抽象
胸腺e乐彩下载中的糖皮质激素（GC）信号可逆转阴性选择，并促进自我耐受但对Ag响应的Te乐彩下载库的生成。尽管循环GC来自肾上腺，但GC也从头合成在胸腺中。这种本地生产的重要性尚不清楚。在这项研究中，我们删除了胸腺上皮e乐彩下载（TEC）或胸腺e乐彩下载中11GC催化11GC生物合成最后一步的羟化酶。与缺乏GC受体的Te乐彩下载一样，缺乏TEC衍生但不是胸腺e乐彩下载衍生的GC的小鼠Te乐彩下载对同种抗原的增殖能力很差，抗病毒反应降低，并且阴性选择增强。令人惊讶的是，缺乏TEC来源的GC的小鼠胸腺e乐彩下载中的GC反应基因的基础表达降低了与GC受体缺失的胸腺e乐彩下载相同的程度，这表明在稳态下，大多数具有生物学活性的GC都是旁分泌的。这些发现证明即使在循环性肾上腺来源的GC存在下，肾上腺外GC的重要性。
介绍
在胸腺中发生有能力但自我耐受的Te乐彩下载Ag特异性库。 CD4的命运+CD8+ （双阳性，DP）胸腺e乐彩下载通过识别由MHC分子（self-pMHC）呈递的自身肽来确定。具有无法识别皮层胸腺上皮e乐彩下载（TEC）呈现的自身pMHC的TCR的DPe乐彩下载会因忽略而死亡。那些识别自我pMHC的e乐彩下载进入延髓，在那里他们会遇到迁移的树突状e乐彩下载，其中一些表现出来自外周组织的自我pMHC，髓质TEC（其中自身免疫调节剂（Aire）驱动受组织限制的Ags的表达）以及驻留的树突状e乐彩下载。髓质TEC（1）。具有对自身pMHC具有强亲和力的TCR的DPe乐彩下载会死亡（阴性选择），而具有中等亲和力的TCRe乐彩下载会存活（阳性选择）并聚集在周围（2, 3）。
糖皮质激素（GC）是与GC受体（GR）结合的类固醇激素，GC受体是一种配体依赖性转录因子，可转运至e乐彩下载核并通过与其反应元件或其他转录因子结合来调节转录。 GC有效下调促炎性e乐彩下载因子，趋化因子和PG的产生，并拮抗NF-κB和AP-1（4）。 GC还抑制Nur77（5），这是TCR诱导的转录因子，与胸腺e乐彩下载阴性选择有关（6, 7）。我们以前曾建议，通过在远端步骤（即在e乐彩下载核中）钝化TCR信号，GC可以提高自我pMHC抗体的亲和力阈值，在该阈值之上会出现阴性选择，从而允许对TCR进行阳性选择，否则将被阴性选择（8）。最初从胎儿胸腺器官培养物中获得了GC对胸腺e乐彩下载选择的影响的证据，其中通过药物学抑制局部GC产生来增加TCR转基因胸腺e乐彩下载的阴性选择（9）。随后，这得到了体内研究的支持，在体内研究中，GR表达因反义转基因的表达而减少（10–12）。小鼠胸腺e乐彩下载中GR缺失的小鼠获得了最佳证据（13）。这些小鼠的Te乐彩下载通常对全谱独立的TCR刺激有反应，但对外源Ag免疫，淋巴e乐彩下载性脉络膜脑膜炎病毒（LCMV）阿姆斯特朗菌株感染和同种APC培养的反应减弱，这表明Te乐彩下载的亲和力降低曲目公认的pMHC（13）。通过分析TCRVβCDR3序列，证实了TCR库的改变。
