抽象的
调节性T细胞（Treg）介导的抑制作用异常，尤其是CD4耐药+抑制性的效应T细胞（Teffs）已经与人类1型糖尿病（T1D）的发病机理有关。但是，尚不清楚这种抗药性的机制基础以及其与临床T1D发作有关的发展时间。在这项研究中，我们分析了从T1D患者和多种糖尿病相关自身抗体（AAb）阳性的糖尿病前危险受试者中分离的外周血Teffs的能力+）由Tregs抑制。因为以前通过IL-6激活STAT3可能与介导Teff耐药有关，所以我们还研究了研究对象T细胞中IL-6R的表面表达以及IL-6和TCR介导的STAT3磷酸化。在新诊断和长期存在的T1D患者中均观察到Teff对抑制的抵抗力，但在Aab中未观察到+受试者，并证明是STAT3依赖性的。 T1D或AAb患者的T细胞中未观察到IL-6R表达或IL-6介导的STAT3活化的改变+科目。然而，在患有T1D患者的T细胞中，观察到TCR刺激后STAT3的活化更快，而IL-6表达却没有增加。这些实验表明，T1D患者的Teff耐药性是STAT3依赖性的，但与Teff产生或应答IL-6的能力没有直接关系。总之，Teff对Treg介导的抑制的抗药性可能是人类T1D疾病进展的特征，并且可能通过阻断STAT3活化的免疫疗法来靶向。
介绍
1型糖尿病（T1D）是一种慢性自身免疫性疾病，会导致免疫介导的功能性胰岛β细胞丧失（1）。该疾病的发作之前是临床前阶段，在该阶段之前，在大多数个体中可检测到胰岛自身抗体（AAb）。多种Abb阳性的儿童在接下来的5年内有50％的患上T1D的风险，而随访10年则有70％的风险（2, 3）。尽管Aab具有预测能力，但CD4+ 和 CD8+ T细胞是β细胞破坏的关键介质。因此，了解T1D中T细胞功能障碍的机制对于了解该病的发病机理以及设计有效的免疫疗法至关重要。
CD4+CD25+FOXP3+ 调节性T细胞（Tregs）对于维持外周免疫耐受非常重要，其功能障碍与多种自身免疫性疾病（包括T1D）的发病机制有关。先前使用小鼠模型和人类样品进行的研究表明，自身免疫性糖尿病中Treg介导的耐受性失败主要归因于效应T细胞（Teffs）对Treg介导的抑制作用的抵抗力增加，而不是Treg的直接缺陷（4–7）。重要的是，在许多其他人类自身免疫性疾病（例如系统性红斑狼疮（8），多发性硬化症（MS）（9），青少年特发性关节炎（JIA）（10, 11）和牛皮癣（12）。
目前尚不清楚T1D中Teff耐药的确切机制以及该现象是否在临床疾病发作之前出现。在其他自身免疫性疾病中，Teff耐药性似乎与该疾病的临床活动有关（8, 9）。从机理上讲，Teff耐药性与Teffs的激活状态以及多种促炎细胞因子的暴露有关（13）。在确定的多种因素中，IL-6与Teff耐药性最强相关。 Teffs暴露于IL-6会诱导它们产生抗药性，并且IL-6R或其下游信号通路的阻断会废除Teff抗性（ 9, 10, 12, 14, 15）。
白介素6 is a multifunctional proinflammatory cytokine with a central role in inflammatory and autoimmune diseases (16）。 IL-6信号在自身免疫性疾病中的重要性已通过抗IL-6R Ab Tocilizumab成功治疗类风湿性关节炎或JIA的患者得到最清楚的证明（ 17）。 T细胞对IL-6的反应是通过信号传导途径介导的，其中IL-6与细胞表面的IL-6Rα（CD126）结合。随后，该复合物与信号转导受体gp130（CD130）结合，然后激活JAK-STAT信号转导通路，最终导致转录因子STAT3和STAT1（在较小程度上）的激活和磷酸化（16）。 IL-6Rα也作为可溶性IL-6R（sIL-6R）进行蛋白水解释放，可与血清中的IL-6结合，随后通过称为IL-6反信号转导的机制与gp130在细胞表面复合（16）。在患有活动性MS的患者中，通过STAT3磷酸化（IL-6 / pSTAT3）检测到，T细胞表面IL-6R的表达及其对IL-6刺激的反应已显示出增强，并且似乎与Teff电阻（9）。 Hundhausen等人的最新论文。 （18）报告说，尽管长期T1D患者并未解决Teff耐药性，但IL-6 / pSTAT3反应也得到了增强。
