Malat1 Suppresses 免疫 to Infection through Promoting Expression of 黑手党 和 白介素10 in Th 细胞s

Malat1 is SUPpressed at the early stages of CD4⁺ T细胞活化

深入了解CD4中非编码转录组的作用⁺ 在T细胞功能方面，我们通过使用大量RNA-seq确定体外Th1极化条件下lncRNA表达的早期（24小时）变化来开始我们的研究。我们鉴定了120个差异表达的lncRNA，其中大多数是基因间的，分布在整个基因组中（图1A）。随着lncRNAs表达的变化（图1B），我们在分析中设置了其他标准，并确定了CD4中表达的23种lncRNA⁺ T细胞 at FPKM>20并受到差别监管（对数₂ 倍数变化[LFC]> 1 or LFC <-1）在天真和24小时激活的CD4之间⁺ T细胞（图1C, 1D）。我们观察到已鉴定的lncRNAs表达的变化与其染色体相邻基因之间的显着相关性（补充图1A），从而推断出lncRNA介导的CD4顺式调节作用的存在⁺ T细胞转录组，与先前的研究一致（1）。

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图1。

激活天然CD4后鉴定差异调控的lncRNAs⁺ T细胞揭示 Malat1 SUPpression as a hallmark of Th cell activation. (A）LFC统计上显着差异调控的lncRNA（错误发现率<原始CD4激活24小时后每条染色体0.05）⁺ 在Th1条件下的T细胞。表达由大量RNA-seq（ n = 4）。 （B原始和激活（24 h，Th1条件）CD4中lncRNA表达的分布⁺ T细胞。 （C所有差异调节的lncRNA的表达与LFC的关系。虚线表示LFC = 1且FPKM = 20。D）最高度表达和差异表达的lncRNA的表达热图。对于具有LFC的下调lncRNA> 1 和 naive CD4⁺ FPKM>显示了20个。对于具有LFC的上调lncRNA>1和Th1激活的CD4⁺ FPKM> 20 are shown. (E）的表达 Malat1 和 Neat1 在幼稚和Th1激活的CD4中⁺ 通过qRTPCR确定T细胞（激活后24小时）。将表达相对于U6 核糖核酸进行标准化，并在天然CD4中平均表达⁺ T细胞。 （F) Malat1 在体外分化的Th0，Th1和Th2细胞（第6天）中测定其表达。将表达相对于U6 核糖核酸进行标准化，并在天然CD4中平均表达⁺ T细胞。 （G) Malat1 Th1分化过程中的表达，标准化为天然CD4⁺ T细胞。

我们进一步调查了高表达和差异调控的lncRNA的列表，并注意到 Malat1 (图1C）是高度表达失调的lncRNA，在小鼠和人类基因组之间也保守（Gm26917 和 Gm26836 表达水平高于 Malat1 但在人类基因组中没有明显的序列或同系同源物）。值得注意的是 Malat1 在原始CD4中位于最高2％最高表达的转录本之内⁺ T细胞（补充图1B）。 Malat1 SUPpression 原为 confirmed by 定量RT-PCR (qRTPCR) (图1E）。 Neat1，与 Malat1 在小鼠和人类基因组中，也发现在CD4的24小时内被显着下调⁺ 通过qRTPCR激活T细胞（图1E）。下调 Neat1 在CD4上⁺ 在我们的RNA-seq分析中，T细胞活化未达到统计学意义，可能是由于较高的变异性和较低的绝对表达 Neat1 和....相比 Malat1 in CD4⁺ T细胞（补充图1C）。压制 Malat1 和 Neat1 在体外分化的Th0-，Th1-和Th2-极化条件的终点（第6天）也观察到表达图1F）。都 Malat1 和 Neat1 在幼稚的CD4小时内被下调⁺ T细胞活化（图1G, 补充图1D）。 The above results revealed that the rapid SUPpression of Malat1 和 Neat1 表达是CD4早期lncRNA签名的关键特征⁺ T细胞活化。

