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Syndecan-1通过控制产生IL-17的γδT细胞的稳态来调节牛皮癣样皮炎。

阿尼尔·库玛·贾斯瓦尔(Anil Kumar Jaiswal), 莫汉拉杰·萨达斯瓦姆(Mohanraj Sadasivam), 内森·阿切(Nathan K. Archer), 罗伯特·米勒, 卡莉·A·迪伦, Advaitaa Ravipati, 平和公园, 舒克蒂·查克拉瓦蒂(Shukti Chakravarti), 劳埃德·米勒 和 阿卜杜勒·拉希姆·哈马德
免疫学杂志 2018年9月15日, 201 (6) 1651-1661; DOI: //doi.org/10.4049/jimmunol.1800104
阿尼尔·库玛·贾斯瓦尔(Anil Kumar Jaiswal)
*约翰霍普金斯大学医学院病理学系,马里兰州巴尔的摩;医学博士21205;
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莫汉拉杰·萨达斯瓦姆(Mohanraj Sadasivam)
*约翰霍普金斯大学医学院病理学系,马里兰州巴尔的摩;医学博士21205;
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内森·阿切(Nathan K. Archer)
†约翰·霍普金斯大学医学院皮肤科,马里兰州巴尔的摩21205;
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罗伯特·米勒
†约翰·霍普金斯大学医学院皮肤科,马里兰州巴尔的摩21205;
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卡莉·A·迪伦
†约翰·霍普金斯大学医学院皮肤科,马里兰州巴尔的摩21205;
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Advaitaa Ravipati
†约翰·霍普金斯大学医学院皮肤科,马里兰州巴尔的摩21205;
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平和公园
‡哈佛医学院,波士顿儿童医院,医学系,MA 02115;和
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舒克蒂·查克拉瓦蒂(Shukti Chakravarti)
§约翰霍普金斯大学医学院医学系,巴尔的摩,医学博士21205
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劳埃德·米勒
†约翰·霍普金斯大学医学院皮肤科,马里兰州巴尔的摩21205;
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阿卜杜勒·拉希姆·哈马德
*约翰霍普金斯大学医学院病理学系,马里兰州巴尔的摩;医学博士21205;
§约翰霍普金斯大学医学院医学系,巴尔的摩,医学博士21205
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载入中

抽象的

IL-17是有效的促炎细胞因子,可驱动多种自身免疫性疾病(包括牛皮癣)的发病机理。致病性IL-17的主要来源是γδT细胞(Tγδ17)的子集,该子集在胸腺中发育时具有产生IL-17的能力。然而,尚未完全了解调节Tγδ17细胞稳态的机制及其在牛皮癣中的作用。在本文中,我们表明硫酸乙酰肝素蛋白聚糖syndecan-1(sdc1)在调节Tγδ17细胞的体内稳态和调节小鼠牛皮癣样皮肤炎症中起关键作用。 sdc1主要由Tγδ17细胞表达(但IL-17不表达)−Tγδ细胞)在胸腺,淋巴结和真皮中。 sdc1缺乏症通过增加增殖和减少凋亡的机制显着并选择性地增加了Tγδ17细胞的频率和绝对数量。过继转移实验排除了在非造血细胞上表达的sdc1在阻止sdc1缺陷型Tγδ17细胞的扩增和增殖中的重要作用。当遭受咪喹莫特诱导的牛皮癣样皮炎时,sdc1KO小鼠中的Tγδ17细胞显示出比野生型对应物更高的反应性,并伴有明显的皮肤炎症。此外,与TCR–βδ KO宿主中sdc1充足的对应物相比,转移的sdc1不足的γδT细胞引起的银屑病性皮炎更为严重。结果揭示了sdc1在控制Tγδ17细胞体内稳态和调节宿主对牛皮癣样炎症的反应中的新作用。

介绍

白细胞介素17是有效的促炎细胞因子,是宿主防御细菌和真菌感染所必需的(1, 2)。 IL-17反应失调驱动多种自身免疫性疾病的发病机理,包括牛皮癣(3)。在宿主防御和自身免疫反应中调节IL-17反应的机制尚未完全了解。这些机制对于调节先天性T细胞特别重要,后者会通过激动剂选择途径在胸腺中发育时获得其效应子功能,并且易于自我反应(4)。离开胸腺后,产生IL-17的γδT细胞(Tγδ17)子集不仅位于淋巴组织中,而且位于上皮屏障中。在真皮中,Tγδ17细胞参与免疫监视和宿主对入侵病原体的防御(5)。 Tγδ17细胞的异常功能有助于自身免疫。实际上,Tγδ17细胞被认为是牛皮癣发病机制中IL-17的主要来源。这些观察结果的成功体现在针对IL-17A和IL-17受体A亚基(IL-17Ra)的单克隆抗体在临床上用于治疗中度至重度牛皮癣的批准(6)。另外,已开发出牛皮癣样皮炎的小鼠模型以了解潜在的疾病机制。这些包括咪喹莫特(IMQ)诱导的牛皮癣形式(7),其中Tγδ17细胞是疾病病理状况的重要介体。因此,确定控制Tγδ17细胞稳态的因素在临床上是相关的,并且对于开发预防IL-17异常产生并减轻其病理后果的新策略可能有用。

Syndecan-1(sdc1,CD138)是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG),主要由上皮细胞和其他非造血细胞表达,并调节其许多特性,包括增殖和凋亡(8, 9)。除了被公认是浆细胞和发育中的B细胞的标志物外,关于sdc1在免疫细胞功能中的作用还知之甚少(9, 10)。最近,我们小组以及随后的其他小组已经将sdc1确定为可产生IL-17的NKT细胞(NKT17)的特定标记(11–15)。我们还发现sdc1缺陷会显着增加胸腺和外周NKT17细胞的频率(11),因此可作为NKT17细胞稳态的负调节剂(16)。