在这项研究中，我们使用两个临床队列研究了T1D发育不同阶段的Teff耐药性。我们证实，Teff耐药性是人类T1D的特征，在新诊断和长期病患者中均可观察到，但在糖尿病前Abb中则不可观察到+ 高危人群。 T1D中的Teff耐药性似乎与STAT3有关。然而，在患有T1D患者的外周血T细胞中未观察到IL-6R表达或IL-6 / pSTAT3应答的改变。而且，这些参数似乎与Teff抗性不相关。有趣的是，在离体TCR刺激后，来自患有T1D患者的T细胞中观察到加速的STAT3活化，但未观察到IL-6产生。总的来说，我们的结果表明T1D中的Teff耐药性在疾病发展过程中发展，并且是STAT3依赖性的，但与T细胞产生或应答IL-6的能力并不直接相关。因此，阻断STAT3激活的疗法可能会逆转Teff耐药性，并有助于恢复T1D的免疫耐受性。
材料和方法
人体样本
在研究中使用了冷冻的PBMC和来自儿科和成人T1D队列的匹配血浆样品。儿科队列包括40名新诊断为T1D的儿童（<诊断后1周，平均年龄8.6岁±SD 3.9，范围1-15岁），39 AAb+ 高危儿童（平均年龄8.7岁±SD 4.6，范围1-17岁）和89 AAb− 健康的儿童（平均年龄9.2岁±SD 3.9，范围1-15岁）。抗体+ 高危儿童和AAb− 健康的儿童参加了芬兰1型糖尿病的预测和预防随访研究，并发现HLA类型与T1D风险增加相关（19）。如前所述，在抽样时对儿童的AAb阳性进行了分析（2）。抗体+ 根据胰岛细胞抗体和一种或多种生物化学抗体（IAA，IA-2A和/或GADA）的阳性定义高危受试者。仅将胰岛细胞Abs和GADA阳性的受试者从分析中排除，因为与所选组相比，这些个体出现T1D的风险较低（2）。
成年队列由31名长期T1D患者（平均年龄26岁，范围18-39岁；平均疾病持续时间12岁，范围1-36岁）和35名健康对照受试者（平均年龄29岁，范围20–64 y）。
这项研究已得到参与研究的大学医院的地方伦理委员会的批准。所有参加研究的研究对象和/或其法定监护人均提供了书面知情同意书。
特雷格抑制测定
为了生成用于检测的体外扩增的Treg，需要使用天然CD4+CD45RA+CD25+CD127低 使用FACSAria III（BD Biosciences）从成年健康供体的PBMC流式细胞仪分选Treg（补充图1
CD4+CD45RA−CD25− 使用Memory CD4进行顺序磁纯化，从解冻的PBMC样品中分离出记忆Teff+ T细胞分离试剂盒和CD25微珠（Miltenyi Biotec）（补充图1）。 Teffs的平均纯度为92.3±4.5％（范围78.1–98.6％）。用CytoTell Green（AAT Bioquest）标记Teff以追踪其增殖。通过共培养1×10，在圆底96孔板中一式两份建立抑制分析4 Teff与不同数量的Treg以及抗CD2 / CD3 / CD28珠以1个珠与8个T细胞的比率结合在一起。 4天后，通过使用FACSCanto II流式细胞仪（BD Biosciences）稀释CytoTell Green来测量增殖的Teff的比例，并使用FlowJo v10.2（FlowJo）分析数据。基于与Treg共培养的增殖Teffs的百分比与单独培养的增殖Teffs的百分比相比，确定抑制百分比。对于STAT3抑制测定，如上所述，将Teff与STAT3抑制剂Stattic V（Santa Cruz Biotechnology）以200ng / ml孵育1小时，在37℃下洗涤，并用于抑制测定。
流式细胞仪
sIL-6R酶联免疫吸附
使用人IL-6R白金ELISA试剂盒（eBioscience）确定sIL-6R血浆浓度。
记忆T细胞亚群分离和功能分析
为了分析记忆T细胞亚群，CD4+CD25−CD45RA−CD45RO+
为了分析TCR刺激后的记忆T细胞反应，记忆CD4+ 从带有记忆CD4的PBMC中分离出T细胞+ T细胞分离试剂盒，并用抗CD2 / CD3 / CD28珠以1个珠与8个T细胞的比例刺激。 4和24小时后，如上所述，分析了T细胞的STAT1和STAT3磷酸化，并将细胞沉淀保存在-80°C进行基因表达分析。
实时定量PCR