Malat1 SUPpression is a transcriptomic hallmark of CD4⁺ T细胞活化

深入了解是否 Malat1 SUPpression 原为 associated with CD4⁺ T细胞功能，我们首先分析了先前发布的单细胞RNA-seq数据集，以探索体内Th1细胞的出现（17）使用 疟原虫特异性TCR转基因CD4⁺ T（PbTII）细胞转移到同种标记的小鼠中，并在感染后第2、3、4和7天（p.i.）恢复 个人电脑如. In agreement with the observed SUPpression of Malat1 在我们的体外实验中（Fig. 1），我们观察到 Malat1 和 Neat1 CD4下调⁺ 体内T细胞活化，在第3天和第4天达到最小，然后在第7天相对增加（图2A, 2B）。体外观察 Neat1 表达低于 Malat1 在体内的Th1细胞中图2A, 2B）。

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图2。

与转录相关的转录单位和转录因子 Malat1 在体内单细胞水平表达。 （A）的标准化成绩单计数 Malat1 单身 疟原虫特定的CD4⁺ 在感染后指定的时间点分离的T（PbTII）细胞 个人电脑如。显示了平均值和95％的置信区间。 （B）的标准化成绩单计数 Neat1 在感染后的指定时间点分离的单个PbTII细胞中 个人电脑如。显示了平均值和95％的置信区间。 （C）在负相关程度显着（p < 0.05) genes with Malat1 从分离的PbTII细胞中 个人电脑被AS感染的小鼠（每天7天）。 （D的相关系数热图 Malat1 并指出 Malat1相互作用的mRNA（21，细胞）中的单个PbTII细胞 个人电脑被AS感染的小鼠每天7 d。 （E的相关系数 Malat1 并指出 Malat1相互作用的mRNA（左 y轴，红色）来自 个人电脑如感染小鼠（7 d p.i.）与未成熟CD4体外激活Th1 24小时后的平均LFC⁺ T细胞（右 y轴，蓝色）。显示了显着差异表达的基因（FDR<0.05）在Th1激活原始CD4 24小时后⁺ T细胞。 （F）在负相关程度最高的（p < 0.01) genes with Malat1 在单个体外分化的Th2细胞中。 （G）与显着相关基因的STRING网络 Malat1 在体内的PbTII Th1和体外的Th2细胞中，单细胞水平的浓度都很高。功能集群编号并显示。

接下来，我们搜索与 Malat1 单细胞水平的表达。我们使用PbTII CD4的数据进行了这些分析⁺ 每天第7天的T细胞因为这是观察到最强的Th1反应的时间点（17）。在此时间点，根据IFN-γ和CXCR6表达而不是所有CD4 铅钛矿细胞在门控Th1细胞中进行分析。我们寻找基因的表达与的表达正相关或负相关。 Malat1。令人惊讶的是，我们发现687个基因与 Malat1 在Th1细胞中，有609（88.6％）呈负相关（即 Malat1 水平证明这些基因水平高）。我们注意到，这并不是纯粹由于以下事实 Malat1 在Th1细胞中被下调，因为对 伦皮特，在CD4中具有类似基础表达的lincRNA⁺ 激活后也会下调的T细胞（图1C）没有显示出类似的负相关偏见（补充图2A）。 Neat1 在正相关的基因内（补充图2B），与显示两个lincRNA相互调控的报告一致（18）。负相关基因的基因本体分析显示，RNA结合，核糖体功能，代谢和细胞结构/定位中涉及的基因大量富集（图2C）。我们注意到，这些是与细胞激活有关的过程，特别是与幼稚的CD4相关的过程⁺ T细胞分化为效应Th细胞（19, 20）。分析已发布的一组 Malat1胚胎干细胞中的相互作用mRNA（21）表示 Malat1 有可能与共调基因的43个mRNA相互作用（图2D）。值得注意的是，在Th1激活的24小时内，这些基因中的19个在统计学上也有显着差异表达，并有上调的主要趋势（图2E）。

