抽象
对单个表位的Abs定量对于理解免疫生物学过程至关重要。在自身免疫中，患者血清学特征的预后价值引起了广泛关注，但对单个表位的Abs检测并没有得到很好的控制。特别是类风湿关节炎（RA）特异性抗瓜氨酸化蛋白/肽抗体（ACPA）对精氨酸残基的两个原子变化具有特异性，被认为是异源抗体家族。作为模型，我们研究了ACPA以破译肽特征如何用作免疫吸附剂影响抗体的检测。我们合成了30种包含瓜氨酸化纤维蛋白免疫优势表位的肽，这些肽的长度和生物素位置不同，并使用ELISA对来自RA和非RA风湿性疾病对照的120份血清进行了ELISA测试，产生了3000多项实验测量值。我们表明，肽化学结构中的微小分子变化具有戏剧性的后果。即使肽表现出相同的表位，所测抗体的Ab滴度也极不相同，在多达50％的病例中，患者的血清阳性反应不一致。表位与生物素之间的距离是有效检测抗体的最关键参数，而与生物素位置或肽长度无关。最后，我们确定了一个带有一个瓜氨酸表位的15-mer肽，可检测几乎所有ACPA阳性血清，从而揭示了RA自身免疫反应的高度均一性。这项综合分析破译了基于肽的技术的分子设计对表位特异性Ab定量的巨大影响。它提供了一种用于测定开发的模型，并强调了使用此类技术的研究可能会误解生物学过程，因此，医学上对数据的使用必须谨慎。
本文的特色 在这个问题上，第3145
介绍
ELISA在70年代发展之后（1, 2），发现具有高亲和力的生物素亲和力（3, 4）使研究人员可以在90年代精确地操纵众多ELISA构建体中的蛋白质/肽段（5）。如今，尽管ELISA已在全球范围内使用，例如用于检测和定量Abs，但一些研究强调了实验参数对此类检测结果的影响（6–10），报告说，表位呈递肽的结构发生细微变化可能会影响抗体被Abs（11–14），因此我们对所分析的生物过程的理解。这对于类风湿性关节炎（RA）等自身免疫性疾病尤其重要，在该类疾病中，自身抗体谱，特异性和效价可能与病理生理机制有关，并影响疾病的诊断或治疗管理（15–20）。
RA是最常见的自身免疫疾病，在发达国家影响着0.5–1％的人口（21），其特征是关节的慢性和破坏性炎症。其病因学和病理生理学仍然未知，但其特征是类风湿因子的产生和抗瓜氨酸化蛋白/肽抗体（ACPA）。 ACPA在疾病发作前几年出现（22）。它们以高诊断特异性存在于已建立的RA的70–80％中（23, 24）。它们与更严重的疾病进程相关（ 25）并预测未分化关节炎向RA的演变（26, 27）。他们在2010年被纳入欧洲风湿病联盟/美国风湿病学院RA分类标准（28）。 ACPA识别的表位是由肽基精氨酸脱亚氨酶在体内对靶蛋白/肽进行的精氨酰残基的翻译后修饰（决定基，也称为瓜氨酸化）生成的。29）。我们证明了瓜氨酸化形式的纤维蛋白是RA滑膜组织中ACPA的主要体内靶标（30），我们开发了一种有效的ELISA方法来检测抗瓜氨酸化的人纤维蛋白原自身抗体（AhFibA）（23）。我们还显示，分别从血纤蛋白的α链和β链序列衍生的两个包含15个瓜氨酸的肽，称为α36–50和β60–74，具有主要的AhFibA表位（31, 32）。我们确定了描绘在α36–50上的两个重叠最小表位（MEα和MEα'）和在β60–74（MEβ）上一个单独的ME所需的氨基酸。 33）。然后，为了评估它们是否具有鉴别的诊断和预后价值，我们计划开发ELISA来专门测量和跟踪针对那些表位的AhFibA亚型。
在当前的研究中，我们表明ELISA中使用的C末端（Ct）或N末端（Nt）生物素位置和肽的长度对1）测试的诊断价值，2）差异有重大影响。血清反应阳性的患者，3）测量抗体滴度，4）Ab概况。最重要的是，我们证明了生物素与目标表位之间的距离是有效检测特定抗体的关键参数。最后，我们强调了在ELISA设置中肽设计的重要性，并表明对获得的数据的解释必须谨慎。
材料和方法
肽设计策略