为了进行基因表达分析，使用RNeasy Plus Micro Kit（Qiagen）提取了冷冻T细胞沉淀的总RNA，并使用QuantiTect逆转录试剂盒（Qiagen）合成了cDNA。使用Brilliant II SYBR Green Master Mix（Stratagene），通过Rotor-Gene RG-3000仪器（Corbett Research）检查基因表达。数据已根据管家基因（ACTB） 基因表达。使用了以下引物： IL17A，5'-GAAGGCAGGAATCACAATC-3'（正向）和5'-GCCTCCCAGATCACAGA-3'（反向）； 干扰素，5'-CCAGGACCCATATGTAAAAG-3'（正向）和5'-TGGCTCTGCATTATTTTTC-3'（反向）； IL13，5'-GCCCTGGAATCCCTGATCA-3'（正向）和5'-GCTCAGCATCCTCTGGGTCTT-3'（反向）； RORC，5'-GCATGTCCCGAGATGCTGTC-3'（正向）和5'-CTGGGAGCCCCAAGGTGTAG-3'（反向）； TBX21，5'-CCGTGACTGCCTACCAGAAT-3'（正向）和5'-ATCTCCCCCAAGGAATTGAC-3'（反向）； GATA3，5'-GAACCGGCCCCTCATTAAG-3'（正向）和5'-ATTTTTCGGTTTCTGGTCTGGAT-3'（反向）； IL2，5'-AGAACTCAAACCTCTGGAGGAAG-3'（正向）和5'-GCTGTCTCATCAGCATATTCACAC-3'（反向）； IL6，5'-GGTACATCCTCGACGGCATCT-3'（正向）和5'-AGTGCCTCTTTGCTGCTTTCAC-3'（反向）；和 ACTB，5'-GGACTTCGAGCAAGAGATGG-3'（正向）和5'-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3'（反向）。
统计分析
使用Prism软件（GraphPad）进行统计分析。对于未配对的分析，任何一个学生 t 使用Welch校正进行的检验或采用Dunnett后测的单向方差分析。对于配对样本，配对学生 t 测试被使用。使用Pearson相关系数检查连续变量之间的相关性。一种 p value <0.05表示具有统计学意义。
结果
T1D患者的T效应细胞但Aab患者不是+ 高危受试者对Treg介导的抑制有抵抗力
为了确定在T1D进展的不同阶段是否可以检测到Teff耐药性，我们从新诊断为T1D的儿童和多胰岛AAb（AAb）阳性的糖尿病前期危险儿童中获得了血样+）以及具有长期T1D的成人受试者。来自年龄匹配的健康供体的样品用作对照。为了标准化Treg抑制测定法以分析Teff耐药性，我们对所有测定法使用单一来源的Treg。为此，我们纯化了幼稚的CD4+CD45RA+CD25+CD127低 来自第三方健康供体的Treg，并使用既定方案在体外进行扩展（20, 21）（补充图1）。先前已证明，Teff电阻是存储器CD4的功能+ T cells (22, 23）。因为内存CD4的频率+ 总CD4中的T细胞+ T细胞数量差异很大，尤其是对于儿童，我们使用了磁性纯化的CD4+CD45RA−CD25− 在Treg抑制测定中将T细胞记忆为Teff，以进一步标准化我们的测定（图1A, 补充图1）。最后，我们始终以成对方式进行抑制分析，分析来自T1D患者或Aab的样品+ 受试者以及年龄匹配的健康供体的样本（图1B）。
T1D患者的Teff，但Aab患者的Teff没有+ 高危受试者对Treg介导的抑制有抵抗力。在抑制试验中，记忆CD4+CD25− 从T1D，AAb中纯化的Teff+，以及健康对照受试者与第三方体外扩增的Treg和抗CD2 / CD3 / CD28磁珠一起共培养。随后基于CytoTell Green稀释度测量Teffs的增殖。 （A）单独培养（左）或与Tregs以1：8 Treg：Teff比率（右）一起培养时，增殖Teff的比例。 （B）T1D样品和Aab抑制测定数据的代表性示例+ 样本与配对的健康对照相比。小儿队列中Treg：Teff比为1：8时的抑制百分比（C）和成人群组（D）。箭头表示AA+ 取样后6个月出现临床T1D的受试者。
我们观察到，新诊断或长期存在T1D的患者的Teff比健康对照受试者的Teff明显更耐Treg介导的抑制作用（图1C, 1D）。相比之下，AAb的Teffs+ 除两个异常值外，儿童的Teff抵抗力与健康供体的Teff相比没有增加（图1C）。值得注意的是，两个Aab之一+ 采样后6个月，没有有效抑制Teff的受试者出现了临床T1D（图1C）。我们的结果通过同一天平行分析的样品之间严格的成对比较得到了证实（ 补充图2）。在T1D患者中观察到的增加的Teff耐药性似乎与T细胞活化的差异无关，因为在没有Treg的情况下，Teff活化的增殖反应在研究组之间是相当的（补充图2）。此外，对于长期存在T1D的患者，未观察到Teff耐药水平与诊断后时间之间的相关性（补充图2）。总之，我们的数据表明在临床T1D患者中观察到外周血Teff耐药性，但似乎不是早期胰岛自身免疫的特征。
