抽象的
Golgi磷蛋白2（GOLPH2）是一种广泛表达的GOLGI II型跨膜蛋白，其涉及几种重要的生理和病理过程，包括病毒感染，癌细胞增殖和转移。然而，其生物学功能和机制，特别是在免疫系统中，仍然非常模糊。在这项研究中，我们报告了来自B细胞淋巴瘤培养上清液的戈尔福2的生物化学鉴定，并表明分泌的蛋白质可以通过活化的T细胞抑制树突细胞（DCS）和IL-12诱导的IFN-γ产生的IL-12产生。进一步的分子分析表明，通过近端介导的GOLPH2的IL-12抑制活性IL12P35.涉及先前鉴定的转录抑制剂的启动子元素，其命名为GC结合蛋白，其通过巨噬细胞诱导凋亡细胞吞噬作用。我们随后生成全球GOLPH2.敲除小鼠，其表现出少的发育异常，但更容易受到LPS诱导的内毒性震动，而不是具有血清IL-12水平升高的野生型小鼠。此外，我们发现GOLPH2在朝巨噬细胞极化朝向M2型中发挥了调节作用。通过RNA测序发现激活野生型和GOLPH2缺陷DCS的基因表达谱的综合分析揭示了GOLPH2在炎症性损伤期间可能调节DC功能的机械洞察。我们对Golph2的功能研究有助于提高这种新颖和有趣分子的生物和致病作用的科学理解，其具有诊断和预后标志物以及许多急性和慢性炎症性疾病中的治疗靶标。
介绍
越来越多的研究揭示了B细胞和T细胞相互作用。 T细胞有助于诱导B细胞的末端分化为IG类切换等离子体细胞（1, 2）。相互作用，B细胞可以诱导Ag特异性CD8 T细胞的直接耐受性（3），通过TGF-β生产诱导T细胞anergy（4），并且还通过生产监管因素来影响Th1 / Th2分化（5）。类似地，B细胞可以在T细胞免疫的体内模型中发挥调节功能，包括肿瘤排斥（6），实验性自身免疫性脑炎（7）和类风湿性关节炎（8）。在小鼠中，最近已经鉴定了具有IL-10依赖性阴性T细胞调节功能的相对罕见的脾脏B细胞子集并命名为B10细胞（9, 10），通过抑制树突细胞（DCS）的Ag呈递能力来间接调节T细胞介导的自身免疫性（11）。此外，据报道，在自身免疫和慢性炎症疾病中的B细胞分泌的肽来控制穿过内皮的T细胞贩运的稳态调节（12）。然而，B细胞如何调节分子水平的T细胞介导的抗肿瘤免疫力尚未明确建立。
IL-12，由P35组成的异二聚体（编码 Il12a）和p40（编码 Il12b），主要由APCS产生，包括巨噬细胞/单核细胞和DCS，响应于某些病原体的刺激。它主要激活NK细胞并诱导幼稚CD4 T细胞以区分IFN-γ-产生的TH1细胞，并且是先天性和适应免疫之间的关键链接（13, 14）。与该独特的异二聚体细胞因子家族IL-23的其他成员一起（由P19和IL-12P40），IL-27（P28和EBI3）以及IL-35（EBI3和IL-12P35）以及IL-35（EBI3和IL-12P35）的其他成员一起是自身免疫和炎症反应，疾病和癌症的关键扮演者（15）。但是，关于有时神秘的IL-12仍有许多未解决的问题。
努力探讨B细胞如何调节T细胞介导的抗肿瘤免疫力，我们采用了基于蛋白质组学的方法，并通过活化的恶性B细胞鉴定了分泌的活性。这种新的活性通过选择性抑制在DCS中的IL-12的产生时间接抑制T细胞活化。进一步的生物化学分析显示该IL-12抑制剂作为Golgi磷蛋白2（GOLPH2）。在过去几年中，大量的独立研究已经确定了肝脏疾病患者血清中的高水平的戈尔福2（患有肝细胞癌）（HCC）（16–18）。在丙型肝炎病毒背景下开发HCC的患者中观察到血清血清血清血清水平的升高（19）和乙型肝炎病毒感染（20）。肺癌和前列腺癌的血清GOLPH2水平也显着升高（21, 22）。鉴于GOLPH2看似广泛的作用，我们将我们的研究重点研究了炎症环境中专业APC（DCS和巨噬细胞）的IL-12抑制活性。
材料和方法
基因分型和细胞系
上海山上淘汰赛（KO）小鼠与Talen Technology（中国上海）的模型生物研究中心建立。小鼠通过尾部活组织检查DNA的PCR分析如下，如下：P1，5'-GATCCAGTCTAGCCAGCTT-3'; P2，5'-aactgacaggatccagtctagctggag-3'; P3，5'-gaccctgaacacaactccc-3'。 P1和P3和P2和P3分别用于野生型（WT）和KO小鼠基因分型。将小鼠繁殖并维持在无特异性的无理体设施中，并根据上海交通大学制度畜牧业和使用委员会批准的议定书处理。小鼠巨噬细胞系Raw264.7购自中国科学院（中国上海）的细胞中心。
试剂和质粒
LPS（0127：B8或011：B4）购自Sigma-Aldrich（ST.LOUIS，MO）。含有人和鼠GM-CSF，IL-4，TNF-α，IL-13和IFN-γ的纸中使用的所有重组蛋白来自PEPROTECH（岩石山，NJ）。从Miltenyi Biotec购买人类CD4珠子，CD14珠子和CD19珠子和鼠CD4珠子，CD8珠和CD11c珠粒。如前所述描述了人IL-12P35和IL-12P40启动子 - 荧光素酶构建体（23）。通过将开放阅读框插入Ptriex-3 Neo或PlVX-EF1α向量来产生Golph2表达质粒。
细胞准备
+ macrophages.