我们希望特异性检测针对先前在α36-50和β60-74肽中鉴定的4 / 5-mer 我的抗体，这些肽具有瓜氨酸化纤维蛋白的免疫优势表位。为确保短肽与ELISA板的结合，我们合成了生物素化的肽，并添加了生物素6-氨基己酸间隔基（biot6）从表位上阻止生物素，并促进自身抗体的可及性。我们还质疑生物素位置或肽长度对抗体结合的影响。因此，我们合成了一组α36–50衍生的肽（α肽）和β60–74衍生的肽（β肽），其中对于每个序列，在Nt或Ct末端合成了生物素的肽。这些肽分别称为Nt-或Ct-肽。因此，在每个组中（α肽或β肽），所有肽都包含相似的表位，但它们的特征不同：长度，生物素位置以及从生物素到表位的距离（表一）。
肽合成
瓜氨酸化和非瓜氨酸化，非生物素化的15-mer α36–50和β60–74参考肽（31）和相应的Nt生物素化肽段（α36–50Nt和β60–74Nt）在PolyPeptide（法国斯特拉斯堡）购买。其他7、9或15-mer生物素化肽段是通过固相方法合成的（如前所述（33, 34）。
瓜氨酸化纤维蛋白原或其衍生肽的自身抗体的ELISA定量
如先前所述，通过ELISA检测了针对非生物素化α36–50和β60–74参考肽的AhFibA和Abs（23, 32, 33, 35）。 阿菲巴滴度被认为是瓜氨酸化纤维蛋白获得的OD。对于肽，对每种瓜氨酸化（Cit）肽及其非瓜氨酸化（NC）对应物测试血清。滴度被认为是两种肽的吸光度之间的差异（∆OD，称为反应性）。在两个不同的板上重复两次并取平均值。
对于每种生物素化的肽，用RA血清库的四种稀释液测试了各种ELISA方案。然后选择适合最大数量肽段的最佳方案，以测试一系列120种单独的血清（见下文）。在37℃下用抗生物素蛋白（100μl，5μg/ ml； Pierce）包被板1小时，然后在4℃下2小时。然后将瓜氨酸化的肽及其非瓜氨酸化的对照在4°C（100μl，1μg/ ml）下孵育1小时。在4°C下使用PBS–BSA 2％封闭1小时。在洗涤步骤之后，用0.1％的PBS Tween 20稀释（1/100）单独的血清，并在4℃下孵育过夜。其次，开发了针对β60-74Nt肽的特定方案，仅需孵育血清1小时即可。
患者和血清样本
使用了由17个血清组成的RA血清库，这些血清经选择包含高滴度的AhFibA，抗α35-50和抗β60-74自身抗体。此外，病例对照组的血清样本为120例患者（40例确诊的RA和80例非RA风湿性疾病； 表二）显示AhFibA的诊断灵敏度为90％，特异性为95％，用于比较ELISA的诊断性能。所有血清均从图卢兹大学医院风湿病学中心就诊的患者收集，并保存在-80°C下，直到根据国家伦理要求在研究方案中进行测定。根据1987年美国风湿病学会标准将患者分类为RA（36）。
统计分析
将中位数差异与曼·惠特尼进行了比较 U 使用Windows的MedCalc软件，将测试结果与Wilcoxon测试配对配对，将诊断值与McNemar测试进行比较，并将自身抗体效价与Spearman相关系数进行比较。使用Windows的STATISTICA（StatSoft，Tulsa，OK）进行了进一步的统计分析。为了进行聚类，使用欧几里得距离来评估患者基于其Ab概况的差异，然后使用Ward方法将它们按相似性分组。 1）生物素和最后一个氨基或羧酸之间的骨架长度（“肽长度”）以及2）生物素和表位的第一个瓜氨酸残基之间的骨架长度（“生物素-表位距离”）约为原子之间的距离和联络点的旋转角度（ 37）。对于建模，我们使用了通用回归模型包，并使用合意性配置文件可视化了每个参数的效果。为避免极端实验值引起的偏倚，与呈现最高OD值的血清相比，我们仅保留了单个血清相对反应性的10-90％。的 p 使用Holm校正方法（连续Bonferroni）将值（如果≤0.01视为显着）进行调整以进行多次比较（38）。
结果
肽的特性极大地影响了测定的诊断价值和患者的免疫血清学特征