评估以上是否 Malat1关联的基因标记特异于Th1细胞，我们分析了先前发布的单细胞RNA-seq数据集，以探索体外极化的Th2细胞中的基因表达（22）。 Malat1 体外分化Th2细胞（1946年）中的表达与更高数量的基因显着相关（相比于Th1细胞） 个人电脑被AS感染的小鼠。与Th1细胞的情况一样，大多数 Malat1 其他基因均为阴性（1946年为1455，占74.8％）。同样，对于Th1细胞的观察结果，两者之间又存在正相关 Malat1 和 Neat1 (补充图2C）。值得注意的是 Neat1 是唯一邻近的基因 Malat1 与 Malat1 在Th1和Th2细胞中（补充图2D），表明 Malat1 has limited in cis regulatory effects in Th cells. This 原为 further SUPported by expression analyses in WT 和 Malat1^-/- 的细胞 Neat1 和 Scyl1，两个染色体上相邻的基因 Malat1. Neat1 幼稚水平较低 Malat1^-/- CD4⁺ T细胞和 Scyl1 体外分化水平更高 Malat1^-/- Th2细胞，但在三种细胞类型之间这些效应并不一致（补充图2E）。与单Th1细胞的情况一样，对负相关基因的基因本体分析再次表明，与RNA结合，核糖体功能，代谢和细胞周期有关的基因大量富集（图2F）。与152个基因显着相关的基因 Malat1 在单个Th1和Th2细胞形成的功能簇中，都在RNA加工，核糖体功能，代谢和蛋白质降解中起作用（图2G, 补充图2F）。总体而言，这些结果表明，在单细胞水平上， Malat1 SUPpression in Th cells correlated with induction of key gene networks 在CD4上⁺ T细胞活化。

Malat1 controls 白介素10 expression in Th cells in vitro

发现了 Malat1 SUPpression is a hallmark of Th activation, we tested the effect of Malat1 Th激活时缺失。我们发现，在对幼稚CD4进行体外分化后⁺ T细胞到Th1， Malat1^-/- cells displayed a reduction in levels of 干扰素 that did not reach statistical significance but significantly reduced expression of the immunoregulatory cytokine 白介素10. Upon Th2 differentiation, there 原为 also a significant reduction in 白介素10 levels, with IL-4 being unaffected (图3A–C）。 The effect on 白介素10 原为 more prominent in Th2 cells, which express 你好gher levels of 白介素10 比Th1细胞在体外（图3A, 3B）。 We also observed a reduction in 白介素10 mRNA levels (图3D）。我们在弱极化条件下重复了这些实验，发现 Malat1 loss on 干扰素 expression in suboptimally activated Th1 cells but no effects on 白介素10 或IL-4 和 Il-10 under weakly polarizing Th2 conditions (补充图3A）。 Malat1 loss also SUPpressed 白介素10 和 IL-17 expression under Th17-differentiation conditions (补充图3B）。除了基因敲除 Malat1，以 Malat1 with antisense oligonucleotide gapmers also SUPpressed 白介素10 at the mRNA level 在Th1和Th2细胞中（图3E, 3F）。在Th2细胞的蛋白质水平也观察到了这种作用（图3G）。在Th1细胞中，gapmer介导的抑制作用 Malat1 resulted in a significant decrease in 干扰素 expression with no effects on 白介素10 (图3H）。 Notably, we found that the SUPpression of 白介素10 expression occurred in Malat1^-/- CD4⁺ T细胞不论分裂了多少次（图3I, 3J），表明 Malat1 on 白介素10 is decoupled from Th cell proliferation. Overall, these results demonstrated that Malat1 deficiency results in altered effector Th cell differentiation 和 cytokine expression in vitro, with a common effect among Th1, Th2, 和 Th17 cells being SUPpression of 白介素10.