人类T1D的T效应细胞抗性取决于STAT3信号传导
先前的研究表明，Teff耐药性是由STAT3激活介导的，可以通过使用高度特异性的STAT3抑制剂Stattic V（9, 14, 24）。为了确定STAT3激活是否还导致人类T1D的Teff抗性，我们使用来自三名T1D受试者和一名Aab的其他冷冻PBMC等分试样，重复进行了Treg抑制测定+ 表现出深远的Teff抵抗力的受试者。在这些重复测定中，首先在不存在STAT3抑制剂Stattic V（ 图2A）。当健康对照组的Teff用STAT3抑制剂治疗时，抑制作用略有增加（图2B）。但是，当用抑制剂治疗T1D患者的Teff时，抑制作用会急剧增加，并且Teff抵抗力几乎完全消失（图2B）。因此，我们能够证实STAT3激活介导了T1D患者的Teff耐药性。
T1D中的Teff耐药性取决于STAT3信号传导。 （A）抑制试验的代表性示例，其中在STAT3抑制剂Stattic V不存在（左）或存在（右）的情况下，将T1D患者和配对对照对象的Teff进行了预孵育。（B在四名对照受试者（左）和三名T1D患者和一名AAb中，Treg：Teff比为1：8抑制或不抑制STAT3的百分比+ 具有Teff抵抗力的受试者（右）。
白介素6–mediated signaling is not altered in peripheral blood T cells from patients with T1D or in AAb+ at-risk subjects
白介素6 has been shown to contribute to Teff resistance in human T cells through the phosphorylation of STAT3 (9, 12, 14, 15）。在证明T1D患者的Teff耐药性很大程度上是由STAT3驱动的之后，我们接下来分析了IL-1介导的STAT3激活是否会在T1D患者的外周血T细胞中受到体外影响。为此，我们用5 ng / ml的IL-6刺激PBMC 15分钟，该剂量始终导致STAT3磷酸化水平低于最大（ 补充图1）（9, 18）。
CD4中基础pSTAT3表达无差异+ or CD8+ T1D，AAb患者之间观察到T细胞+ 小儿或成人队列中的受试者和健康对照者（补充图3）。重要的是，我们都未观察到CD4对IL-6的pSTAT3反应有任何差异+ or CD8+ 小儿或成人队列中的T细胞以pSTAT3阳性细胞的频率进行分析（ 图3A, 3B）或平均荧光强度（MFI）的倍数变化（补充图3）。天真CD4+ 和 CD8+ 与相应的记忆T细胞亚群相比，T细胞表现出始终如一的更强的IL-6 / pSTAT3反应，但是研究组之间没有发现差异（图3C–F）。在同一天对年龄匹配的样本之间进行严格的成对IL-6 / pSTAT3结果分析，进一步证实了我们的发现（补充图4）。值得注意的是，在CD4中，IL-6 / pSTAT3反应系统性较高+ T cells than in CD8+ T细胞，但在CD4中有反应+ T cells and CD8+ 来自同一个体的T细胞高度相关（图3G）。
白介素6–induced pSTAT3 responses are not enhanced in patients with T1D or AAb+ 受试者与健康对照相比。用重组IL-6刺激解冻和静息的PBMC，并通过流式细胞术确定pSTAT3（pY705）在不同T细胞群体中的表达。以pSTAT3的比例对IL-6的反应+ 总CD4中的细胞+ 和 CD8+ (A 和 B），天真CD4+ 和 CD8+ (C 和 D）和内存CD4+ 和 CD8+ (E 和 F）小儿和成人队列样本中的T细胞。 pSTAT3频率之间的强正相关+ cells in CD4+ 和 CD8+ 在儿科和成人队列的样本中均观察到T细胞亚群（G）。
与pSTAT3反应相比，pSTAT1对IL-6刺激的反应极其弱，并且在研究组之间也相似（补充图3）。此外，IL-6 / pSTAT1反应与IL-6 / pSTAT3反应密切相关（补充图3）。总之，我们没有证据显示T1D患者或Aab患者的T细胞在离体IL-6刺激下对STAT3或STAT1活化的改变+ subjects.