为了研究协议设置对ELISA读数的影响，我们首先对测定进行了优化，以评估“包被步骤”（分子，浓度，持续时间）和“肽步骤”（浓度，孵育时间和温度）表一）。还测试了几种缓冲液。我们观察到ELISA实验条件对抗体检测的主要影响（补充图1）。例如，尽管它们分别表现出与MEαCt和MEα’Ct肽相同的表位，但无论采用何种ELISA设置，MEαNt和MEα’Nt肽均不具有反应性，因此未作进一步探讨。对于所有其他肽，进一步应用相同的最佳方案。因此，尽管测试的肽段显示出相同的ME或相似的序列，但对肽段的血清反应性却显示出较大的变异性（补充图2A–D）。因此，我们进一步分析了肽的特性如何影响所测量的Ab浓度，进而影响血清血清阳性。据报道120种血清的反应性 图1A。尽管所显示的表位相同，但给定血清的反应性似乎从一种肽到另一种肽有很大差异（可能导致血清学状态不一致（图1B, 表二）：有些患者的一种肽为阳性，而另一种肽为阴性。对于α-肽和β-肽基团观察到相似的结果。关于RA血清，在α肽中，α36-50Nt，MEαCt和MEα+ α’Nt肽的反应中位数较低（图1A）与MEα+ α’Ct，MEα’Ct，α36–50Ctp和α36–50Ctp肽进行比较。更重要的是，诊断灵敏度的范围从对α36-50Nt的15％到对α+α'Ct的65％（图1B）。关于β肽，尽管它们的敏感性从β60–74Ct的58％到β60–74Nt的85％不等，但敏感性更高。
肽的特性极大地影响了测定的诊断价值和患者的血清学特征。 （A）40 RA血清（上图）和80 RA非对照血清（下图）对瓜氨酸化纤维蛋白原以及α-和β-基团的肽具有反应性。每行代表一个病人。上图下方显示了每种肽对RA患者的中性反应。 （B）用瓜氨酸化纤维蛋白原和每种肽达到95％特异性阈值获得的血清阳性状态。 （C）根据40名RA患者对不同肽对的血清反应性进行聚类。主群集通过不同的颜色标识。 （D) Clusters comparison of RA patients obtained with all possible paired peptides bearing the 我α+α’ 和 我β。每个病人都用灰色表示。
这些结果表明，肽的特性极大地影响了RA患者确定的血清状况。然后我们想知道它们是否还会影响患者的免疫血清学特征。我们根据血清对来自α-或β-基团的肽的反应性对患者进行分组（图1C，方法的详细信息在 补充图2）。我们获得了两个或三个主要的患者群体，更重要的是，我们观察到一个给定的患者可能属于不同的群体，这取决于所选择的用于聚类的肽，尽管它们呈现相同的表位。因此，即使用于其谱分析的肽表现出相同的表位，两名患者也可能显得极为相似或不同。为了探索这种现象的普遍程度，我们对所有可能的配对肽进行了聚类。令人惊讶的是，我们发现簇聚的患者与肽组合一样多（图1D）。因此，用于免疫学特征的肽的选择高度影响患者的亚组。
肽的选择会影响患者血清阳性状态和血清Ab滴度相关性的主要差异
Ab定量通常被认为是可靠且稳健的，因此当使用共享相同序列或表位的肽进行检测时，Ab定量是相同的。但是，如图所示 图2A，抗体效价之间的相关性波动很大。例如，在检测到的α36–50Ct和α36–50Nt自身抗体之间没有显着相关性（r = 0.332，NS），但是将α36-50Ct与抗MEα+ α’Ct（r = 0.816， p < 10−3尽管所有肽都表现出相同的表位。经常用于避免半胱氨酸残基之间形成二硫键的乙酰氨基甲基基团在我们的特殊情况下仅产生很小的影响，从而导致用α36–50Ctp和α36–50Ct检测到的自身抗体之间具有高度相关性（ r = 0.911; p < 10−4）。
肽的选择会影响患者血清阳性状态和血清Ab滴度相关性的主要差异。 （A）40名RA患者中自身抗体效价（血清反应性）的成对比较（Spearman等级相关）。 （B）在40例RA患者中，血清反应阳性状态不同（阳性与阴性）的比例。 （CRA和对照血清对AhFibA和抗β60-74Nt自身抗体的自身抗体滴度和相应的血清阳性。