尽管循环GC主要在肾上腺皮质产生，但胸腺本身是合成位点（14–19）。培养的小鼠和鸡TECs表达GC合成酶并分泌类固醇中间体和GC自身，当肾上腺的GC最低时，其产量在出生时最高（14, 17, 20）。直接测量胸腺GC后发现皮质酮及其前体类固醇浓度高于血液，尤其是在出生后不久，这证实了体内胸腺GC的合成（19）。除TEC外，有人还提出胸腺e乐彩下载本身是GC的来源，尤其是在生命的后期（18）。胸腺或任何与此相关的组织中肾上腺外GC合成的功能贡献尚不清楚。为了解决这个问题，我们有条件地删除了11β-羟化酶（cyp11b1（P450 c11b1），该酶催化TEC或胸腺e乐彩下载中无生物学活性的前体向活性GC的转化，并表征胸腺e乐彩下载和Te乐彩下载的结果。
材料和方法
老鼠
C57BL / 6（B6）和同类菌株 B10.A 和 Rag2-/-和TCR转基因小鼠（21）， β肌动蛋白-脂蛋白 (22）， FoxN1-Cre–转基因小鼠（23），以及 β肌动蛋白-Cre 从杰克逊实验室获得小鼠。 Lck-Cre-从Taconic获得了转基因小鼠。 Nr3c1 （GR）外显子3有条件靶向的小鼠进行了描述（13）。有条件的 cyp11b1 与等位基因 x 3-5号外显子侧翼的位点是通过重组产生的（24）（补充图1A），以及 cyp11b1使用C57BL / 6胚胎干e乐彩下载产生了狐尾小鼠。 Neo盒是通过与 β肌动蛋白-脂蛋白 转基因小鼠。在这项研究中使用的所有小鼠回交到B6至少六代。用于基因分型的引物序列在 补充表一.
腹肌
皮质酮的测量
皮质酮通过化学发光ELISA（Arbor Assays）测定。
e乐彩下载培养与Te乐彩下载增殖
在补充有10％热灭活小牛血清（Sigma），100μg/ ml庆大霉素，4 mM谷氨酰胺和50μM2-ME的RPMI 1640（Biofluids）中培养Te乐彩下载。为了测量Te乐彩下载增殖，3×104 （抗CD3 / CD28）或1.5×105 （alloantigen）纯化的淋巴结Te乐彩下载一式三份在总体积为200μl的完全培养基中培养，该完全培养基带有0.5μg/ ml板结合的抗CD28和指示量的板结合的抗CD3，或指示数目的在96孔板中照射B10.A脾e乐彩下载。 48（抗CD3 /抗CD28）或72（alloantigen）h后，将孔脉冲过夜 3并收集胸腺嘧啶核苷。使用1450 Microbeta液体闪烁计数器（Wallac）确定放射性的掺入。
e乐彩下载纯化和流分选
通过消化切碎的胸腺并用不连续的percoll富集分离TEC，如所述（25）。来自分类TEC的基因组DNA（Epcam+，MHC-II+和CD45.2−）和DP胸腺e乐彩下载（TCRβ+, CD4+CD8α+使用DNeasy试剂盒（Qiagen）纯化）。用FACSAria II或FACSAria Fusion（BD Biosciences）进行分类。使用Dynabead Untouched Mouse Te乐彩下载试剂盒（Invitrogen）从淋巴结中纯化用于增殖测定的Te乐彩下载。
逆转录PCR
用RNeasy Mini试剂盒（Qiagen）分离总RNA，并用Superscript RT（Invitrogen）生成cDNA。使用QuantStudio 6（Applied Biosystems）与SYBR Green PCR混合物（Applied Biosystems）进行实时PCR。结果相对于 惠普 表达。用于实时PCR的引物序列在 补充表一.
