切削刃：IL-6驱动的免疫失调严格依赖于IL-6Rα-链表达

结果和讨论

细胞因子IL-6使用各种信号传导方式（即，经典信令， trans - 股票，群集信令[也称为 trans-推介会]） （2）并且甚至可能通过由CD5和GP130组成的替代受体复合物（7）。为了在夸张的IL-6生产条件下评估IL-6的信号传导方式，我们在体内创造了一种鼠系统的无菌IL-6过表达。为此，我们生成携带CAG-（LOXP）停止（LOXP）-IL-6-IRES-EGFP构建的小鼠 Rosa26 轨迹。接下来，我们使用树突细胞（DC）-directed CD11C-CRE转基因小鼠（12）从我们的单个副本激活IL-6过表达（OE） Il6 在il-6rα的小鼠中的转基因 - 足够的背景（IL-6 ^DC.-OE. Il6ra^{+ / +} 和 IL-6^DC.-OE. Il6ra^+/- [i.e., IL-6^DC.-OE.]）和IL-6Rα缺陷的背景（IL-6^DC.-OE. Il6ra ^{- / -} ）。作为进一步的对照，我们使用IL-6Rα - 足够的（控制）和IL-6Rα缺陷（Il6ra ^{- / -} ）没有IL-6过表达的小鼠（补充图1A）。

为了直接评估IL-6过表达，我们测量了5-6-WK型突变小鼠血清中的IL-6水平。如预期的那样，与野生型对照和野生型对照相比，IL-6过表达的一组小鼠显示出IL-6水平升高 Il6ra ^{- / -} mice (图。1A）。 IL-6含量在IL-6水平显着高。^DC.-OE. mice than in IL-6^DC.-OE. Il6ra ^{- / -} 小鼠，暗示在足以IL-6Rα的小鼠中的IL-6表达的正馈回环。机械上，转基因IL-6可以促进IL-6中的IL-6表达^DC.-OE. 小鼠，来自内源性的 Il6 基因座，响应其自然监管仍然存在响应。此外，IL-6形成血液中可溶性IL-6Rα和GP130的复合物，其可以仅在IL-6Rα中延长其半衰期，但不在IL-6Rα缺陷的小鼠中（14, 15）。

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图1。

IL-6R.α–dependent mortality of mice with IL-6 overexpression. (A通过ELISA测量的小鼠血清中的IL-6水平。点绘图图显示了单个小鼠的值和每个组的平均值。 （B）CD11C-CRE介导的IL-6通过脾脏中的EGFP共表达报告的IL-6过表达。数据描绘了具有平均每组频率的代表FAC图。使用每组三到四只小鼠。对于完整的门控策略，请参阅 补充图1B。 （C）Kaplan-Meier曲线描绘了所指出的小鼠菌株的存活。 （D）脾细胞IL-6Rα表达的中值荧光强度（MFI）。条形图显示每个组+ SD的平均值。同种型对照被染色于来自的相应的细胞群体上 Il6ra^{+ / +} 老鼠。使用每组4只小鼠。对于代表性IL-6RαFACS染色，参考 补充图2A。 （E）STAT3磷酸化的Western印迹分析响应于IL-6在体外（10ng / ml）的总脾细胞中的IL-6刺激。双尾未配对 t 测试用于（a）和（d）; Gehan-Breslow-Wilcoxon试验用于（c）。所有实验均进行两到三次以相似的结果进行。 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.

为了分析转基因IL-6的细胞来源，我们评估了CD11C-CRE介导的切除后CAG启动子驱动的EGFP报告表达 loxp. 侧翼的盒式磁带。正如所料，我们在IL-6中发现了EGFP表达式^DC.-OE. 和 IL-6^DC.-OE. Il6ra ^{- / -} mice (图。1B, 补充图1C）。由于CD11C-CRE重组酶表达泄漏（16），我们还注意到其他骨髓细胞和这些小鼠的T和B细胞中的有限报告表达（补充图1C）。

IL-6的高系统水平最终导致了IL-6的死亡^DC.-OE. 小鼠以IL-6Rα依赖的方式（图1C.）。 IL-6过度抑制小鼠携带两份副本 Il6ra 在6周内死亡，而删除一个 Il6ra 等位基因（一个 Il6ra 等位基因在杂合中完好无损 Il6ra^+/- 小鼠延长了IL-6的生存^DC.-OE. 小鼠直到11周龄。令人惊讶的，缺乏缺陷 Il6ra 恢复了IL-6的生存^DC.-OE. Il6ra ^{- / -} 具有IL-6过表达的小鼠，因此，完全救出了IL-6的表型^DC.-OE. 老鼠。注意，41分中的3个 Il6ra ^{- / -} 小鼠在观察期内死亡，可能是因为他们的免疫缺陷（17），无论IL-6过表达如何。