IL-6R在CD4上的表面表达+ T1D，AAb患者之间的血浆样品中T细胞和sIL-6R浓度无差异+ 高危受试者和健康对照
为了进一步表征人T1D中的IL-6信号通路，我们检查了CD-6上IL-6信号复合物的两个近端成分IL-6R和gp130的表面表达水平。+ T细胞，通过流式细胞仪。 T1D，AAb患者之间IL-6R或gp130表达水平均无差异+ 小儿或成人队列中的受试者和健康对照者（图4A, 4B 和 补充图4）。与记忆CD4相比，幼稚IL-6R和gp130的表达水平始终较高+ T细胞，但未观察到研究组之间的差异（图4C–F）。
T1D或Aab患者的表面IL-6R和gp130表达水平没有增加+ 受试者与健康对照相比。未刺激的PBMC用Abs染色，表面表达计算为IL-6R的几何MFI和gp130染色减去匹配的同型对照的MFI。总表面IL-6R和gp130水平（A 和 B）， 幼稚的 （C 和 D）和内存CD4+ T cells (E 和 F）在研究人群之间具有可比性。表面IL-6R表达与IL-6诱导的CD4上的pSTAT3反应之间呈强正相关+ 小儿和成年人群的样本中均观察到T细胞（G）。
与以前的报告一致（9, 18），我们观察到IL-6R表达与CD4上的IL-6 / pSTAT3反应之间存在很强的正相关+ T cells (图4G）。此外，尽管IL-4R表面表达水平以及CD4上的IL-6 / pSTAT3反应+ 个体之间的T细胞差异很大（无花果3, 4），它们似乎是个体内的稳定表型，因为在同一时间的两个不同时间点抽取的血液样本显示出显着的可重复性（图5A）。年龄与CD4上的IL-6R表面表达水平或IL-6 / pSTAT3反应之间不存在相关性的证明进一步支持了这一观点。+ T cells (图5B）。
表面IL-6R表达和IL-6 / pSTAT3反应表型随时间的稳定性。同一主题的样本是在不同的日期绘制的（3–10 mo apart) and were analyzed for surface IL-6R expression (A（左）和CD4上的IL-6 / pSTAT3反应+ T细胞（A，右）。在分析对象的年龄和表面IL-6R表达之间未发现相关性（B（左）或CD4上的IL-6 / pSTAT3反应+ T细胞（B，右）。 T1D患者和Abb患者血浆样品中的sIL-6R水平相似+ 受试者与健康对照相比（C）。血浆样品中sIL-6R的浓度与CD4上表面IL-6R的表达水平呈负相关+ 小儿和成年队列中从相同血液样本中分析的T细胞（D）。
我们还测量了T1D，AAb患者血浆中的sIL-6R浓度+ 受试者和健康对照者。研究组之间未观察到sIL-6R水平的差异（图5C）。值得注意的是，sIL-6R血浆水平与CD4上的表面IL-6R表达强烈反相关+ T cells (图5D），因此也具有IL-6 / pSTAT3响应（数据未显示）。总之，患有T1D或Aab的患者+ 受试者与健康个体在CD4上的表面IL-6R表达没有差异+ T细胞或血浆sIL-6R浓度。
特夫抗性与T细胞上IL-6R表面表达或pSTAT3信号传导水平无关
为了研究Teff耐药性是否与离体T细胞中IL-6信号强度直接相关，我们首先将IL-6 / pSTAT3反应和IL-6R表面表达与记忆CD4中观察到的Teff耐药程度进行了比较+ T细胞。在分析的23名个体受试者中，我们有足够数量的细胞对相同等分的冷冻细胞进行IL-6R和IL-6 / pSTAT3测定以及Treg抑制测定。有趣的是，在Treg抑制试验中未观察到IL-6 / pSTAT3反应或表面IL-6R表达水平与抑制水平之间的相关性（图6A, 6B）。
特夫抗性与IL-6不直接相关–诱导的pSTAT3信号转导。 IL-6之间没有相关性–induced pSTAT3 response (A）或表面IL-6R表达水平（B）在CD4上+ Treg抑制试验中的T细胞和Teff抵抗程度。内存CD4排序+ 根据趋化因子标记CCR6和CXCR3的表达，将T细胞分为Th1，Th1 / 17，Th2和Th17子集（C，左），例如通过定量PCR在分选的子集中表达子集特异性细胞因子和转录因子（C，右；五个重复样本的平均值±SEM）。 （D）排序的存储器CD4的容量没有差异+ T cell subsets to be suppressed by third-party in vitro–抑制试验中扩增的Treg（平均值± SEM of four different samples). (E）IL-6 / pSTAT3反应在CXCR3阴性中的系统性高于CXCR3阳性记忆CD4+ T细胞（四个不同样品的平均值±SEM）。 （F）与Th1和Th1 / 17子集相比，Th2和Th17子集的表面IL-6R表达更高（六个样本的平均值±SEM）。 ***p <0.001与Th1和Th1 / 17子集相比。