病毒感染
左室病毒 Armstrong从Dorian McGavern（美国国家神经疾病和中风研究所）获得。腹膜内接种小鼠。与2×105 PFU。脾e乐彩下载用含有LCMV肽gp33，gp276和np396的APC标记的I类四聚体染色（美国国立癌症研究所四聚体核心设施）。
体内LPS治疗
来自的LPS 大肠杆菌 （＃L2880； Sigma）溶解在PBS中并经腹膜内注射。剂量为3微克/克体重。对照小鼠仅注射PBS。
统计分析
除非另有说明，否则使用GraphPad Prism软件和未配对的两尾学生进行统计分析 t 测试。一个 p 值≤0.05被认为是显着的。多次实验的平均结果表示为算术平均值±SEM。
结果
条件的生成和功能表征 cyp11b1 allele
整体缺失第3-7号外显子的小鼠 cyp11b1 明显减少了肾上腺皮质激素的产生（26）。为了解决胸腺来源的GC在胸腺e乐彩下载发育中的作用，我们生成了小鼠 cyp11b1 可能以组织特异性的方式被破坏。在其中产生了小鼠 x 网站两侧 cyp11b1 exons 3–5 (cyp11b1fl / fl 老鼠， 补充图1A）。删除这些外显子会导致一个开放的阅读框包含501 aa的第一个135个氨基酸，然后是五个框外残基（补充图1B）。这些小鼠与表达 肌动蛋白-删除 cyp11b1 在整个种系中cyp11b1-/- 老鼠）。培养的野生型（WT），但不是 cyp11b1-/- 肾上腺e乐彩下载合成了大量的皮质酮，这可以通过预防 cyp11b1 抑制剂甲吡酮（图1A）。血浆皮质酮水平 cyp11b1-/- mice were <WT水平的50％，与报告的减少类似 cyp11b1 外显子3-7靶向小鼠（26），但与的水平无统计学差异 cyp11b1foxN1-Cre animals (图1B）。系统性GC增加以应对诸如LPS（27）。腹膜内注射LPS可增加WT中血浆皮质酮水平，但不会 cyp11b1-/- mice (图1C）。最后， cyp11b1-/- 小鼠表现出肾上腺增生（图1D），GC生产受损的特征（26）。
图1。
缺乏皮质酮的生产 cyp11b1 exon 3–5-/- (cyp11b1-/-） 老鼠。 （AWT和WT肾上腺上清中皮质酮的浓度。 cyp11b1-/-在不存在或存在甲吡酮的情况下培养3 d的小鼠。在不存在或存在200的条件下培养每只小鼠的肾上腺μg/ml metyrapone. (B）WT血浆中的皮质酮水平， cyp11b1foxN1-Cre和 cyp11b1-/- mice. (CWT和血浆中皮质酮水平 cyp11b1-/- 单独注射LPS或PBS后3小时。 （D) cyp11b1-/- 小鼠表现出肾上腺增生。 WT和WT的肾上腺重量 cyp11b1-/-老鼠。此图中的所有数据均以平均值表示± SEM with n = 3. **p < 0.005, ***p < 0.0005.
泰科而非胸腺e乐彩下载是胸腺GC的主要来源
cyp11b1 通过杂交在TEC或胸腺e乐彩下载中被删除 cyp11b1fl / fl 小鼠表达Cre敲入 FoxN1 locus (23）（cyp11b1foxN1-Cre 小鼠）或表达为由近端驱动的转基因 ck promoter (cyp11b1ck-Cre mice) (28）。通过分选纯化e乐彩下载的基因组DNA的PCR显示缺失的组织特异性，这表明 cyp11b1 第4外显子不在 cyp11b1foxN1-Cre TEC，但不是DP胸腺e乐彩下载，相反的情况适用于 cyp11b1ck-cre cells (图2A）。由于在肾上腺衍生的GC中压力引起的升高可引起急性胸腺退化（29），假设胸腺也对稳态下的循环水平有反应。但是，全身性的相对贡献 与 旁分泌GC从未在实验上得到解决。为此，两个GC响应基因的组成型表达 吉尔兹 和 Lad1 (30）用作新鲜分离的胸腺e乐彩下载中GC信号的读数。在GR缺乏的胸腺e乐彩下载中GRck-cre）， 吉尔兹 和 Lad1 与野生型对照相比，mRNA水平降低了40–50％（图2B）。 吉尔兹 和 Lad1 表达减少类似 cyp11b1-/- 如预期的那样，胸腺e乐彩下载 cyp11b1foxN1-Cre 胸腺e乐彩下载，其中仅缺少TEC合成的GC。