为了研究IL-6Rα表达对IL-6信号传导的影响，我们来自野生型的脾细胞（Il6ra^{+ / +}）， Il6ra^+/-， 和 Il6ra ^{- / -} 老鼠。我们观察到CD4上的强大IL-6Rα表达⁺ T细胞，在较小程度上，在CD11b上⁺ 骨髓细胞，但在CD19表达非常有限⁺ B细胞在野生型小鼠中（图。1D）。删除一个单一的 Il6ra 等位基因导致了IL-6Rα表达的降低，表明了一种臭氧低量的基因剂量效应（图。1D），其中，与IL-6Rα-阳性细胞的频率降低 Il6ra^+/- mice (补充图2A），可能有助于降低IL-6的死亡率^DC.-OE. Il6ra^+/- 与IL-6相比的小鼠^DC.-OE. Il6ra^{+ / +} mice (图1C.）。为了确定下游信号传导事件中缺乏IL-6Rα的后果，我们刺激了分离的总脾细胞 Il6ra^{+ / +}, Il6ra^+/-， 和 Il6ra ^{- / -} 用IL-6小鼠并评估其STAT3磷酸化。我们仅在野生型和野生型中观察到STAT3磷酸化 Il6ra 杂合细胞，而 Il6ra ^{- / -} 用可溶性IL-6刺激脾细胞不负责任（图1E., 补充图2b）。 FACS-Sorfed CD5⁻ 和 CD5⁺ B细胞，以及CD5⁺ 孤立的T细胞 Il6ra ^{- / -} 小鼠也没有响应可溶性IL-6，而它们的野生型对应物响应可溶性IL-6而显示出明确的STAT3活化（补充图2C）。相反，IL-6Rα缺陷的B细胞（无论CD5表达），IL-6Rα缺陷型T细胞是否存在于IL-6的外源IL-6Rα存在的IL-6中，其代表IL-6 / IL-6Rα融合蛋白（补充图2C）。这些数据表明了 Il6ra ^{- / -} 细胞保留响应IL-6的能力 trans - 对于经典IL-6信号传导，IL-6Rα表达是无冗余的。其中，这反驳了替代受体分子可以补偿缺乏IL-6Rα表达的概念。

由于IL-6过表达，CD11b⁺ 骨髓细胞渗透渗透次级淋巴器官，导致IL-6Rα的脾肿大 - 足够的IL-6^DC.-OE. mice (补充图3）。在LY-6G中观察到对转基因IL-6的响应最大的增加⁺中性粒细胞和LY-6C^你好 单核细胞/巨噬细胞（图2A）。值得注意的是，在IL-6中，这些髓壳子集的全身增加完全消除^DC.-OE. Il6ra ^{- / -} 小鼠缺乏IL-6Rα。 IL-6中可能是系统性炎症反应^DC.-OE. 小鼠取决于骨髓细胞的大规模扩增。

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图2。

小鼠的IL-6过表达导致CD11b的数量增加⁺ 细胞并影响B和T细胞室的组成。 （A中嗜中性粒细胞的分数和绝对数量（LY-6G⁺）和单核细胞（LY-6C⁺）在指定的小鼠菌株的脾脏中。 （B）B-1A细胞的分数和绝对数（定义为VD⁻CD90.2⁻CD19⁺IgM.⁺CD23⁻CD5.⁺CD43⁺ 细胞）和B-1B细胞（定义为VD⁻CD90.2⁻CD19⁺IgM.⁺CD23⁻CD5.⁻CD43⁺ 细胞）在指定的小鼠菌株的脾脏中。 （C）野生的分数和绝对数量（CD44⁻CD62L^高的）和效应（CD44⁺CD62L⁻) CD4⁺ 表明小鼠菌株的脾脏中的T细胞。 （DCD4对CD5表达的FACS分析⁺ 表明小鼠菌株的脾脏中的T细胞。数据描绘了具有CD5阳性细胞的定义的代表FACs直方图。点绘图图描绘了CD5表达的平均荧光强度（MFI）和单个小鼠的同种型对照，平均值每组。 （ ESTAT3磷酸化的Western印迹分析响应于体内IL-6过表达和在CD19中体外（100ng / ml）的IL-6刺激⁺ B cells and CD4⁺ T细胞。数据（A-C）描绘了具有平均每组频率的代表FACS图。点绘图图显示了单个小鼠的值和每个组的平均值。使用每组三到四只小鼠。双尾未配对 t 测试用于（a） - （d）。所有实验均进行两到三次以相似的结果进行。 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.

