2阳性e乐彩下载的类似混合物（表I.），而在BM（图4C., 表I.），来自其他靶标的e乐彩下载的植入水平较低（WT小鼠中5.4±0.8 CD45.2％，陷阱配对小鼠中的6.8±1.3％CD45.1）（图4D）。
评估循环或BM居民OCP。 （a“在建立粘性期后，从WT的血液和捕获TDTOMATO小鼠的e乐彩下载的流式e乐彩下载术分析和捕获TDTOMATO小鼠。分析活，核e乐彩下载以表达CD45.1和CD45.2。显示了仅表达CD45.1或CD45.2的e乐彩下载的百分比。通过类似结果重复实验八次，提出了代表性样本。 （b）从WT的脾脏的e乐彩下载流式e乐彩下载术分析，并在4周后捕获Tdtomato小鼠后的e乐彩下载。 （c）从WT的BM的e乐彩下载流式e乐彩下载术分析，并在4周后捕获TDTOMATO小鼠后的e乐彩下载。分析活，核e乐彩下载以表达CD45.1和CD45.2。显示了仅表达CD45.1或CD45.2的e乐彩下载的百分比。实验重复八次以相似的结果，显示代表性样品。 （d）上图显示从WT小鼠和CD45.2e乐彩下载的CD45.1e乐彩下载从陷阱TDTOMATO小鼠中的每个剖腹产的BM中的CD45.2e乐彩下载分析作为总核e乐彩下载的百分比。下图显示了在4周后从WT和捕集TDTOMATO慢率的BMM培养物中存在的荧光OC的数量。用M-CSF和RANK1培养e乐彩下载（每次30ng / ml）5天，然后在UV光下检查每孔的多核荧光e乐彩下载的数量（n 所有组= 4）。用类似结果重复实验两次。数据显示为平均值±SEM。 *p <0.01（显着不同）。 （e）来自WT和培养的6d培养后的培养后的培养后的BMe乐彩下载（5d培养后）的代表性相位对比度和血流荧光图像。将e乐彩下载用M-CSF和RANK1（每个rankl（每次30ng / ml）培养并在荧光下成像，以证明TDTOMATO（红色）表达。通过类似的结果重复八次实验，并显示代表性样品。秤条，200μm。
我们下次从WT和捕获TDTOMATO ParabionB的BMM与M-CSF和RANKL进行5天，并检查在UV光下在体外形成的OC，以确定每孔的多核荧光e乐彩下载的数量。与小鼠的BM中CD45.1和CD 45.2的流式e乐彩下载术的结果一致，我们在WT BMM培养物中仅显示了几（6.6±3.6％）荧光OC。相比之下，来自陷阱Tdtomato Parabiont的BMM培养物中的更多（164.3±1.6）荧光OC（图4D, 4e）。当我们用M-CSF和RANKL培养全-BMe乐彩下载时，获得了类似的结果并为6d（图4E.）。在这些实验中，通过酶组织化学确定的捕获阳性OC的总数在所有组中相似（数据未显示）。
在体内评价TDTOMATOe乐彩下载的植入后在一对小鼠的4周期后进行，在牺牲时，在牺牲时，患者为14周。在这些研究中，检查了八对的成对结果。来自陷阱Tdtomato小鼠的骨骼在14周龄，在骨骼上含有许多大e乐彩下载，这些骨骼是多核的，陷阱+ 通过酶组织化学和TDTOMATO+ 通过ab增强的epiflofloores度（Fig. 5）。实际上，我们发现，在捕集Tdtomato小鼠中，通过酶组织化学测量，所有Tdtomato阳性e乐彩下载也是捕获的阳性。相比之下，来自WT小鼠的骨骼含有少数，如果有的话，均为TDTOMATO+ 和 TRAP+ (Fig. 5）。然而，正如预期的那样，常规捕集酶组织化学染色证明了丰富的陷阱+ OC. in the WT mice.