理论上，两个诊断测试可以显示出相同的诊断灵敏度，并且在血清阳性方面存在差异。我们调查了AhFibA亚家族是否发生差异。引人注目的是，例如，对于7个mer-MEβNt和-Ct肽，尽管生物素的位置既不影响中位反应性也不影响诊断敏感性（两者均占75％），但许多患者表现出血清反应阳性的状态。实际上，RA血清中47％（30个中的14个）和4个对照中的3个是不一致的。总体而言，取决于肽段，生物素位置对中位反应性和诊断灵敏度的影响不同（图2B, 补充图3）。然而，β60–74Nt肽对于诊断目的显得尤为重要，我们第二次优化了其ELISA方案。实际上，在病例对照组中，我们的诊断敏感性为92.5％（ 图2C）在95％的特异性下，与AhFibA的高度一致（94％，113/120），表明β60-74Nt呈递的抗原决定簇几乎被所有AhFibA阳性RA血清所识别。
总而言之，这些数据表明，除了表现出的表位外，诸如血清阳性和Ab效价之类的生物学数据高度依赖于测定中所用肽的特征。
生物素分子与表位之间的距离是影响Abs识别表位的主要参数
接下来，我们旨在揭示肽相关参数对ELISA获得的结果的独立贡献。我们选择了包含MEβ或MEα+α′表位的四种肽，并计算了它们的理论长度以及生物素分子与表位之间的距离（图3A）。与大多数反应性血清相比，RA血清在每种肽上的相对反应性表现出很大的变异性。关于α肽，α36-50Nt，α+ α’Nt，α+ α’Ct和α36-50Ct的中位相对反应性分别为3、26、57和100％（图3B）。关于β肽，β60–74Ct，MEβCt，MEβNt和β60–74Nt分别为17、23、27和100％。然后，我们评估了肽长度，生物素位置和生物素-表位距离对获得最高相对反应性（称为可取性）的可能性的影响。多元分析表明，反应性水平不取决于肽长度（β= -0.01； 95％置信区间[CI] = [-0.10； 0.09]； NS）或生物素位置（β= 0.11； 95％CI = [0.01; 0.2]; NS），但高度依赖于生物素与表位的距离（β= 0.79; 95％CI = [0.70; 0.87]; p < 10−4）。实际上，具有相似表位-生物素距离的肽表现出相似的期望性，而与肽长度无关（图3C），并且当表位远离生物素分子时，具有相似长度的肽的反应性显着增强。与这些结果一致，我们可以预测到，两个MEαNt和MEα’Nt肽的反应性将比Ct生物素化的对应物低，因为它们的表位更接近生物素分子，这表明了我们模型的一致性。
生物素分子与表位之间的距离是影响Abs对表位识别的主要参数。 （A) Peptides mapped according to the theoretical approximation of peptide length 和 distances between epitope 和 比奥in molecule (biotin–表位距离）。 $对应于两个MEαNt 和 我α’Nt peptides 和 &对应于MEαCt 和 我α’Ct peptides. (B）40 RA血清对表现出相同的MEα+α'和MEβ表位的肽的相对反应性。 （C) Effect of 比奥in–表位距离，生物素位置和肽段长度对获得最大反应性的可能性（理想性，最佳表位检测）。
因为β60–74Nt似乎是一种非常有效的测定方法，但已被测试为β60–74Nt1 形式（无比奥6），我们想知道是否通过添加间隔基来增加生物素与表位的距离是否会进一步提高其反应性。血清对β60–74NtBiot的反应性1 和β60–74NtBiot6 没什么不同（补充图4），提示可能存在最佳的最小生物素-表位距离，以有效检测每种肽的表位。
总体而言，从用40种RA血清对以AhFibA识别的免疫显性表位进行测试的320种实验结果中表现出的四种不同构象，我们建立了一个模型，表明生物素-表位距离是影响表位识别的主要重要参数。
讨论区