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图3。

的损失 Malat1 in in vitro–differentiated Th1 和 Th2 cells results in SUPpression of 白介素10 expression. (A) Representative FACS plots of 白介素10 和 干扰素或IL-10和IL-4的体外表达–differentiated Th1 和 Th2 cells (day 6), respectively. (B) Percentage of 白介素10⁺ 实时TCRβ⁺ CD4⁺ WT （蓝色）或 Malat1^-/- （红色）Th1或Th2细胞。通过细胞内细胞因子染色确定的水平。 Th0单元中的水平仅供参考（n 对于Th1和Th2 = 6，并且 n 对于Th0 = 3）。 （C）IFN-γ的百分比⁺ 或IL-4⁺ 实时TCRβ⁺ CD4⁺ WT （蓝色）或 Malat1^-/- （红色）Th1或Th2细胞。通过细胞内细胞因子染色确定的水平。 Th0单元中的水平仅供参考（n 对于Th1和Th2 = 6，并且 n 对于Th0 = 3）。 （D) 白介素10 体外分化的mRNA水平 WT （蓝色）或 Malat1^-/- 定量PCR测定（红色）Th1和Th2细胞（第6天）。标准化为U6的水平和 WT 细胞。 （E) 白介素10, 干扰素和 Malat1 转染对照（蓝色）或体外转染的体外分化Th1细胞（第6天）的RNA水平 Malat1靶向（棕色）gapmer（100 nM）。标准化至U6的水平和用对照空聚物转染的细胞的平均水平。 （F) 白介素10, IL-4和 Malat1 转染对照（蓝色）或体外转染的体外分化Th2细胞（第6天）的RNA水平 Malat1靶向（棕色）gapmer（100 nM）。标准化至U6的水平和用对照空聚物转染的细胞的平均水平。 （G) Percentage of 白介素10⁺ 实时TCRβ⁺ CD4⁺ Th1或Th2细胞已转染对照（蓝色）或 Malat1靶向（棕色）gapmer（100 nM）。在第6天通过细胞内细胞因子染色确定的水平。H）IFN-γ的百分比⁺ 实时TCRβ⁺ CD4⁺ 用对照转染的Th1细胞（蓝色）或 Malat1靶向（棕色）gapmer（100 nM）（n = 4）。 （I) Percentage of 白介素10⁺ CD4⁺ WT （蓝色）或 Malat1^-/- （红色）Th1细胞（第6天），通过细胞内细胞因子和CFSE染色（n = 4）。 （J) Percentage of 白介素10⁺ CD4⁺ WT （蓝色）或 Malat1^-/- 通过细胞内细胞因子和CFSE染色确定的（红色）每细胞分裂Th2细胞（第6天）（n = 4).

的损失 Malat1 削弱Th细胞中Maf的表达

探索采用的机制 Malat1 to regulate 白介素10, we determined the effect of Malat1 与Th细胞活化和分化有关的转录因子。对我们的单细胞RNA-seq数据进行的分析揭示了25个转录因子，这些转录因子与 Malat1 在Th1细胞中的表达 个人电脑被AS感染的小鼠（图4A）。值得注意的是，仅有的三个转录因子之一与 Malat1 原为 黑手党 （也称为 c-马夫; 图4B），一种在CD4中具有基本作用的蛋白质⁺ T cell biology 和, notably, an essential transcriptional regulator of 白介素10 expression in Th cells (23–28）。我们还观察到 Malat1 和 黑手党 在单个Th2细胞中，这在统计学上不显着（p = 0.0504; 图4C）。尽管两者之间缺乏正相关 Malat1 和 白介素10 in our single-cell analyses, possibly because of the low number of 白介素10–expressing cells in the analyzed datasets (补充图3C）， 黑手党 原为 one of only five genes positively correlating with expression of 白介素10 和 Malat1 单身 疟原虫特定的CD4⁺ T 铅钛矿细胞（补充图3D）。在vestigating a list of previously published transcription factors correlating with 白介素10 expression in CD4⁺ T细胞（23）与与 Malat1 在单张CD4中⁺ 还鉴定出T 铅钛矿细胞 黑手党 作为两组中存在的唯一基因。