为了进一步表征IL-6信号传导与Teff耐药性之间的潜在联系，我们利用了趋化因子受体CCR6和CXCR3在不同记忆CD4上的表达模式+ T细胞亚群。与以前的报告一致（25, 26），我们证明了CCR6+CXCR3− 馏分高度富集Th17型细胞CCR6−CXCR3+ 组分高度富集于Th1型细胞和CCR6−CXCR3− 这些子集内的标志性细胞因子（IL-17A，IFN-γ和IL-13）和转录因子（RORC，TBX21和GATA3）的表达模式说明了该部分在Th2型细胞中高度富集（图6C）。 CCR6+CXCR3+ 部分含有Th1 / 17型细胞，这是一种高度促炎的亚型，既表达RORC和TBX21，又产生IFN-γ，但不产生IL-17A（25, 26）。
我们通过流式细胞仪对这些记忆CD4进行了分类+ 来自健康供体的PBMC的T细胞亚群，并分析了第三方Treg抑制它们的能力。但是，在不同内存CD4的抑制方面没有区别+ 观察到T细胞亚群（图6D）。接下来，我们分析了这些记忆T细胞亚群中的IL-6 / pSTAT3反应。因为CCR6染色与测定中使用的固定缓冲液不兼容，所以我们分离了记忆CD4+ T cells into CXCR3+ （Th1和Th1 / 17）和CXCR3− （Th2和Th17）子集，并在CXCR3中观察到始终较高的IL-6 / pSTAT3反应− subset (图6E）。 CXCR3阴性Th2和Th17子集上较高水平的表面IL-6R表达可以轻松解释这一发现（图6F）。总的来说，我们目前的数据表明，Teff耐药性与T细胞通过IL-6R响应IL-6刺激的能力没有直接关系。
TCR介导的pSTAT3表达在T1D患者的Teff中增加，但与细胞产生IL-6的能力无关
解释STAT3介导的Teff耐药性的另一种机制是，在TCR刺激后，来自T1D患者的Teff可以更快速地激活STAT3（14）或通过内源性IL-6的加速生产导致自分泌IL-6R信号传导（15）。为了直接测试这些可能性，我们刺激了记忆CD4+ 使用与抑制试验相同的刺激条件，从具有抗CD2 / CD3 / CD28磁珠的成年T1D患者中分离出T细胞。在4和24小时后，测量STAT1和STAT3的磷酸化以及IL-6和IL-2的基因表达水平。
我们观察到TCR刺激后4小时，来自T1D患者的T细胞中的pSTAT3反应与健康受试者相比显着增强（ 图7A）。但是，在24小时后，未观察到pSTAT3反应的差异（图7A），表明TCR刺激后STAT3激活在T1D患者的T细胞中表现出更快的动力学。有趣的是，研究组之间在第4或24小时，T细胞的IL-6表达没有差异（图7B），表明T1D患者T细胞中更快的pSTAT3激活不是由自分泌IL-6信号增强引起的。值得注意的是，研究组之间未检测到IL-2表达水平的差异（图7C），表明两组的T细胞均被同等激活。我们的结果通过同一天平行分析的样品的成对比较得到了证实（补充图4）。最后，在有或没有T1D的受试者的T细胞中，我们没有观察到TCR介导的pSTAT1反应或IL-6诱导的pSTAT3反应作为pSTAT3激活的对照有任何差异（补充图4）。总之，我们目前的研究结果表明，TCR刺激后T1D患者的Teff中STAT3激活发生得更快，但这不能通过细胞增强的IL-6表达来解释。
T1D患者T细胞中TCR刺激后，增强的pSTAT3反应但不产生IL-6。净化内存CD4+ 用抗CD2 / CD3 / CD28磁珠以1个磁珠对8个T细胞的比例刺激T细胞。 pSTAT3的表达通过流式细胞仪（A），以及IL-6（B）和IL-2（C在从成年T1D患者或健康的年龄匹配的对照受试者中分离的T细胞中刺激4和24小时后，通过定量PCR确定）。
讨论
先前在人类研究中都报道了Teff对自身免疫性糖尿病中Treg介导的抑制的抵抗力（6, 7）以及鼠科动物NOD模型（4, 5）。先前的人体研究已经检查了长期存在T1D的患者的Teff耐药性（6, 7），并且我们能够与我们的成年研究组一起证实这些发现。此外，在当前的研究中，在新诊断的儿科患者中还检测到了Teff耐药性，证实了该现象与临床T1D有关，而与年龄或疾病持续时间无关。