在这项研究中,我们显示sdc1调节Tγδ17细胞的稳态和小鼠银屑病性皮炎的发病机理。 sdc1在胸腺和淋巴结中的大多数Tγδ17细胞表达,并在较小程度上在真皮中的Tγδ17细胞中表达。 sdc1的缺乏通过增加增殖和减少凋亡的机制显着增加了包括真皮在内的不同器官中Tγδ17细胞的总体频率和绝对数量。过继转移实验表明,在非造血细胞上表达的sdc1在调节Tγδ17细胞的稳态中没有主要作用。此外,对Tγδ17细胞的sdc1控制在病理上是相关的,因为sdc1缺乏严重加剧了IMQ诱导的牛皮癣样皮炎,即使表达仅限于T细胞区室。因此,靶向增加表达或激活sdc1可以代表控制γδT细胞产生IL-17的新策略。

材料和方法

老鼠

哈佛大学的P.Park博士和M.A.Stepp博士提供了C57BL / 6J背景的sdc1基因敲除(sdc1KO)小鼠(17)。 C57BL / 6J,B6 CD45.1,BALB / c和C3H / HeJ小鼠购自The Jackson Lab。将所有小鼠在约翰霍普金斯大学的动物设施中在无特定病原体的条件下饲养。除非另有说明,否则所有实验均使用8至10周龄的小鼠。所有实验均使用约翰霍普金斯大学动物护理和使用委员会批准的实验方案进行。

腹肌

所有与荧光染料偶联的单克隆抗体均来自BD Biosciences, 生物传奇或eBioscience。其中包括APC-Cy7-抗CD45(30-F11),BV421-抗αβTCR(H57-597),FITC-抗γδTCR(UC7-13D5),APC-抗CD138(sdc1、281-2), PerCP-Cy 5.5-抗IL-17A(TC11-18H10),PerCP-Cy 5.5-抗类视色素孤儿受体γt(RORγt)(Q31-378),PE / Cy7-抗CD27(LG.3A10), BV421-抗CCR6(140706),APC-抗TCRγ4(UC3-10A6),BV421-抗CD45.1(A20),FITC-抗Vγ3TCR(536)和APC-Cy7-抗CD45。使用了2(104)个mAb。

耳朵皮肤和淋巴器官中的单细胞制备和γδT细胞的绝对数量计数

如描述的那样从耳裂的真皮片分离单细胞悬液(18)。在未操纵的小鼠中,将每只小鼠的两只耳朵的真皮片合并在一起,而在IMQ实验中,将来自该组的两只小鼠中的每只的经处理的耳朵合并在一起。样品用DMEM中的Dispase(1 U / ml; STEMCELL Technologies,Canada)和Liberase TM Research Grade(85μg/ ml; Roche Diagnostics)消化处理,然后按照所述进行单细胞制备(18)。如先前所述制备每只小鼠的胸腺和引流淋巴结的单细胞悬液( 19)。使用活细胞总数和样品中γδT细胞的百分比确定每种制剂中γδT细胞的绝对数量(20)。单细胞悬液中的活细胞数通过使用血细胞计数器和台盼蓝排除法(21),而γδT细胞的频率是通过FACS(补充图1)。 γδT细胞的绝对细胞数是通过将其频率乘以样品中的细胞总数来确定的。将结果标准化以显示每只小鼠的平均γδT细胞数。

流式细胞仪

使用标准方法进行流式细胞仪分析。使用LSR II(配备405-,488-,561-和640-nm激光线的BD Biosciences)进行样品采集。使用FlowJo v10软件(Treestar)分析获取的数据。皮肤细胞分析仅限于门控TCR中如门控策略所示,γδT细胞(补充图1A)。为了专注于真皮γδT细胞并排除表皮污染,我们排除了TCR高的 Vγ3+ 表皮γδT细胞(22),通过我们对TCR的特定门控分析中γ3− 如门控策略中所示的T细胞(补充图1B)。

IL-17和RORγt的细胞内分析

对于细胞内细胞因子染色,在5%CO2培养箱中于37°C用PMA(10 ng / ml)和碘霉素(500 ng / ml; Sigma-Aldrich)和GolgiPlug(BD Biosciences)刺激单细胞悬液4 h含10%FCS的RPMI 1640培养基中。根据制造商的说明(BD Biosciences)对淋巴细胞进行表面染色,然后进行细胞内染色。简要地说,将表面染色的细胞洗涤,用Cytofix / Cytoperm缓冲液透化,并使用PerCP-Cy 5.5结合的抗IL-17A(TC11-18H10克隆)和PerCP-Cy 5.5结合的抗RORγt进行细胞内染色( Q31-378克隆)单克隆抗体。使用FACSDiva软件(BD Biosciences)使用LSR II采集数据,并使用FlowJo软件进行分析。如所述通过细胞内染色检测RORγt(11)。

免疫荧光显微镜

在Trilogy缓冲液(Cell Marque)中进行热介导的Ag回收后,在去石蜡化的组织切片上进行了小鼠CD3的免疫荧光显微镜检查。将切片在含有10%山羊血清的PBS中于室温下封闭1小时(封闭缓冲液),然后与在封闭缓冲液中稀释的10μg/ ml小鼠抗CD3 Ab(ab5690; Abcam)在4°C孵育过夜。第二天,将切片与在封闭缓冲液中稀释的2μg/ ml Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG(Invitrogen)在室温下孵育1小时,然后用DAPI(Vector Labs)固定在VECTASHIELD中。荧光图像是在400倍放大倍数下拍摄的(DFC365FX; Leica)。