在这项研究中，我们提供了一种综合方法来定义用作免疫吸附剂的肽的最佳特征，以检测特定的抗体。
我们首先强调了协议优化对有效测试的主要影响，因为无论肽结构如何，实验条件（肽浓度，孵育时间，温度或持续时间）都会极大地影响被测血清的反应性。
其次，我们证明了肽的长度本身也具有重要影响。确实，尽管它们都包含一个相似的靶向表位，但7至9个肽段对于最佳的表位识别还是太短了。但是，并非所有的15-mer肽都是有效的。我们的数据不仅支持其他人使用瓜氨酸或非瓜氨酸银的结论（12, 34, 39, 40），但也提出了一个问题，即哪种肽的特性对ELISA结果有重大影响。实际上，只有少数研究调查了生物素位置或表位-生物素距离对单个表位识别的影响（11, 34, 40）。通过各种肽以不同构型涵盖单个表位，我们证明了生物素-表位距离是影响表位识别的主要重要参数。我们的模型使我们建议，用于ELISA开发的最佳肽应为〜15氨基酸的生物素化肽，其中生物素应位于与表位相对的末端。该模型可以很容易地适用于使用肽的所有生物领域，例如筛选Ab文库（41–43）或Ab分析（44–47）。
此外，我们的工作使我们能够鉴定出生物素化形式的β肽β60–74Nt，这是一种非常有效的诊断工具。与AhFibA检测相似，它可使该检测方法对RA达到非常好的诊断性能。尽管需要在更大的队列中证实使用该肽获得的诊断性能，但该结果表明，几乎所有AhFibA阳性血清均识别βME，因此强调了我们先前的结论，即β60-74具有AhFibA识别的免疫优势表位（32, 48）。
我们的结果还突出显示了难以比较具有不同表位的肽和具有相同表位但肽的序列，结构或结合系统不同的肽的ELISA结果（49, 50）。更具体地说，我们建议大多数使用各种瓜氨酸化肽的研究描述的ACPA异质性可能部分是人为的，这是由于所测试的肽的多样性（45, 51），因此比通常建议的重要性（32, 33）。这可能解释了ACPA的任何亚科（ACPA优良特异性）与疾病活动或严重程度或遗传参数之间缺乏差异关联（45, 52–54）。但是，研究表明，大多数RA血清都能识别几种瓜氨酸化的肽（44, 45）;因此，我们假设针对β60-74表位的自身抗体可能通过交叉反应被这些肽差异捕获。根据协议，ACPA首先通过交叉反应被识别为针对丝聚蛋白的Abs（30），我们最近发现，AhFibA的一个亚群在β60-74与来自爱泼斯坦巴尔核Ag-1的瓜氨酸化肽之间发生了交叉反应（55）。
总而言之，我们的结果要求对使用不同瓜氨酸化肽段（例如涉及亲和力（15, 16, 56），抗原决定簇扩散（57, 58）和Ab个人资料（44–47），也可以是遗传或临床关联（53）。
总而言之，我们破译了肽结构对检测特定抗体和通过ELISA获得的生物学数据的巨大影响。尤其是，我们表明，生物素与表位的距离大于肽长度和生物素化面，是主要的影响参数，为基础和生物医学研究提供了相关的关键。
披露事项
作者没有财务利益冲突。
致谢
我们感谢MF。 Isaïa，A。Legué，E。Parra和M. Larrieu的出色技术支持。为了纪念C. 文森特博士，他在数据分析中提供了宝贵的建议和帮助。
脚注
这项工作得到了图卢兹三世大学，CNRS，INSERM，关节炎基金会-雅克·考特琳的研究补助金，以及法国白兰地-洪格里国家侦察局计划（2009年ANR-09-BLAN-0398-01）的资助。和TET_09_FR_ANR_BIO）。
本文的在线版本包含 补充材料.
本文中使用的缩写：
- ACPA
- 抗瓜氨酸化蛋白/肽抗体
- 阿菲巴
- 抗瓜氨酸化人纤维蛋白原自身抗体
- 比奥6
- 生物素-6-氨基己酰基间隔基
- CI
- 置信区间
- Ct
- C端
- 我
- 最小表位
- t
- N端
- α肽
- α36-50衍生肽
- β肽
- β60–74衍生肽
- RA
- 类风湿关节炎。
- 已收到 2018年3月19日。
- 公认 2018年9月23日。
- 美国免疫学家协会版权所有©2018。