相反，这种减少在小鼠的胸腺e乐彩下载中未观察到。 cyp11b1ck-cre 老鼠，或在 cyp11b1 heterozygous (cyp11b1fl / +，肌动蛋白）胸腺e乐彩下载。 GC无反应基因的胸腺e乐彩下载表达 Calm3 在基因型上相似。差异 吉尔兹 和 Lad1 表达不是由于GC低反应性引起的，因为它们是在所有GR足够的胸腺e乐彩下载中由外源性GC诱导的（补充图1C）。总之，这些数据表明，具有生物活性的胸腺GC是由TEC而不是由胸腺e乐彩下载从头合成的。此外，在基础条件下，胸腺e乐彩下载GC信号主要由TEC而非肾上腺衍生的GC驱动。
图2。
减少糖皮质激素依赖性基因的表达 cyp11b1foxN1-Cre thymocytes. (ACre介导的破坏 cyp11b1。来自野生型和野生型的分类TEC和DP胸腺e乐彩下载的基因组DNA cyp11b1foxN1-Cre (N1-Cre）和 cyp11b1ck-cre (ck-cre通过PCR分析小鼠中是否存在 cyp11b1 外显子4。对照引物对H-2A基因座具有特异性（41）。显示了每个Cre的一对代表性的三组小鼠。 （BGC敏感和不敏感基因的mRNA水平 cyp11b1foxN1-克 胸腺e乐彩下载。通过RT-PCR确定新鲜分离的胸腺e乐彩下载或用100 nM皮质酮处理3小时后的胸腺e乐彩下载相对mRNA水平。通过单向方差分析确定显着性，然后进行Fisher最小显着差异倍数比较（每个突变体与对照， n = 4–8). **p < 0.005, ***p < 0.0005.
在没有TEC衍生的GC的情况下增强了阴性选择
未成熟胸腺e乐彩下载中GR的缺失导致阴性选择e乐彩下载，否则将被阳性选择（13）。一个例子是减少DP和CD4+ 转基因TCR正常促进CD4阳性选择的AND小鼠中的胸腺e乐彩下载+ T cells in H-2b 动物。为防止内源性TCRα重排，重组酶激活基因2（抹布-2）通过与AND交叉删除 RAG2-/- 老鼠。与AND相同 GRck-cre 胸腺e乐彩下载对GC无反应的小鼠（13），DP和CD4的数量减少了+ 单个阳性（SP）胸腺e乐彩下载 cyp11b1foxN1-Cre AND老鼠与 cyp11b1fl / fl AND controls (图3A）。在负选择过程中上调的分子包括PD-1，Helios和促凋亡Bcl-2家族成员Bim（31）。此外，膜联蛋白V与活跃地凋亡的e乐彩下载结合（32）。我们检查了预选胸腺e乐彩下载（DP），TCR信号的DP胸腺e乐彩下载[TCR你好 (33）]的e乐彩下载群体，这些e乐彩下载富含进行负选择的e乐彩下载[CD4低/CD8低 double dull (34–36）]和成熟的胸腺（CD4+ SP）。我们发现，来自 cyp11b1foxN1-Cre AND小鼠的Bim比例较高你好PD-1+ e乐彩下载与 cyp11b1fl / fl AND controls (图3B）。令人惊讶的是，凋亡e乐彩下载（Helios你好膜联蛋白V+）增加了 cyp11b1foxN1-Cre 胸腺e乐彩下载，最明显的是在双沉闷子集中。因此，失去TEC衍生的GC小鼠会导致正常进行正选择的胸腺e乐彩下载负选择增加。
图3。
在TECs不产生皮质酮的情况下，胸腺e乐彩下载发育的阴性选择增加。 （A，左侧面板）代表5周旧的CD4与CD8配置文件 和TCR WT和 cyp11b1foxN1-Cre thymi。数字代表每个象限中的百分比。 （A，右图）5周龄野生小鼠的总胸腺e乐彩下载和亚群（n = 10）和 cyp11b1foxN1-Cre (n = 6) Rag2-/- mice. (B）增加了负面选择的指标 cyp11b1foxN1-Cre AND TCR 胸腺e乐彩下载。 PD-1和Bim表达（左上图）以及Helios表达和膜联蛋白V结合（右上图）显示在WT和 cyp11b1foxN1-Cre AND TCR 胸腺e乐彩下载。下面分别显示了三只（Bim / PD-1，左下）和四只（Helios / Annexin V，右下）小鼠的平均值和SEM。 *p < 0.05, **p < 0.005, ***p < 0.0005.