实时定量PCR

使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)分离来自野生型(WT)和sdc1KO的胸腺,淋巴结或真皮的总RNA,然后使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo Fisher,Waltham,MA)进行逆转录。基因特异性Taqman引物和探针组(Applied Biosystems)用于评估CFX96实时PCR(Bio-Rad,Hercules,CA)中TCRγ链的转录状态。用于TCRγ链的特异性引物如下:正向-5'-CCATCCACTGCAGAAGTCCC-3',反向5'-GGTTGTCTAGAGTGGGGGTC-3'。用GAPDH对基因表达进行标准化,并使用ΔΔCT法计算相对表达倍数。

凋亡测定

根据制造商的说明(BD Pharmingen),使用FITC-Annexin V细胞凋亡试剂盒通过流式细胞术评估细胞凋亡。约2×106 在PBS中洗涤细胞/ ml,表面染色,重悬于结合缓冲液中,并与FITC-缀合的膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)在室温下于黑暗中孵育15分钟,洗涤,并重悬于结合缓冲液中。通过LSR II采集样品,并使用FlowJo v10软件进行分析,并对门控的γδT细胞的膜联蛋白V和PI结合进行分析。

增殖测定

通过使用PerCP–eFluor 710–抗Ki67(克隆,SclA1S)分析Ki67分子的细胞内表达来检查增殖。分离来自不同器官的淋巴细胞并进行表面染色,然后用Foxp3染色缓冲液(目录号00-5523-00; eBioscience)对Ki67进行细胞内染色。如上所述获取和分析数据。

非造血细胞上表达的sdc1对Tγδ17细胞稳态的作用分析

我们使用过继转移来确定在非造血细胞上表达的sdc1是否调节Tγδ17细胞的稳态。简而言之,我们从WT或sdc1KO供体中纯化了T细胞,并使用每个样品中γδT细胞的频率(由FACS确定)来调整剂量并注入1.5×105 γδT细胞进入亚致死剂量(6 Gy或600 rad)的CD45.1+ 同类sdc1足够的收件人。在第6天,从每个接受者的淋巴结中分离淋巴细胞,并使用台盼蓝排除法对活细胞进行计数。样品被染色,供体细胞(CD45.2+门控并分析IL-17或Ki67的细胞内表达和凋亡。通过将频率乘以总细胞数来确定从各个受体回收的供体γδT细胞的绝对数量。

使用IMQ诱导牛皮癣样皮炎

我们使用IMQ诱导的牛皮癣样皮炎小鼠模型检查了sdc1对牛皮癣的作用(7)。简而言之,使用异氟烷麻醉与年龄匹配的sdc1KO和WT小鼠,并将右耳两侧分别用84 mg 5%IMQ乳膏(Taro Pharmaceuticals)进行局部治疗,连续五天。左耳用赋形剂处理并用作安慰剂对照。每天使用表盘厚度计(日本Ozaki Mfg。)测量皮肤厚度。在第6天,对两组小鼠进行安乐死,并分析sdc1缺失对其反应的影响。在一组实验中,我们分析了引流淋巴结对γδT细胞的影响。制备了从每只小鼠的经IMQ或安慰剂处理的耳朵引流的淋巴结单细胞悬液,并分离了γδT细胞并分析了结果部分所述的各种参数。在第二组实验中,我们使用组织学变化作为读数。从每只小鼠中切除经IMQ或安慰剂处理的耳朵,并固定在10%甲醛中。从石蜡切片制备组织切片(5μm),用H染色&E,并盲目分析病理变化。表皮厚度使用ImageJ分析软件精确测量。

sdc1不足的TCR–βδ KO宿主中sdc1缺失的Tγδ17细胞引起IMQ诱导的牛皮癣性皮炎的能力分析

从WT或sdc1KO小鼠的淋巴结中纯化T细胞,并纯化1×107 将细胞注射到8周龄的TCR-βδKO受体中。每组的小鼠在右耳两侧分别用84 mg IMQ乳膏(5%)进行局部治疗,连续5天,而对左耳进行赋形剂处理并用作安慰剂对照。如上所述,每天使用表盘厚度计测量耳朵厚度。在第6天,对每组小鼠实施安乐死,并如上所述分别分离和分析IMQ处理或安慰剂处理的耳朵的各个引流淋巴结中的淋巴细胞。

统计分析

使用(Prism 6; GraphPad Software)将数据表示为平均值±SEM。使用两尾学生进行比较 t 测试。多组之间的比较通过单向方差分析进行,然后在适当时进行Tukey多重比较试验。统计显着性确定为 p < 0.05.