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图4。

Malat1 调节Th细胞中的Maf。 （A显着相关的转录因子和共激活因子的相关系数的热图（p < 0.05) 和 Malat1 分离的单个PbTII细胞表达 个人电脑感染后第7天的AS感染小鼠。 （B）的标准化笔录数 Malat1 与 黑手党 在分离的单个PbTII细胞中 个人电脑感染后第7天的AS感染小鼠。 （C）的标准化笔录数 Malat1 与 黑手党 在单个体外分化的Th2细胞中。 （D) 黑手党 体外分化的mRNA水平 WT （蓝色）或 Malat1^-/- 定量PCR测定（红色）Th1和Th2细胞（第6天）。 （E) Stat4 体外分化的mRNA水平 WT （蓝色）或 Malat1^-/- （红色）Th1细胞（第6天）。在（D）和（E）中，水平是通过qRTPCR（n = 7）并归一化为U6和 WT 细胞。 （F）中的Maf和Stat4蛋白水平 WT （蓝色）或 Malat1^-/- （红色）激活后第4天或第6天的Th1细胞通过Western印迹测定。 （G) 黑手党 体外Th1分化过程中的mRNA水平，已标准化为天然CD4⁺ T细胞。归一化至U6的水平和纯净CD4中的平均水平⁺ T细胞。 （H) 黑手党 转染对照（蓝色）或白色的Th1或Th2细胞中的mRNA水平 Malat1靶向（棕色）gapmer（100 nM）。标准化至U6的水平和用对照空聚物转染的细胞的平均水平。

接下来，我们测试了缺乏 Malat1 在Th细胞分化中起关键作用的转录因子的水平。 Malat1 并没有影响 特贝特 在Th1细胞中或 Gata3 在Th2细胞中补充图3E，3F）。然而， 黑手党 在Th1和Th2细胞中均降低了水平，在Th2细胞中达到了统计学意义（图4D），表示更高级别的 黑手党 比Th1细胞在体外（补充图3G）。在 Malat1^-/- Th1细胞，我们还观察到了明显的下调 Stat4 (图4E），而在 Stat6 在Th2细胞中补充图3H）。值得注意的是 Stat4 is also known to promote 白介素10 transcription in Th1 cells (29），并且在 Malat1^-/- Th1 cells. At the protein level, we observed only a modest SUPpression of Stat4 expression in Malat1^-/- 第6天的Th1细胞（图4F）， whereas SUPpression of 黑手党 原为 more pronounced than that observed at the mRNA level (图4D）。值得注意的是， 黑手党 Th1细胞中的mRNA水平显示出先降低后升高（图4G），表明 Malat1 可能在Th1分化的早期和晚期都在Maf调控中发挥作用。击倒 Malat1 with gapmers SUPpressed 黑手党 在Th1和Th2细胞中的水平，表明该作用是由 Malat1 核糖核酸（图4H）。此外， levels of Bhlhe40, a transcription factor involved 白介素10 regulation (30）并与 Malat1 (图4A），在 Malat1^-/- Th1或Th2细胞（补充图3I）。综上所述，以上证明了 Malat1 loss SUPpresses expression of 黑手党, a central transcriptional regulator of 白介素10 in Th cells.