cyp11b1foxN1-Cre Te乐彩下载对同种和异种Ag的反应降低
GR缺陷型Te乐彩下载中所有组成改变的标志是同种异体反应降低（13）。如果TEC产生旁分泌是胸腺内GC的主要来源， cyp11b1foxN1-Cre 还预期Te乐彩下载对同种异体APC的应答降低。为了测试，H-2b 用照射的H-2培养Te乐彩下载a 脾e乐彩下载。鉴于 cyp11b1foxN1-Cre Te乐彩下载对板结合的抗CD3 /抗CD28的刺激反应正常， cyp11b1foxN1-Cre Te乐彩下载对同种异体的刺激变钝了（图4A）。胸腺e乐彩下载合成的GC对TCR库的可能贡献是通过使用 cyp11b11ck-克 Te乐彩下载作为应答者。 WT和 cyp11b11ck-Cre Te乐彩下载与抗CD3 /抗CD28和同种异体APC相同（图4B）。
图4。
的曲目 cyp11b1foxN1-Cre Te乐彩下载，但不是 cyp11b1ck-cre Te乐彩下载被削弱。 （A) cyp11b1foxN1-Cre Te乐彩下载正常（左）增生到交联的CD3（抗CD3 / CD28），但不增殖（右）成同种抗原。 （B) cyp11b1ck -Cre Te乐彩下载正常增殖至TCR交联和同种抗原。数据表示为来自四个（cyp11b1foxN1-Cre）和四个（cyp11b1ck-cre）独立实验。数据显示为平均值±SEM。
与同种抗原相似，TCR组成改变 GRck-cre 当小鼠感染LCMV Armstrong株后，导致Te乐彩下载的反应较差（13），从而产生了坚固的CD8+ Te乐彩下载反应在7天达到峰值。 WT和 cyp11b1foxN1-Cre 用LCMV感染小鼠，并在7天后鉴定脾Te乐彩下载。 cyp11b1foxN1-Cre 小鼠的CD4减少了15％和30％+ 和 CD8+ Te乐彩下载子集分别与WT（图5A）。 LCMV gp33特异性CD8的数量减少+ 脾脏中的Te乐彩下载 cyp11b1foxN1-Cre 通过肽-MHC-1四聚体结合测量小鼠。 LCMV np396反应性CD8 Te乐彩下载也有所减少，尽管减少并未达到统计学意义。相比之下，定位 cyp11b1 在胸腺e乐彩下载中的表达并不影响对LCMV的反应（图5B）。因此，在没有TEC-但没有胸腺e乐彩下载的GC的情况下发育的Te乐彩下载对pMHC的反应能力降低。
图5。
减少CD8+ LCMV感染的Te乐彩下载反应 cyp11b1foxN1-Cre (A） 但不是 cyp11b1ck-cre (B） 老鼠。用LCMV Armstrong感染小鼠，并在7天后分析脾e乐彩下载。 （A和B）显示的是（左）脾e乐彩下载和Te乐彩下载的数目和（右）MHC-1四聚体的数目 + CD8 + 来自指定基因型（WT， n = 12, Cy11b1foxN1-Cre, n = 11; ckCre 单独， n = 6, cyp11b1ck-cre, n = 6）。数据表示平均值±SEM。 *p < 0.05, **p < 0.005.