结果

sdc1的表达方式Tγδ17 cells

我们通过确定sdc1是否在γδT细胞上表达来开始这项研究。我们从C57BL / 6小鼠的胸腺,淋巴结和真皮中分离了淋巴细胞,并染色和分析了门控γδT细胞中sdc1的表达(有关门控策略,请参阅 补充图1)。胸腺,淋巴结和真皮中γδT细胞的相当一部分表达sdc1(图1A)。为了专注于真皮γδT细胞并排除表皮污染,我们排除了TCR高的 我们通过对TCR进行特异性门控分析得出的γδ细胞中如门控策略所示,γδT细胞(补充图1)。 sdc1的表达方式a subset of γδ T cells was also observed in BALB/c and C3H/HeJ mice (补充图2),表示它不仅限于单个小鼠品系。最近,我们和其他人(11–14)显示在NKT细胞中,sdc1在NKT17子集上选择性表达。因此,我们确定γδT细胞是否属于这种情况。已描述产生IL-17的Tγδ17细胞使用某些TCRVγ(Vγ4和Vγ6)链,并表达CCR6且在其表面缺乏CD27(22–25)。 Tγδ17 cells, however, are definitively defined by intracellular expression of IL-17. sdc1的表达方式γδ T cells isolated from the thymus or the dermis did not correlate with usage of Vγ4, surface expression CCR6, or lack of CD27, but the majority of sdc1+ 淋巴结中的γδT细胞使用Vγ4并表达CCR6(图1B–D)。但是,我们观察到胸腺和淋巴结中以及真皮中的IL-17和sdc1的表达之间存在显着相关性(在较小程度上)(图2A,上面板和 图2B)。大多数Tγδ17细胞(不同于IL-17− 胸腺(62±10%)和淋巴结(58±8%)中的γδ)而不是真皮(31±5%)中的sdc1(图2A, 2B)。相反,只有少数IL-17− 胸腺(占5±3%),淋巴结(占13±7%)和真皮(占4±2%)中的γδT细胞表达sdc1。作为特异性对照,我们显示在sdc1KO小鼠的样品中没有检测到明显的sdc1信号(图2A,中间面板),其染色方式与野生型类似。同样,在同型匹配的Ab染色的样品中也未检测到明显的sdc1信号(图2A,下部面板)。综上,这些结果表明,sdc1表达在Tγδ17细胞中比在IL-17中更常见− γδ T cells.

图1。
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图1。

sdc1的表达方式γδT细胞。 WT C57BL / 6小鼠的胸腺,淋巴结和真皮中的淋巴细胞被分离和染色,并进行TCRγδ+ 门控细胞并分析sdc1(A),如 材料和方法。图显示了来自三个独立实验的九只小鼠的累积数据(平均值±SEM)。 (B–D) Representative dot plots and cumulative graphs compare expression of sdc1 with that of Vγ4(B),CCR6(C)或CD27(D)通过门控γδ三个器官中的T细胞。结果(平均值±SEM)来自三个独立的实验,每个基因型有六只小鼠。

图2。
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图2。

sdc1主要由IL-17表达–producing subset of γδ T cells. (A) Dot plots show representative expression of sdc1 by gated γδ每个器官中的T细胞。顶部代表点图显示了通过门控的sdc1与IL-17的表达 γδ T cells in WT mice. Middle dot plots show no nonspecific sdc1 signals in sdc1KO stained with sdc1-specific mAb. Bottom dot plots show background staining of WT mice with isotype-matched Ab in different organs. Numbers indicate percentages in quadrants. (B)图表显示了IL-17百分比的累积数据+ or IL-17− 在每个器官中都表达sdc1。 IL-17的百分比+ cells in each organ that expressed sdc1 was determined using data in representative dot plots (right upper quadrant/upper left and upper right quadrants ×100)。 IL-17的百分比−使用相同的公式确定每个器官中表达sdc1的细胞(右下象限/左下象限和右下象限)×100)。来自两个独立实验和六只单独分析的小鼠的结果。

sdc1缺乏症选择性增加各种器官中的Tγδ17细胞

以前使用C57BL / 6菌株检查了Tγδ17细胞在驱动皮肤炎症中的作用(26);因此,我们将分析限于C57BL / 6菌株,以检查机制和评估sdc1缺乏对牛皮癣性皮炎发病机理的影响。为了研究sdc1缺乏对γδT细胞稳态的影响,我们比较了sdc1KO和年龄匹配的WT C57BL / 6小鼠中γδT细胞的频率和绝对数量。与年龄相近的WT小鼠相比,sdc1KO的胸腺,淋巴结和真皮中的γδT细胞绝对数量显着增加(图3A, 3B)。 sdc1KO小鼠中γδT细胞的增加已通过实时定量PCR(图3C)。给定Tγδ17细胞对sdc1表达的偏向,我们确定sdc1缺乏是否引起γδT细胞的普遍增加,还是选择性地影响Tγδ17子集。核激素受体RORγt是调节IL-17产生的转录因子,其表达用于鉴定Tγδ17细胞(27)。因此,首先,我们比较了RORγt的频率和总数+ or RORγt−sdc1KO和年龄匹配的WT小鼠中的γδT细胞。 RORγt的频率明显更高+ sdc1KO小鼠的检查器官(胸腺,淋巴结和真皮)中的γδT细胞与WT小鼠中的γδT细胞相比(图4A)。变化是由于RORγt的绝对数增加引起的+γδT细胞,在sdc1KO中显着高于野生型小鼠(图4B)。相反,RORγt的绝对数−γδT细胞在sdc1KO和WT小鼠的上述器官中具有可比性(图4B)。因此,sdc1缺乏症选择性增加RORγt的百分比和绝对数+ but not RORγt− γδT细胞的子集。其次,我们检查了sdc1缺乏对Tγδ17细胞的直接影响。结果证实了上述发现,因为sdc1缺乏症显着增加了Tγδ17细胞的百分比和绝对数目,而对IL-17的绝对数目没有可测量的影响− 任何检查过的器官中的γδT细胞(图4C, 4D)。因此,使用RORγt或IL-17表达作为读数,我们的结果表明sdc1缺乏症显着且特异性地增加了胸腺,淋巴结和真皮中Tγδ17细胞的频率和绝对数量,而对RORγt的影响很小或没有影响−/IL-17− γδ T cells.