最初，IL-6被命名为“B细胞杂交瘤生长因子”，以确认其在B细胞上的刺激功能（18）。虽然我们没有检测到B细胞表面上的IL-6Rα的鲁棒表达（图。1D），IL-6可以配对可溶性IL-6Rα并作用于表达GP130的B细胞。重要的是，最近的一项研究表明IL-6可以在B细胞上与CD5结合，并独立于IL-6Rα激活STAT3（7）。在B细胞中，CD5表达被限制为B-1A细胞，将该子集识别为IL-6-CD5信号模块的主要目标（19）。值得注意的是，IL-6对IL-6Rα的过表达的小鼠在脾脏中表现出B-1A细胞的显着减少（图。2B），而IL-6Rα缺乏完全阻止IL-6中的IL-6触发的B-1A细胞丧失^DC.-OE. Il6ra ^{- / -} mice (图。2B）。

因为CD4.⁺ T细胞表达高水平的IL-6Rα（图。1D），我们分析了用活化的IL-6途径的小鼠中的T细胞室。我们注意到CD44的重大转变⁺CD62L⁻ effector CD4⁺ IL-6脾脏中的T细胞^DC.-OE. 与测试的其他组相比（图2C.）。但是，效应器CD4的频率⁺ 在IL-6Rα删除后，T细胞响应于夸大的IL-6表达再次正常。根据上一份报告（20），我们发现CD4上的丰富CD5表达⁺ 然而，T细胞无论其IL-6Rα状态如何（图2D）。

在用IL-6过表达中测试小鼠特定淋巴细胞亚群的STAT3活化，我们通过CD19的裂解物进行免疫印迹⁺ B cells and CD4⁺ T细胞。两种细胞类型与IL-6隔离^DC.-OE. 小鼠在没有额外的体外IL-6刺激的情况下展示了Stat3磷酸化，没有额外的刺激（图2E.）。重要的是，稳态STAT3磷酸化（以及响应于外源IL-6体外刺激的STAT3磷酸化）绝对依赖于至少一种副本的存在 Il6ra in CD19⁺ B cells and in CD4⁺ T cells (图2E.）。

在目前的研究中，只要它们保持在IL-6Rα - 足够的背景，我们观察到过表达IL-6的小鼠中的致死免疫病理学。在具有IL-6过表达的几种遗传模型中（在REF中审查） 21），我们以CD11C-CRE依赖性方式激活由CAG启动子驱动的鼠IL-6过表达。通过遗传消融 Il6ra，完全救出了与转基因IL-6小鼠的小鼠的深度免疫失调表型。这符合任何IL-6信号传导系统的生物学意义，该系统将与IL-6Rα无关。在我们的模型中，我们无法绘制一个明确的结论，以及哪个IL-6信号传导方式（即，经典IL-6信令，IL-6 trans - 股票，或IL-6簇信令[trans - Presentation]）是IL-6致命免疫失调的最相关的IL-6信号态^DC.-OE. 老鼠。所有三个信令模式都依赖于接收电池（经典IL-6信号传导）的侧面的IL-6Rα或以可溶性方式（IL-6）在捐赠细胞侧面（IL-6 trans - 股票）或以细胞束缚方式（IL-6 trans-推介会） （2, 6）。在稳定状态下，CD4⁺ T cells and CD11b⁺ 骨髓细胞表达相对高水平的膜结合的IL-6Rα。因此，我们推测，至少最初，IL-6过表达通过经典IL-6信号传导在淋巴细胞和骨髓细胞中运行。 IL-6粒细胞的大规模扩增^DC.-OE. 小鼠是一种稳健的观察。但是，仍有待确定是否扩展LY-6G⁺ cells in IL-6^DC.-OE. 小鼠是IL-6的直接影响。最近，已经提出了循环粒细胞可以直接响应IL-6（22）。

虽然我们没有旨在对IL-6过表达的直接和间接影响造成毁灭性炎症，但我们的数据迫使支持IL-6Rα在小鼠中介导IL-6效应的绝对要求。我们的研究未确认为B细胞提出的IL-6-CD5信号模块（7）挑战IL-6 / CD5 / GP130复合物转导的IL-6信号的生物学意义。我们的结论据近期发现可溶性CD5，尽管IL-6的结合，不能在表达GP130表达的细胞中诱导STAT3介导的信号转导（8）。