讨论区
长期以来人们一直认为，作用于胸腺的GC来源于循环系统。但是，发现TEC可以产生GC（ 14, 16）提高了本地衍生产品具有生物活性的可能性。实际上，在胎儿胸腺器官培养物中阻断GC的产生导致TCR介导的激活增加，负选择增加（15）。为了评估在胸腺中局部和全身性GC的相对贡献，我们量化了稳态时胸腺e乐彩下载中GC反应基因的表达。值得注意的是，缺乏局部合成将这些基因的表达降低到与GR缺乏的胸腺e乐彩下载相同的水平，后者根本无法响应GC。这意味着在基础条件下胸腺中大部分的生物活性GC由TEC以旁分泌的方式提供。对内分泌GC信号的经典理解的这种差异可以通过提高生物利用度来解释。胸腺e乐彩下载和TECs之间的相互作用是TCR-pMHC相互作用基础的前提。通过e乐彩下载与e乐彩下载接触的旁分泌传递增加了GC直接从TEC传递到胸腺e乐彩下载而不扩散和稀释到e乐彩下载外空间的可能性。另外，直接递送至胸腺e乐彩下载的激素将绕过载体蛋白。血浆GC约有80–90％被皮质类固醇结合球蛋白结合，另外5–10％被白蛋白结合，仅剩下5％游离，可通过进入e乐彩下载并结合GR发出信号（37）。直接从TEC传递到胸腺e乐彩下载的GC因此具有比通过血液传递的GC有效浓度高得多的有效浓度。
据报道，胸腺e乐彩下载表达全套类固醇生成酶，并能在体外产生可测量的皮质酮（18, 38, 39）。成年（14-22周龄）小鼠的胸腺e乐彩下载产生的GC比年轻小鼠的胸腺e乐彩下载产生更多，这表明，胸腺e乐彩下载取代TECs可以在以后的生命中产生GC（18）。我们和其他人无法在体外检测到胸腺e乐彩下载Cyp11b1的活性[数据未显示和（40）]。但是，通过删除基因，我们能够通过基因测试胸腺e乐彩下载产生的GC的作用 cyp11b1 在胸腺e乐彩下载和Te乐彩下载中。 GC敏感基因在 cyp11b1ck-cre 胸腺e乐彩下载正常，这表明胸腺e乐彩下载在总体水平上检测到的GC水平是正常的。如对同种异体APC和LCMV的反应所表明， cyp11b1ck-cre Te乐彩下载也正常。
该报告中的数据证明了胸腺产生的GC的旁分泌作用模式，其中GC的作用先前归因于通过肾上腺产生的激素控制。意识到本地生产的GC的影响可以帮助开发针对胸腺e乐彩下载发育的靶向疗法。
披露事项
作者没有财务利益冲突。
致谢
我们感谢Bei Dong提供的专业技术支持，也感谢Dorian McGavern给LCMV的礼物。
脚注
这项工作得到了美国国立卫生研究院国家癌症研究所癌症研究中心的壁内研究计划的支持。
本文的在线版本包含 补充材料.
本文中使用的缩写：
- cyp11b1
- 11β-羟化酶
- DP
- 双重肯定
- GC
- 糖皮质激素
- GR
- GC受体
- 左室病毒
- 淋巴e乐彩下载性脉络膜脑膜炎病毒
- MHC-II
- MHC II级
- 自身pMHC
- MHC分子呈递的自身肽
- SP
- 单阳性
- 泰科
- 胸腺上皮e乐彩下载
- WT
- 野生型。
- 已收到 2017年9月20日。
- 公认 2018年1月11日。