图3。
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图3。

sdc1的缺乏增加γδ T cells in different organs. (A) Single-cell suspensions from indicated organs of sdc1KO and WT C57BL/6 mice were analyzed by FACS for the presence of γδT细胞。代表性的点图显示了γδ T cells in thymus, draining lymph nodes, or dermal sheets of the ear skins of sdc1KO or WT mice. (B)图显示了不同器官中γδT细胞的绝对数量(n 每个基因型= 6只小鼠)。绝对数的确定如 材料和方法。 (C)图显示了定量实时PCR测定的TCRγ链在不同器官中的相对mRNA表达, n 每个基因型= 3。结果表示为平均值±SEM。 *p < 0.05, **p < 0.01.

图4。
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图4。

删除sdc1会增加ROR的百分比和绝对数γt+ Tγδ不同器官中的17个细胞。分析从sdc1KO和WT C57BL / 6小鼠指定器官分离的淋巴细胞的ROR表达γt and IL-17 as described in 材料和方法。 (A) Representative dot plots show expression of RORγt by gated γδsdc1KO(上图)和WT(下图)小鼠的指定器官中的T细胞。数字表示ROR阳性细胞的百分比γt expression. (B)图表显示RORγt的频率和绝对数的累积数据+ γδ T cells or RORγt− sdc1KO或WT小鼠每个器官中的γδT细胞。 (C)代表点图显示了sdc1KO(上图)和WT(下图)C57BL / 6小鼠指定器官中门控γδT细胞的IL-17表达。 (D)图表显示IL-17的累积频率和绝对值+ γδ不同器官的T细胞。数据来自三个独立实验,每个基因型有12只小鼠。结果表示为平均值± SEM. Unpaired t 测试(两尾)。 ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05.

sdc1的缺乏增加proliferation of RORγt+ 淋巴结和真皮中的γδT细胞亚群

细胞增殖可能是由于增殖增加,凋亡减少或两者兼而有之。为了解决这个问题并深入了解RORγt的潜在机制+sdc1KO小鼠的γδT细胞增加,我们将它们的增殖和凋亡与WT小鼠的增殖和凋亡进行了比较。我们首先评估了Ki67的表达,并分析了sdc1缺乏对RORγt增殖的影响+通过评估与细胞周期相关的核因子的表达来对γδT细胞(28)在RORγt上+ 和 RORγt− γδT细胞亚群,以确定sdc1缺乏对增殖的影响。与野生型小鼠相比,我们没有观察到sdc1KO小鼠胸腺中γδT细胞在Ki67表达上的统计学差异(图5A)。但是,sdc1KO的淋巴结和真皮中,γδT细胞的Ki67表达频率明显高于野生型小鼠(图5A, 5B)。当我们将分析重点放在RORγt上时+ sdc1KO和WT小鼠的γδT细胞中,在胸腺中表达Ki67的百分比无明显差异(图5C, 5D)。 RORγt+ 然而,如Ki67表达所示,γδT细胞在sdc1KO的淋巴结和真皮中的增殖速率明显高于野生型小鼠(图5C, 5D)。相反,RORγt在Ki67表达上没有显着差异− sdc1KO和WT对照中的γδT细胞(图5E)。这些结果表明,sdc1缺乏会导致RORγt的增殖显着增加。+ 淋巴结和真皮中的γδT细胞的一部分,对RORγt影响很小或没有影响− subset.

图5。
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图5。

sdc1缺乏会增加ROR的增殖γt+ Tγδ淋巴结和真皮中有17个细胞,但胸腺没有。对sdc1KO或WT C57BL / 6小鼠指定器官的单细胞悬液进行染色和采集,并进行门控γδ分析T细胞的Ki67和ROR细胞内表达γt as described in the 材料和方法。 (A)代表性的点图显示了sdc1KO(上图)和WT(下图)小鼠中门控的γδT细胞表达的Ki67。 (B)图表显示Ki67的累积频率和绝对数+ sdc1KO和WT小鼠中的γδT细胞。 (C)点图代表sdc1KO(上图)和WT(下图)小鼠中门控Tγδ17细胞的Ki67表达与RORγt表达。 (D)图表显示Ki67的累积频率和绝对数+RORγt+sdc1KO或WT小鼠不同器官中的γδT细胞。 (E)显示Ki67的累积频率和绝对数+RORγt−sdc1KO或WT小鼠不同器官中的γδT细胞。来自三个独立实验和每个基因型的九只小鼠收集数据。未配对 t 测试(两尾); ns,无统计学意义。 **p < 0.01, *p < 0.05.

sdc1的缺乏减少RORγt的凋亡+ 器官中γδT细胞的亚群

接下来,我们分析了sdc1缺乏对γδT细胞凋亡的影响。因为对IL-17或RORγt染色需要固定细胞,所以我们的分析仅限于表面染色的γδT细胞。我们的分析表明,与WT对照相比,不同器官中γδT细胞的凋亡明显减少,特别是sdc1KO小鼠的淋巴结和真皮中(Fig. 6)。因此,sdc1缺乏症会显着降低γδT细胞的凋亡。此外,鉴于sdc1缺乏症特别影响Tγδ17细胞,我们可以推断推断凋亡变化主要影响Tγδ17细胞是安全的。

图6。
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图6。

sdc1缺乏症减少天然的晚期凋亡γδ不同器官的T细胞。对sdc1KO和WT C57BL / 6小鼠分离的淋巴细胞进行表面染色,并γδ T cells were gated and analyzed for late apoptosis as described in 材料和方法。 (A)代表点图显示了sdc1KO(上图)和WT(下图)小鼠中门控的γδT细胞对膜联蛋白和PI的结合。 (B)图显示了晚期凋亡的γδT细胞的累积频率和绝对数量(annexin V+,PI+)在sdc1KO和WT小鼠的不同器官中。未配对 t 测试(两尾)。 **p < 0.01, *p < 0.05.