×10。秤条，500μm。在幻灯片扫描仪AXIO扫描（Zeiss）上扫描部分，拼接拼接以在Zen Pro软件（Zeiss）中创建最终图像。首先扫描骨载玻片，对于DAPI和捕获TDTOMATO和常规陷阱染色的第二次扫描。使用Adobe Photoshop CS6（Adobe Systems Inc.版本6.0版本）合并相同部分的两个图像。
CX.3CR1-GFP.e乐彩下载移植
在打开或扰乱BM微环境的状态下，循环e乐彩下载可以是OCP的源（5, 11–14）。检查循环e乐彩下载在骨折修复期间作为OCP源发挥的作用，并确认CX的表达3CR1标签OCP，我们改编了Göthlin和爱立信的工作的协议（11）。 EGFP表达来自CX的BMe乐彩下载3CR1-GFP. / TRAP TDTOMATO小鼠被FACS分离并注射I.v.进入WT受者，无论是完整的还是患上股骨骨折。在第0天和10天后注射e乐彩下载，并在第18天处死动物。分类CX的全身移植3来自CX的BM的CR1-GFPe乐彩下载3CR1-GFP. / Trap TDTomato动物进入没有破裂的C57BL / 6小鼠未证明股骨中的任何捕集TDTOMATO阳性e乐彩下载。另外，只有几个cx3在这些小鼠的股骨的BM中存在CR1-GFP阳性e乐彩下载（Fig. 6）。
循环CX.3CR1-GFP.e乐彩下载不包含在完整小鼠的骨骼中的成熟OC中。从CX移植的C57BL / 6小鼠的股骨骨骼的图像的图像3CR1-GFP.e乐彩下载（从CX排序3CR1-GFP. / TRAP TDTOMATO小鼠）在第0天和10天和第18天牺牲。我们无法识别陷阱TDTOMATO+ e乐彩下载在完整股骨的主要spongiosa中（一种'）。一些cx.3BM.中存在CR1-GFPe乐彩下载，如绿色箭头所示（B'）（n = 4）。在幻灯片扫描仪AXIO扫描（Zeiss）上扫描部分，拼接拼接以在Zen Pro软件（Zeiss）中创建最终图像。首先扫描骨载玻片，扫描DAPI，捕获TDTOMATO，CX3CR1-GFP和明亮场，第二次扫描DAPI，荧光陷阱和明亮场的扫描部分。使用Adobe Photoshop CS6（Adobe Systems Inc.版本6.0版本）合并相同部分的两个图像。图像在原始放大倍数×10下拍摄。
相反，当将相同的e乐彩下载群移植到经过股骨骨折的C57BL / 6动物中时，在修复愈伤组织骨骼的骨后的第18天和新的骨后的第18天的第18天存在多核捕集性Tdtomato阳性e乐彩下载稳定销插入的道。这些e乐彩下载在骨骼，多核和捕获型捕集器上，如荧光elf97衬底染色，确认它们的骨酸脱离表型（Fig. 7）。同时 图。 6. 和 7，我们还观察到抗RFP AB的一些非特异性染色肌肉组织。
骨折修复诱导植入和循环CX的融合3CR1-GFP. OCP进入OC。从CX移植的C57BL / 6小鼠的股骨骨骼的图像 3CR1-GFP.e乐彩下载（从CX排序的e乐彩下载3CR1-GFP. / TRAP TDTOMATO小鼠）还破裂。接受CX的小鼠后右股骨被裂缝3CR1-GFP.e乐彩下载在第0天（断裂后立即）和10次后术后。在第18天后，小鼠牺牲了。在经过股骨骨折的小鼠的修复呼叫中，呼吸区域中也存在对捕获荧光酶组织化学（黄色）呈染色的捕获Tdtomato阳性e乐彩下载（红色）（以白色箭头表示）（ 一种'）在邻近稳定销占据的空间相邻的新骨中（B'）（n = 4）。在幻灯片扫描仪AXIO扫描（Zeiss）上扫描部分，拼接拼接以在Zen Pro软件（Zeiss）中创建最终图像。首先扫描骨载玻片，扫描DAPI，捕获TDTOMATO，CX3CR1-GFP和明亮场，第二次扫描DAPI，荧光陷阱和明亮场的扫描部分。使用Adobe Photoshop CS6（Adobe Systems Inc.版本6.0版本）合并相同部分的两个图像。图像在原始放大倍数×10下拍摄。