Malat1^-/- 感染了 多诺尼 demonstrate reduced 白介素10 expression in CD4⁺ T细胞和较低的寄生虫负担

接下来，探讨功能的作用 Malat1/ 黑手党 / IL-10体内途径，我们研究了 Malat1 in infection models in which 白介素10 deficiency either promotes pathogen 清除或 恩hances immunopathology. First, we used 多诺尼 小鼠感染作为病原体引起的慢性炎症的模型（31）。 We chose to study a model of visceral leishmaniasis because Th1 cell–derived 白介素10 has been previously shown to be a critical for protection 和 pathogen clearance but also a critical determinant of disease outcomes in humans (16, 32–36）。 Malat1 表达减少了CD4⁺ 与未感染的CD4相比，从感染小鼠脾脏中分离的T细胞⁺ T细胞（图5A）。 Critically, we found that at the chronic infection stages (day 42 p.i.), 白介素10 expression 原为 reduced in splenic CD4⁺ 来自感染的T细胞 Malat1^-/- 干扰素表达无任何变化的小鼠（图5B–D），反映了我们在体外激活的CD4中的发现⁺ T细胞（Fig. 4）。脾脏CD4的数量没有统计学上的显着变化⁺ T细胞或幼稚的频率（CD62L⁺/CD44⁻）和效应细胞（CD62L⁻/CD44⁺) CD4⁺ T细胞之间 WT 和 Malat1^-/- 老鼠 （补充图4A，4B）。 The reduction in 白介素10⁺ Th1细胞伴随脾髓样细胞特别是CD11b诱导型NO合酶表达增加⁺/CCR2⁺/Ly-6C^你好 炎性单核细胞 Malat1^-/- 老鼠 （图5E）。 No changes in MHCII or 白介素10 were found in any of the myeloid populations (补充图4C，4D）。 Critically, the observed reduction in 白介素10 levels 原为 accompanied by significantly reduced parasite loads in Malat1^-/- 老鼠 （图5F, 5G）对脾脏或肝脏大小无明显影响（补充图4E）。这些结果表明 Malat1 regulates 白介素10 in Th cells in vivo 和 that Malat1 缺乏会导致慢性病时的保护作用增强 多诺尼 慢性感染。

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图5。

的损失 Malat1 results in SUPpression of 白介素10 expression in Th1 cells in vivo 和 恩hanced immunity to 多诺尼。 （A) Malat1 定量PCR测定幼稚（N）CD4中的水平⁺ T细胞和CD4⁺ 从脾脏分离的T细胞 多诺尼–感染小鼠（第28天）。归一化至U6的水平和N CD4的平均水平⁺ T细胞。 （B) Representative FACS plots of 白介素10 和 干扰素 expression in splenic CD4⁺ 来自的T细胞 多诺尼-已感染 WT 和 Malat1^-/- 用PMA /离子霉素再刺激后（p.i.第42天）。 （C) Percentage of 白介素10⁺ 实时TCRβ⁺ CD4⁺ 来自的细胞 多诺尼-已感染 WT （蓝色）或 Malat1^-/- （红色）小鼠（第42天，下午），通过细胞内细胞因子染色确定。还显示了来自未感染的N小鼠的水平以供参考。水平直接在分离后的细胞中显示（单独的布雷菲德菌素A [bref]），或在用PMA和离子霉素重新刺激后（PMA / iono）显示。 （D）IFN-γ的百分比⁺ 实时TCRβ⁺ CD4⁺ 来自的细胞 多诺尼 已感染 WT （蓝色）或 Malat1^-/- （红色）小鼠（第42天，下午），通过细胞内细胞因子染色确定。还显示了来自未感染的N小鼠的水平以供参考。水平直接显示在分离后的细胞中（单独使用bref）或在用PMA / iono重新刺激后的细胞中。 （E诱导型NO合酶阳性（iNOS）的百分比 ⁺）来自未感染（N）脾脏的骨髓活细胞或 多诺尼-已感染 WT （蓝色）或 Malat1^-/- （红色）小鼠（每天42天； n = 5）。 （F）每1000个核中的脾脏和肝脏寄生虫计数 多诺尼-已感染 WT （蓝色）或 Malat1^-/- （红色）小鼠（第42天，下午）。 （G）脾脏和肝脏Leishman–Donovan单位 多诺尼-已感染 WT （蓝色）或 Malat1^-/- （红色）小鼠（第42天，下午）。对于（C），（D），（F）和（G）， n = 11，对于（E）， n = 5.