在非造血细胞上表达的sdc1在调节T的稳态中没有主要作用γδ17 cells

上皮细胞和其他非造血细胞是表达sdc1(8, 9, 16)。因此,我们确定在非造血细胞上表达的sdc1是否在调节Tγδ17细胞的稳态中发挥作用。通过比较过继转移的CD45.2的总体扩增,增殖和凋亡来检验此概念+ γδ T cells (1.5 × 105 每个接受者)从sdc1KO或WT捐赠者转化为同基因CD45.1+ sdc1-足够的主机,如图所示(图7A),并在 材料和方法。我们的研究结果显示,与WT捐赠者的对应细胞相比,sdc1KO捐赠者的Tγδ17细胞在WT环境中显着扩增(图7B)。 sdc1KOTγδ17细胞的频率和绝对数量与野生型WT相比显着增加(图7B)。相反,IL-17的绝对数− sdc1KO和WT供体的γδT细胞保持可比性(图7B)。这证实了sdc1缺乏对Tγδ17细胞的特异性作用,并确认小鼠被重建为具有相似数目的γδT细胞。表达Ki67的供体sdc1KOTγδ17细胞的频率显着高于WTTγδ17细胞的频率,表明它们的增殖增加不受非造血细胞上表达的sdc1驱动。图7C)。还可以使用CFSE稀释测定法直接观察转移细胞的增殖情况(补充图3)。相反,我们未观察到过继转移的sdc1KO和WTγδT细胞凋亡的显着差异(图7D)。如下所述,sdc1缺乏对过继转移的γδT细胞凋亡没有显着影响,可能是由于体外操作和辐照过的淋巴细胞减少导致的高背景凋亡。综上所述,这些结果表明在非造血细胞上表达的sdc1在停止sdc1缺陷型Tγδ17细胞的增殖和扩展中没有重要作用。

图7。
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图7。

在非造血细胞上表达的sdc1在调节T的稳态中没有主要作用γδ17个单元格。含有(1.5的纯化T细胞× 105 来自CD45.2的γδT细胞)+ 静脉内注射WT或sdc1KO供体。进入亚致死剂量的CD45.1+ sdc1-足够的收件人。五天后,从受体的淋巴结(LN)中分离出单细胞悬液,对其进行染色并通过FACS和供体CD45.2进行采集+ 对γδT细胞进行门控和分析。 (A)实验策略方案。 (B) Representative dot plots show intracellular expression of IL-17 by gated WT or sdc1KO donor γδT细胞。左图和中图显示了WT或sdc1KO供体T的累积频率(左)和绝对数(中)γδ17个单元格。右图显示了WT或sdc1KO供体IL-17的绝对数量− γδ cells. (C) Representative dot plots show Ki67 expression by WT or sdc1KO γδT细胞。图形显示表达Ki67的频率和绝对数的累积数据γδ T cells of WT or sdc1KO origin. (D)代表点图显示了供体γδT细胞与膜联蛋白V的结合。图表显示了膜联蛋白V的频率和绝对值的累积数据+ γδWT或sdc1KO来源的T细胞。从四个独立实验的每组八只小鼠收集数据。结果显示为平均值± SEM. Unpaired t 测试(两尾); ns,无统计学意义。 **p < 0.01, *p < 0.05.

sdc1的缺乏促进IMQ诱导的牛皮癣样皮炎

IL-17是人类皮肤炎症的主要驱动因素,中和IL-17的mAb已在临床上用于治疗牛皮癣(22, 29)。 Tγδ17细胞也是IMQ诱导的皮肤炎症的主要驱动力(7, 29)。因此,我们假设sdc1缺乏可能在这种皮肤炎症模型中具有重要的病理学意义。为此,我们确定了sdc1缺乏症是否会增加IMQ诱导的牛皮癣样病的易感性。支持这种可能性的第一个迹象是我们的发现,即sdc1缺乏显着增强了Tγδ17细胞对IMQ处理的反应( Fig. 8)。在sdc1KO和WT小鼠中,经IMQ处理的引流淋巴结的耳朵中Tγδ17细胞的百分比和绝对数量显着高于经安慰剂处理的引流淋巴结的耳朵。安慰剂对照是正常小鼠。此外,与WT小鼠相比,sdc1KO的IMQ淋巴结中Tγδ17细胞的频率和绝对数量显着更高(图8A–C)。用于评估IMQ治疗效果的终点是耳朵厚度和表皮厚度的变化(22)。 sdc1缺陷显着增加了两个参数(图8D–F)。相比之下,sdc1KO小鼠的皮肤组织学或表皮厚度没有明显的变化,如安慰剂组中所述(图8D–F)。因此,与野生型对照相比,用IMQ处理导致Tγδ17细胞显着增加,并导致sdc1KO中皮肤炎症加剧。我们得出的结论是,sdc1表达对于控制IMQ诱导的皮肤炎症很重要。