重要的是，据我们所知，这是第一个研究糖尿病前期AAb中Teff耐药性的研究+ 高危对象。我们无法在此研究人群中检测到Teff耐药性，这表明该现象既不是遗传学确定的，也不是胰岛自身免疫早期阶段产生的表型。但是，我们偶然发现了一种AAb+ 受试者表现出Teff抵抗力并在取样后6个月出现临床T1D。尽管显然需要进行大规模的纵向研究来确认，但我们目前的数据支持Teff耐药性是与临床T1D进展相关的标志物的观点，在NOD小鼠模型中也观察到了这一发现（4）。
导致T1D或其他自身免疫性疾病的Teff耐药的确切机制仍是未知之数。研究表明，暴露于几种细胞因子（例如IL-6，IL-4，IL-7，IL-15，IL-21，IL-2和TNF-α）会诱导Teff耐药（13）。从机理上讲，STAT3磷酸化（14），蛋白激酶B（PKB）/ c-Akt途径（ 10, 15），增加了颗粒酶B的产量（24）似乎起到调解作用。在这项研究中，我们表明STAT3激活以与先前在MS中报道的相似方式介导T1D中的Teff抗性（9），因为在抑制试验之前，先使用STAT3抑制剂对T1D患者的Teff进行预培养，从而消除了他们对抑制的抵抗力。通过TCR以及IL-6和IL-21的强信号可以通过STAT3依赖性机制引起Teff抗性（14）。在这些因素中，IL-6是迄今为止与Teff耐药性最强的联系（9, 12, 14, 15）。在体外模型中，阻断IL-6（12）或IL-6R（15）消除了Teff耐药性，并且这种作用似乎是通过抑制STAT3磷酸化来介导的（9, 14）和颗粒酶B的生产（24）。
据报道，MS患者外周血T细胞中STAT3对离体IL-6刺激的应答升高，表面IL-6R表达升高。9），以及最近来自长期T1D患者的T细胞中（18）。但是，使用与这两项研究相似的方法，我们无法检测到患儿或成年T1D患者的外周血T细胞中IL-6信号通路的缺陷。我们的数据与Hundhausen等人的最新研究之间存在差异。 （18）可能是由于方法论方法或所分析的患者队列之间存在细微差异。但是，根据先前的调查（9, 18），我们观察到表面IL-6R表达是IL-6 / pSTAT3的主要决定因素。表面IL-6R表达的染色是直接的离体流式细胞术分析，对技术变化不敏感。此外，我们在这项研究中证明sIL-6R血浆浓度与T细胞表面IL-6R表达以及IL-6介导的STAT3反应成反比，如先前在MS患者中报道的（9）。但是，与MS患者不同，我们没有观察到T1D患者中sIL-6R的浓度降低。最后，在早期的MS研究中（9），只有患有临床活跃疾病的患者的T细胞显示出增强的IL-6反应性。因此，可能只有T1D患者的一个特定的，目前无法确定的亚组表现出增加的IL-6反应性。总体而言，显然需要进一步研究以确定IL-1信号通路在T1D患者的循环T细胞中是否功能异常。
我们还在本文中检查了T细胞通过IL-6R-STAT3途径对IL-6刺激作出反应的能力与Teff抵抗水平之间的关系。与之前的报告相比（9），在我们的研究队列中，Teff抗性的程度与表面IL-6R表达或IL-6介导的STAT3反应无关。我们还通过使用趋化因子受体CCR6和CXCR3作为标记来分离记忆CD4的表型子集，进一步分析了这一现象+ T细胞。我们观察到，与CXCR3阴性的Th2和Th17子集相比，CXCR3阳性的Th1和Th1 / 17子集的表面IL-6R表达水平和IL-6介导的STAT3响应明显更低。然而，在抑制试验中，所有子集都被Tregs抑制得同样好，进一步支持了IL-6R表达水平与Teff耐药性不直接相关的结论。
由于离体的IL-6信号增强似乎无法解释T1D患者的STAT3介导的Teff耐药性，另一种解释是TCR的TCR刺激直接导致更强的STAT3活化（14）或通过加速IL-6产生和自分泌IL-6R信号传导（15）。有趣的是，在TCR刺激后的早期（4 h）而非晚期（24 h），在患有T1D的患者的记忆T细胞中观察到pSTAT3反应增加。从机理上讲，这种现象不能用IL-6产生的动力学加快或T细胞活化增加来解释，因为在任一时间点T1D患者中IL-6和IL-2的表达水平均没有升高。因此，我们的结果支持一种模型，其中来自T1D患者的外周血Teff具有离体TCR刺激后能更快地激活STAT3的细胞内在能力。