个人电脑被AS感染 Malat1^-/- mice demonstrate reduced Th1 白介素10 expression 和 more severe disease

进一步测试功能相关性 Malat1-mediated 白介素10 regulation in vivo, we 已感染 Malat1^-/- 和 WT 老鼠与 个人电脑如. 白介素10 plays a prominent role in the outcome of malaria disease in humans (37, 38），并在 个人电脑如 experimental model of malaria, 白介素10 deficiency promotes severe disease manifested as more pronounced weight loss 和 mortality (39）。就像 多诺尼 感染，CD4⁺ 脾脏的T细胞 个人电脑被AS感染 Malat1^-/- mice demonstrated lower 白介素10 expression (图6A, 6B）。减少IFN-γ的临界趋势不显着⁺ CD4⁺ 还观察到T细胞（图6C）。至关重要的是，在 Malat1^-/- 小鼠与 WT 在的第一周内进行控制 个人电脑如感染（图6D）。值得注意的是，由于体重减轻的速度增加，实验不得不终止 Malat1^-/- 小鼠（预计到第9天将超过初始体重的20％），并且缺乏触觉逃逸和耳廓反射 Malat1^-/- 在第8天（两者的中位数均为0，满分为2）。我们没有观察到对寄生虫病的任何影响（图6E）。脾肿大之间相似 WT 和 Malat1^-/- 小鼠，但肝脏大小适度减少 个人电脑被AS感染 Malat1^-/- 观察到小鼠（图6F）。值得注意的是 Malat1 did not affect 白介素10 和 干扰素 levels in CD8⁺ 感染小鼠中的T细胞（补充图4F，4G）。以上发现进一步证明了 Malat1 in regulation of 白介素10 in Th cells in vivo 和 SUPported that the extent of Malat1 下调及其表达动力学 疟原虫 感染可能是传染病结局的重要决定因素。

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图6。

的损失 Malat1 results in SUPpression of 白介素10 expression in Th1 cells 和 more severe disease in 个人电脑被AS感染的小鼠。 （A) Percentage of 白介素10⁺ 实时TCRβ⁺ CD4⁺ 来自的细胞 个人电脑被AS感染 WT （蓝色）或 Malat1^-/- （红色）小鼠（p.i.第8天），通过细胞内细胞因子染色确定。还显示了未感染的幼稚（N）小鼠的水平以供参考。水平直接在分离后的细胞中显示（单独的布雷菲德菌素A [bref]），或在用PMA和离子霉素重新刺激后（PMA / iono）显示。 （B）如（A）所述，但针对IFN-γ的百分比⁺/IL-10⁺ 实时TCRβ⁺ CD4⁺ 来自的细胞 个人电脑被AS感染 WT （蓝色）或 Malat1^-/- （红色）小鼠（第8天p.i.）。 （C）如（A）所述，但针对IFN-γ的百分比⁻/IL-10⁺ 实时TCRβ⁺ CD4⁺ 来自的细胞 个人电脑被AS感染 WT （蓝色）或 Malat1^-/- （红色）小鼠（第8天p.i.）。 （D）体重 个人电脑被AS感染 WT （B6，蓝色）或 Malat1^-/- （红色）小鼠在指定日期p.i.重量表示为每只小鼠的起始重量的百分比。黑色线显示了未感染小鼠的体重。 *p < 0.05, **p <0.01，感染之间 WT 和 Malat1^-/- 老鼠。 （E）中的寄生虫血症（受感染细胞的百分比） 个人电脑被AS感染 WT （B6，蓝色）或 Malat1^-/- （红色）小鼠在指定日期p.i. （F）脾脏和肝脏的重量占体重的百分比 个人电脑被AS感染 WT （B6，蓝色）或 Malat1^-/-下午8点（红色）的老鼠。为一个）–(F), n = 4–6.