图8。
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图8。

sdc1的缺乏会促进IMQ诱导的牛皮癣样皮炎。 sdc1KO或WT C57BL / 6小鼠连续5天接受了一只耳朵上的5%IMQ乳膏和另一只耳朵上的安慰剂的局部治疗,连续5天。 材料和方法. Skin thickness of each ear was measured daily. On day 6, γδ通过流式细胞仪分离并分析经IMQ或安慰剂处理的耳朵的引流淋巴结中的T细胞,并使用H&E sections. (A)点状图显示了WT和sdc1KO小鼠的安慰剂和IMQ引流淋巴结中γδT细胞在细胞内表达IL-17。数字表示细胞内IL-17阳性的百分比。 ( B 和 C)图表显示累积数据(平均值±SEM, n =每组9个),来自三个独立的实验。 (D)图显示了sdc1KO和WT小鼠经安慰剂或IMQ处理的耳朵厚度的累积变化。结果表示为平均值±SEM; n 每组= 9只小鼠。 (E)代表性图像显示了IMDC处理或安慰剂处理的sdc1KO和WT小鼠耳朵的组织学皮肤病变。黄色圆圈和箭头表示表皮厚度。比例尺,100μm。 (F)图显示表皮厚度(平均值±SEM, n 在IMQ或安慰剂处理过的耳朵中,使用ImageJ软件进行测量和分析,每组= 9)。使用单向方差分析(Tukey多重比较测试)比较数据。 ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05.

为了确定T细胞sdc1表达在介导IMQ诱导的牛皮癣性皮炎中的重要性,我们重建了sdc1足够的TCR–βδ KO受体,它们既缺乏αβ也没有γδT细胞(30),WT或sdc1KO T细胞。如图所示,我们对每组小鼠进行了IMQ诱导的皮肤炎症(图9A每天通过测量耳厚评估治疗效果。另外,在第6天,测定安慰剂和IMQ引流淋巴结中Tγδ17细胞的频率和绝对数量。 sdc1KO T细胞重组小鼠的淋巴结中Tγδ17细胞的百分比和绝对数量显着高于WT T细胞重组小鼠(图9B, 9C)。此外,sdc1KO T细胞受体样牛皮癣样皮肤发炎的情况更加严重,如耳朵厚度和表皮厚度的增加(图9D–F)。两组Th17细胞(不表达sdc1)的频率没有重大差异(图9G, 9H),与先前的报道一致,即小鼠γδT细胞在驱动牛皮癣样皮炎方面比Th17细胞更重要。22, 29, 31, 32)。此外,如检测到CD3所示,转移的T细胞能够到达真皮+ 受体小鼠皮肤部分的细胞(图9I)。这些结果表明,将sdc1缺乏症限制在T细胞中足以加剧IMQ诱导的皮肤炎症。

图9。
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图9。

在非造血细胞上表达的sdc1不会介导IMQ诱导的牛皮癣样皮炎。从WT或sdc1KO小鼠的淋巴结中纯化出T细胞,其中1× 107 cells were injected i.v. into syngeneic TCR–βδKO B6小鼠。 24小时后,每组小鼠连续五天接受IMQ处理,每天测量皮肤厚度。在第6天,通过FACS分析引流淋巴结中的T细胞,并使用H评估皮肤损伤&E sections. (A)实验策略方案。 (B)代表性的点状图显示了WT或sdc1KO来源的门控γδT细胞在细胞内IL-17的表达。 (C)图显示了回收的WT或sdc1KOTγδ17细胞的累积频率和绝对数量。 (D)图显示了接受WT或sdc1KO T细胞的小鼠耳厚的变化百分比(平均值±SEM)。 (E)代表性图像显示了接受sdc1KO或WT T细胞的小鼠耳朵的组织学皮肤病变。黄色箭头表示表皮厚度。 (F)图显示了使用ImageJ软件测量和分析的累积表皮厚度(平均值±SEM)。 (G)典型的点状图显示了门控αβT细胞在WT或sdc1KO T细胞受体中表达IL-17。 (H图显示两组中Th17细胞的频率和绝对数量的累积数据。数据(平均值±SEM)来自每组四只单独分析的小鼠。 ( I)用CD3 Abs对用于安慰剂对照和IMQ的耳朵(sdc1ko和WT)的脱石蜡的组织学切片进行染色(参见 材料和方法 (有关详细信息),核用DAPI染色。在所有面板中,箭头表示CD3的正信号(绿色)。原始倍率×400。未配对 t 测试(两尾)。 **p < 0.01, *p < 0.05.

讨论

这项研究表明,sdc1在调节小鼠银屑病性皮炎的体内稳态和控制其发病机理中起着关键作用。我们的结果表明,大多数RORγt+ 胸腺和淋巴结中的Tγδ17细胞以及真皮中约30%的Tγδ17细胞表达sdc1,而IL-17的百分比明显降低− 细胞表达sdc1。重要的是,不存在sdc1可以通过增加Tγδ17细胞的增殖和减少细胞凋亡来显着增加Tγδ17细胞的总体频率和绝对数量,而对IL-17的体内稳态影响最小− γδT细胞。此外,过继转移实验排除了非造血细胞上表达的sdc1在调节sdc1缺陷型Tγδ17细胞的应答或致病作用中的主要作用。 sdc1的缺失还增强了Tγδ17细胞对IMQ的增殖反应,并加剧了随后的牛皮癣性皮炎。此外,将sdc1表达限制在非造血细胞中并不能减轻sdc1缺失的Tγδ17细胞转移到sdc1充足的TCR–βδ KO受体中的致病作用。如果未来的研究证明sdc1在人类中具有类似的调节作用,则sdc1靶向可以提供新颖的策略来控制Tγδ17细胞并控制其在牛皮癣和其他自身免疫性疾病中的致病作用,其中先天性T细胞是主要参与者。