讨论
我们的结果与cx3CR1-GFP.小鼠证明了 CX..3cr1 启动子/增强子序列基本上鉴定BM中的所有e乐彩下载，其具有潜力在体外形成OC。这一结论是基于我们的发现，在CX中形成的文化中没有成熟的OC3CR1− 小鼠BMe乐彩下载。相比之下，在表达高水平的GFP的e乐彩下载培养物中，在体外和骨分解能力（8 d内）伴有快速（4 d）OC形成（8 d内）。e乐彩下载是GFP低的 需要更长的文化时间来形成成熟的OC，这表明小鼠BM CX3CR1-GFP.低的 与CX相比，e乐彩下载代表较少成熟的OCP3CR1-GFP.高的 e乐彩下载。我们预计如果培养超过8天，CX3CR1-GFP.低的 BMe乐彩下载最终形成丰富的吸收坑，虽然我们没有测试这个假设。
我们对CX的研究3CR1-GFP. / TRAP TDTOMATO小鼠在稳态条件下的C57BL / 6背景中争辩说CX3CR1基本上仅在OCP中表达，而不是成熟的OC。在体外，我们发现，几乎所有来自这些小鼠的单核e乐彩下载表达了GFP或TDTOMATO标志物，少量相信两者。此外，在BMM培养物中区分OCP的基因表达证明了 CX..3cr1 迅速减少，而 Acp5 在oc差异期间往常增加。同样，在体内，我们发现TDTOMATO-阳性OC几乎都是负面的GFP，而几乎所有GFP + OCP没有表达TDTOMATO。我们推测少量阳性的e乐彩下载（表达CX3CR1 [绿色]和陷阱[红色]）表示覆盖e乐彩下载或从OCP转换到成熟OC。
类似于我们的结果，韩等人。 （25）从CX检查稳态小鼠骨骼的部分3CR1-GFP.小鼠，并在单核捕集阴性e乐彩下载中发现丰富的荧光，多核捕获阳性OC中的荧光很少。同样地，Ibáñez等。 （10），使用流式e乐彩下载术在它们与小鼠骨体分离的e乐彩下载上，发现在稳态条件下，只有小百分比（4-7％）的OC表达CX3CR1蛋白质。
但是，Ibáñez等人。确实发现在炎症条件下CX的表达3CR1维持在OC的亚型中。该结果表明，OCP有多种起源，并且炎症的条件维持CX3cr1成熟oc的表达（10）。有趣的是，在我们对裂缝修复过程中循环e乐彩下载的OCP分化的研究中，与炎症相关的状态（26），我们没有看到GFP+-oc，表明cx的表达3CR1。然而，骨折修复中炎症反应的峰值发生在于第18天早期，因此，通过这次，CX的oc表达3CR1已经熄灭了。
来自CX的研究的数据3CR1Creer / Ai14小鼠体内展示了CX的最小泄漏量3CR1CER构建，因为，在没有Tamoxifen的情况下，如果有的话，如果有的话，则存在TDTOMATO阳性e乐彩下载。相比之下，1 d在单一注射他莫昔芬之后，股骨在小鼠中表现出显着增加的Tdtomato阳性和捕获阳性e乐彩下载。与成熟的多核oc，捕获量相比，这些Tdtomato阳性e乐彩下载相对较小，通过酶组织化学测量，并且最有可能代表单核CX 3CR1表达OCP或CX3CR1表达其他谱系的单核e乐彩下载。我们预期，如果成熟的OC表达了大量的CX3在这些条件下，CR1蛋白质，大量的多核OC将在Tamoxifen注射液后用Tdtomato报告者标记，我们没有看到。在5岁后，在主要Spongiosa中有丰富的TDTOMATO阳性，大型多核骨，骨骨。因此，类似于我们的体外结果，我们的体内数据争辩说 CX..3cr1 启动子/增强剂序列识别迅速（在5 d）中形成成熟OC的OCP。