反过来，这种较早的STAT3激活又可能导致Teff抗性，因为先前已经证明Teff仅在激活后的前6小时内受到Treg抑制作用（27）。 TCR激活后，来自T1D患者的Teffs具有激活STAT3的细胞内在能力的原因尚不清楚，但可能是由于他们体内暴露于炎症性细胞因子环境所致。 T1D患者血清IL-6水平是否升高尚无定论（28–31）。但是，在类风湿性关节炎和牛皮癣中，在自身免疫性炎症，滑液和牛皮癣斑块的靶组织中观察到IL-6的高表达（12, 32）。因此，T1D中的Teff也可能在发炎的胰岛或淋巴结中也局部暴露于IL-6。反过来，这可能导致获得对Teffs的耐药表型，当它们在血液中循环时会保留下来。 Teffs也可以类似的方式局部暴露于TCR介导的信号或IL-21，这是另外两个导致STAT3介导的Teff耐药的因素（14）。其中，IL-21是由Th17和滤泡性Th细胞产生的，据报道两者在T1D患者中均增加（33–37）。
我们研究的一个明显警告是，我们研究了外周血T细胞，而不是从胰岛或淋巴结分离的T细胞。因此，我们的结果可能低估了组织中Teff抗药性的严重性，这种现象甚至在临床疾病发作之前就可能更加突出并且有可能被发现。符合这种观点，在JIA患者中，从滑液分离的T细胞的Teff抵抗力比从外周血分离的T细胞更强（10, 11）。此外，请务必注意，我们和其他人（6, 7）分析了多克隆外周血T细胞而不是自身抗原特异性T细胞的Teff耐药性，后者可能具有不同的表型。我们目前的数据还强调了自身免疫性疾病患者的异质性。根据先前的研究（6, 7），我们观察到只有一部分T1D患者在TCR激活后表现出较强的Teff抵抗力和pSTAT3反应加快，而其他患者的反应类似于健康的供体。在系统性红斑狼疮和MS中，已证明Teff抗性表型与自身免疫炎症的活性有关（8, 9），这在人类T1D中自然更难评估。同样，IL-6R的表达和对IL-6介导的STAT3活化的反应性在个体之间差异很大，但似乎是个体内的稳定特征，如我们和其他人的纵向分析所证明的（18）。总体而言，T1D患者免疫表型的异质性是设计临床试验和解释其数据时需要考虑的重要因素（38）。
总之，我们能够在这项研究中证实，新诊断和长期存在的T1D患者外周血Teff对Treg介导的抑制均具有抗性。此外，我们对AAb的分析+ 高危受试者强烈暗示，这种现象很可能是在自身免疫性疾病过程的后期确定的。在这项研究中，我们还证明了T1D中的Teff耐药性是由STAT3信号传导介导的，但是IL-6R表达水平或IL-6介导的外周血Teffs的STAT3激活没有改变。然而，T1D患者的Teff中TCR刺激后的STAT3激活加快。总的来说，我们的数据支持这样一种想法，即试图恢复T1D耐受性的一个关键目标是找到有效的疗法，这些疗法不仅可以增强Treg功能，而且可以提高Teff对Treg介导的抑制的抵抗力（38）。通过抑制IL-6，IL-21或TCR信号通路来靶向激活STAT3的方法是此类疗法的潜在候选者。
披露事项
作者没有财务利益冲突。
致谢
非常感谢Anne Suominen（图尔库大学）以及Virpi Fisk，Hanna Eskelinen和Matti Laitinen（东芬兰大学）的熟练技术援助。感谢CélineVandamme（东欧芬兰大学）对手稿的有益评论。
脚注
这项工作得到了芬兰科学院，西格丽德·尤塞留斯基金会，国家研究基金会和芬兰糖尿病研究基金会的支持。糖尿病学会的预防和预测研究得到了芬兰科学院（2012-2017年分子系统免疫学和生理学卓越中心，第250114号决定），西格丽德·朱塞留斯基金会和青少年糖尿病研究基金会的支持。
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本文中使用的缩写：
- 抗体
- 自身抗体
- 白介素6/pSTAT3
- 白介素6–mediated STAT3 phosphorylation
- 贾
- 幼年特发性关节炎
- 小额信贷机构
- 平均荧光强度
- 小姐
- 多发性硬化症
- STAT
- 磷酸化STAT
- sIL-6R
- 可溶性IL-6R
- T1D
- 1型糖尿病
- 特夫
- 效应T细胞
- 特雷格
- 调节性T细胞。
- 已收到 2017年8月21日。
- 公认 2018年6月9日。
- 版权© 2018 by The 美国免疫学家协会, Inc.