结果揭示了IL-17,sdc1和γδT细胞之间的三角关系。 IL-17是有效的细胞因子,是宿主防御细菌和真菌感染所需的细胞因子(1, 33),但其过度生产与上皮和黏膜屏障引起自身免疫疾病有关(3)。 sdc1是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖,主要表达并参与调节上皮和其他非粘附细胞的体内平衡,包括调节其增殖和凋亡(8, 9)。 Tγδ17细胞是调节网络的一部分,可通过产生IL-17保护真皮和其他上皮屏障免受病原体的侵袭。我们的结果表明,与上皮细胞相似,Tγδ17细胞使用sdc1来调节其稳态,并响应IMQ诱导的皮肤炎症而防止旺盛的IL-17生产。

sdc1的表达方式Tγδ17 cells is not a part of peripheral tissue imprinting process. Instead, sdc1 is expressed by Tγδ17 cells while developing in the thymus. In fact, the percentage of Tγδ17 cells bearing sdc1 is the lowest in the dermis than in the thymus and lymph nodes. In contrast, sdc1 was minimally expressed on IL-17− γδT细胞和sdc1缺乏对IL-17无明显影响− 在sdc1KO和年龄匹配的WT小鼠中,γδT细胞的增殖和绝对数量可比。因此,sdc1缺乏症的作用显然仅限于Tγδ17细胞,包括真皮,尽管sdc1表达最低,但似乎最受sdc1缺乏症的影响,这反映在稳态或反应中真皮Tγδ17细胞的扩增中到IMQ。鉴于真皮是活跃暴露于环境Ags的效应位点,一种解释是真皮中sdc1表达Tγδ17细胞百分比低的一种解释可能是由于其在环境中的刺激而脱落的(34)。因此,sdc1调节γδT细胞的能力也可能是组织特异性的。例如,sdc1的缺失会显着增加Tγδ17细胞(RORγt+)在淋巴结和真皮中,但对胸腺中Tγδ17细胞的增殖没有影响。因此,sdc1调节Tγδ17细胞增殖的能力仅限于外围。相反,胸腺γδT细胞的存活仍然受sdc1的调节,如sdc1KO小鼠中胸腺γδT细胞的数量增加和凋亡减少所表明的。还值得注意的是sdc1缺乏会显着减少内源性天然Tγδ17细胞的凋亡(Fig. 5),但对过继转移的γδT细胞的凋亡没有明显影响(图6D)。我们推测,这可能与以下事实有关:与内源性γδT细胞不同,过继转移的细胞显示出高背景凋亡,这是预期的,因为它们暴露于体外分离程序,然后注射至低于理想的微环境中的亚致死性淋巴细胞减少受体中。

相比之下,我们的结果排除了上皮细胞上表达的sdc1在影响Tγδ17细胞增殖中的主要作用,这可以通过在sdc1充足的受体中过继转移的sdc1KOTγδ17细胞比WT对应物更好地扩展的能力来证明。但是,由于我们的制剂中还含有αβT细胞,因此我们不能正式排除共转移的αβT细胞对所患病理状况有一定影响。但是,这种可能性不太可能,因为sdc1不由αβT细胞表达,并且它的缺失也不会改变产生IL-17的稳态产生αβTh细胞。未来的研究应检查sdc1调节Tγδ17细胞增殖和存活的机制。识别sdc1在T细胞及其结合伴侣中发出信号的机制对于理解其在控制Tγδ17细胞稳态中的作用至关重要。

总而言之,我们的结果确定了sdc1在调节Tγδ17细胞的总体稳态和减轻IMQ诱导的小鼠牛皮癣性皮炎发病机理中的新作用。该结果扩展了我们最近的发现,即sdc1也标记NKT17细胞,并且其缺失显着增加了sdc1KO小鼠的频率(11)。因此,似乎sdc1调节先天性淋巴样细胞,γδT细胞和NKT细胞的IL-17产生,对宿主防御和自身免疫疾病均具有重要意义。

披露事项

作者没有财务利益冲突。

致谢

感谢Johns Hopkins医学机构参考组织学实验室准备组织学切片并进行H&E staining.

脚注

  • 本文的在线版本包含 SUPplemental material.

  • 本文中使用的缩写:

    IMQ
    咪喹莫特
    NKT17
    产生IL-17的NKT细胞亚群
    PI
    碘化丙锭
    RORγt
    类维生素A孤儿受体γt
    sdc1
    syndecan-1
    sdc1KO
    sdc1淘汰赛; WT,野生型。

  • 已收到 2018年1月24日。
  • 公认 2018年7月6日。
  • 版权© 2018 by The 美国免疫学家协会, Inc.

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卷201, 第6期
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阿尼尔·库玛(Anil Kumar) 杰斯瓦尔, 莫汉拉吉 萨达斯瓦姆, 内森·K。 射手, 罗伯特·J。 磨坊主, 卡莉·A 迪伦, Advaitaa 拉维帕蒂, 平宇 公园, 舒克提 查克拉瓦尔蒂, 劳埃德S. 磨坊主, 阿卜杜勒·拉希姆(Abdel Rahim A.) 哈马德
免疫学杂志 2018年9月15日, 201 (6) 1651-1661; DOI: 10.4049 / jimmunol.1800104

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阿尼尔·库玛(Anil Kumar) 杰斯瓦尔, 莫汉拉吉 萨达斯瓦姆, 内森·K。 射手, 罗伯特·J。 磨坊主, 卡莉·A 迪伦, Advaitaa 拉维帕蒂, 平宇 公园, 舒克提 查克拉瓦尔蒂, 劳埃德S. 磨坊主, 阿卜杜勒·拉希姆(Abdel Rahim A.) 哈马德
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