5天的时间是从CX体内的OCP中形成成熟oc的时间3CR1Creer / Ai14小鼠类似于最成熟的OCP在体外形成OC的时间（Fig. 1）（2, 27）。因此，似乎这个时间段是来自OCP的OC的成熟并且不是体外培养系统的独特特征的固有。
已知OCP可以用扰动的微环境循环和植入骨骼（14）。然而，如果循环e乐彩下载是患者在稳态条件下的骨骼中形成的主要成分，则目前尚不清楚。我们的矛盾病研究认为，在这些研究的条件下，OC的循环前体的生产是一个相对罕见的事件。类似于我们的结果，Boban等人。 （13[否则在Col3.6GFP和Col2.3ΔTK小鼠之间的曲根中，除非用杀死成骨e乐彩下载杀死成骨e乐彩下载并将BM微环境杀死并将BM微环境杀死，否则在Col3.6GFP和Col2.3ΔTK小鼠之间的曲线中，否则不会发生靶伞之间的植入。然而，这些研究使用COL 3.6启动子在OC中驱动GFP表达，并且可以认为GFP的这种脱靶表达可能不会产生oc中荧光标记的水平，其浓度足以通过离荧光容易地检测。
Kotani.等人。 （12）在使用CX的正常稳态期间还证明了在BM期间循环单核e乐彩下载祖e乐彩下载的最小植入3CR1-GFP.小鼠标记为e乐彩下载。然而，它们的方法也可能具有普遍的e乐彩下载数量，这些e乐彩下载的数量从骨骼到骨循环并成熟成OC。这是因为我们的数据和他人的数据（6, 7）证明了 CX..3cr1 他们用于推动GFP表达的启动子可以快速下调，因为OCP成熟成OC。
相比之下，我们的研究使用了强大的 Acp5 推动者/监管区域在OC中推动高级TDTOMATO表达，如体外和体内所证明的那样。此外，为了进一步增强我们的检测测定的敏感性，我们将AB用于TDTOMATO，但仍未发现在Parabionts之间的OCP的重要植入。根据我们的结果，由4周的曲目过敏以及我们在CX中的发现3Cr1creer / Ai14小鼠在5天内分化为OC，我们得出结论，循环e乐彩下载在我们研究的剖腹症条件下代表OCP的次要来源。
有几项研究，表明BM环境可以通过在各种扰动后循环OCP来打开植入。在一个精英的研究中，沃克（14）发现，由于小鼠中的OC缺陷，骨质异步，可以通过具有正常小鼠的骨质术例的剖腹产曲调来治愈。同样地，Göthlin和爱立信（11）将标记的e乐彩下载注入到经过骨折的大鼠的血液中，并显示将标记的e乐彩下载掺入溶解的愈伤组织中的OC中。 Kotani等人。 （12）发现通过用RANKL注入小鼠刺激小鼠中的骨吸收后，将标记的循环OCP良好转移到成熟OC中，而Charles等人。 （5）显示循环OCP可能成为正在发生炎症的骨中的OC。
我们的实验，其中Facs纯化的GFP+ BM. cells from CX3将CR1-GFP / TRAP TDTOMATO小鼠用修复股骨骨折转移到小鼠中，证明了CX3CR1标记为BMe乐彩下载，当释放到循环中时，可以在断裂修复期间成为OC。这些研究还证实了环境条件对循环ocp循环到植物的能力，并在体内分化为OC。最后，循环cx的失败3CR1+ OCP掺入未裂缝的小鼠的骨骼中的oc进一步争辩说，在稳态期间，通过循环OCP相对保护BM。
对这一假设的额外支持来自我们对患有CRE重组酶的小鼠的研究敲入了组织蛋白酶K基因（28）与AI14报告小鼠交叉（29）。使用这种鼠标模型作为OCP的来源，我们发现从猫-K-CRE / -ai14小鼠单一注射高度纯化的BM或脾脏OCP后，BM中的e乐彩下载或它们的成熟植入oc非辐射的小鼠（29）。相反，在辐照小鼠（9GY）中，BM或脾e乐彩下载存在显着的植入，这些形成的多核成熟OC是陷阱+ 在15 d Postradiation和移植的resorption Lacuna中（29）。我们的曲静脉的结果与我们的收养转移研究一致，如上所述，以及他人的概述（10, 30）需要对骨髓微环境进行一些扰动用于植入和循环OCP循环成熟OC以发生在骨中的成熟。
然而，我们的结果与Jacome-Galarza等人相反。 （15）据表明，在4-8周后，在糖尿病动物中，基本上含有骨表面的OC衬里表达了YFP（宿主）和TDTOMATO（供体）记者，并且在分离拨足仍然存在至少24周的e乐彩下载。此外，在他们的研究中，他们展示了LY-6C的成功植入+ monocyte from Csf1rICRE.;罗莎26.lsl-tdtomato. mice into Csf1r克瑞斯;罗莎26.lsl-yfp. 通过转移后的小鼠，不照射受体小鼠。我们和Jacome-Galarza等人。 （15）使用相同的抗RFP AB来增加冷冻部分中的TDTOMATO信号检测。因此，我们认为，我们可以检测瘫痪之间的移植电池的能力与他们相似。我们亏本充分解释了我们研究之间的矛盾结果。鉴于养养和使用辐射或其他扰动的长期经验，允许植入，这是意外的jacome-galarza等。 （ 15）在稳态条件下发现循环OCP的显着BM植入。作为我们的结果之间差异的可能解释，我们假设Jacome-Galarza等人。 （15）用两只不同的记者削减小鼠产生炎症反应。 Tillecke等人。 （31）显示，如GFP等荧光记者可以诱导免疫应答，其比BALB / C小鼠更强，而不是C57BL / 6。 Jacome-Galarza等人的研究。 （15）没有报告使用的动物的背景，但在糖尿病动物中使用的两位不同的记者可能会引起足够的炎症条件，这增加了植物的植入。因为在我们的所有实验中，我们使用了对报告蛋白的免疫反应较低的C57BL / 6只小鼠，我们认为我们的研究中的瘫痪更像是完整鼠标的稳态状态。我们在小鼠的脾脏中对另一个parabiont的高水平植入e乐彩下载的证明和动物在曲根病过程中的一般健康状况认为，我们在我们削减的动物中没有炎症反应，这些动物摧毁了骨中的e乐彩下载另一只小鼠并导致瘫痪之间没有可检测的OCP转移。我们的研究结果是i.v.用修复骨折[与炎症有关的状态（与炎症相关的状态）注射标记的OCP26）]产生的植入和将标记的OCP掺入OC，而将标记的OCP注射到完整的小鼠中没有，进一步争辩说，炎症本身不是我们未能发现植物在稳态模型中循环ocp的植入和成熟的原因。
总之，我们的结果表明CX3表达CR1表达的e乐彩下载是OCP，当它们在体外和体内分化到稳态和小鼠的骨折修复期间，当它们分化为成熟oc时，该基因的表达下调。此外，我们对陷阱TDTOMATO-WT-WT-PARABSASED小鼠的研究以及在骨折修复期间循环OCP的过度转移研究争辩说，在成人小鼠的稳态条件下，BM是在骨骼中形成成熟OC的OCP的主要储存库，而当BM完整性被骨折扰乱，而循环CX3CR1+ e乐彩下载在断裂修复期间可以成为OC。
披露
作者没有财务利益冲突。
致谢
我们感谢Nathaniel A.涂抹允许使用Axio扫描成像系统的染料。
脚注
该工作得到了国家关节炎和肌肉骨骼和皮肤病奖R01 AR048714至J.A.L的支持。和奖项AR055607和AR070813至I.K.
本文中使用的缩写：
- BM.
- 骨髓
- BM.M
- BM.巨噬e乐彩下载/单核e乐彩下载
- OC.
- 骨壳
- ocp.
- oc祖先
- WT.
- 野生型。
- 已收到 2019年6月13日。
- 公认 2019年12月12日。
- 版权© 2020 by The 美国免疫学家协会, Inc.