ELISA和定量实时PCR
根据制造商的说明，通过来自BD Pharmingen（San Diego，CA）的ELISA试剂盒分析了IL-12P40，P70，IL-10和TNF-α水平。使用RNeasy试剂盒（QIAGEN）分离出总RNA，并使用转录器第一链cDNA合成试剂盒（ROCHE）进行cDNA。使用序列检测系统（CFX; Bio-Rad Laboratories）一式三份进行实时PCR。实时PCR（RT-PCR）中使用的引物如下： Golph2 （前进，5'-aactccagacgcgcattgtag-3';反向，5'-gcctgtggtgtgatgtttattcact-3'）， IL-12P35. （前进，5'-CCC-TTGCCCTCCTAACCAC-3'; REVERSE，5'-TAGTAGCCAGGCAACTCTCG-3'）， IL-12P40 （前进，5'-ggaagcacggcagcagaataaat-3';反向，5'-aacttgagggagaagtaggaatgg-3'）， TNFα.. （前进，5'-caaagtcaaatcctaccaaagtgacc-3';反向，5'-tgctactccgagcgtcaaagacc-3'）， Arg1 （前进，5'-ccagaagaatggaagagtcagtgt-3';反向，5'-gcagatatgcaggggagtcacc-3'）， Fizz1 （前进，5'-ggtcccagtgcatatggatgagactaga-3';反向，5'-cacctcttcactcgggggggacagttggcagc-3'）， Ym-1 （前进，5'-tcacaggtctggcaatttttctg-3';反向，5'-tttgtccttaggaggggcttcctcg-3'）， 如果它1 （前进，5'-ctgagatgtcacttcacatggaa-3';反向：5'-gtgcatccccaatggggttct-3'）， 如果它2 （前进，5'-agtacaacgagtaaggagtcact-3';反向：5'-aggccagtatgttgcacatgg-3'）。 如果它3 （前进，5'-AGTGAGGTCAACCGGGAATCT-3';反向，5'-TCTAGGTGCTTTATGTAGGCCA-3'），IDO（前进，5'-GGCTAGAAATCTGCCTGTGC-3'; REVERSE，5'-AGAGCTCGCAGTAGGGAACA-3'）， Cxcl10 （前进，5'-ccaagtgctgccgtcatttc-3';反向，5'-ggctcgcagggatgatttcaa-3'）， IFNβ. （前进，5'-cagctccaagaaaggacgaac-3';反向，5'-ggcagtgtaactcttctgcat-3'）， Irf1 （前进，5'-GCAAAACAAGAGGAAGCTG-3';反向，5'-GCTGCCCACTCAGACTGTTCA-3'）， HPRT. （前进，5'-ttatggacaggactgaaagac-3';反向，5'-GCTTTTTAATGTAATCCAGGGT-3'）， GAPDH. （前进，5'-gtcaa cggatttggtgtgtgtggtgtgtgtgtgtgtgtggtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtcgtgtgtgtcgtcgtgtcgtgtud，5'-gatctcgctcctggaagatgg-3'）。
转染和荧光素酶测定
如前所述进行Raw264.7细胞的转染（24）。通常，Raw264.7细胞与IL-12P35或IL-12P40启动子 - 荧光素酶报告器与GOLPH2的表达载体一起瞬时转染，然后由鼠IFN-γ（10ng / ml）刺激16小时，然后是LPS （1μg/ ml）所示的量时间。用空向量转染对照。测量β-半乳糖苷酶活性进行标准化。
Western印迹分析
用补充有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液裂解细胞裂解物。将样品用于蛋白质印迹，含有ABS对抗GOLPH2（AB109628,1：1000; ABCAM）和β-肌动蛋白（SC-47778,1：1000; Santa Cruz Biotechnology）。用奥德赛荧光检测系统（Li-Cor Biosciences，Lincoln，Ne）测量信号强度。
免疫沉淀和免疫印迹
简而言之，核提取物与AB抵抗GC结合蛋白（GC-BP）孵育（25）和琼脂糖缀合物过夜，洗涤后收集免疫沉淀的复合物，然后用AB对抗P-Tyr（Py99）（SC-7020,1：500; Santa Cruz Biotechnology）。
染色质免疫沉淀法测定
染色质免疫沉淀（芯片）通过使用制造商的说明书（Merck Millipore）之后的测定试剂盒进行，具有1×107 每个条件的BMDMS。在PCR之前将输入DNA稀释100次。通过PCR与小鼠IL-12 P35启动子的引物对扩增输入和沉淀剂DNA。使用以下引物：前进，5'-cgatcgacgcacttgtcctt-3';反向，5'-AggTgattgaca CatGCTG-3'。
质谱分析
从休息和在没有FBS的情况下培养的细胞上清液和在没有FBS的情况下培养的LPS刺激的拉莫氏细胞均为2E2的培养30分钟，然后胰蛋白酶处理（50ng / ml）30分钟，通过SDS-PAGE凝胶分馏和银染色。从洛克菲勒大学的蛋白质组学资源中心，通过质谱分析来自休息和LPS刺激的拉莫氏菌细胞的箭头尖带。
RNA测序和数据分析
从制造商的协议之后使用Illumina Truseq Srand特异性mRNA样品制备系统，使用GOLPH2 KO和WT小鼠分离的GMDC的总RNA用于图书馆施工。对Illumina Hiseq 2000进行了高通量测序>每个样本的3900万配对读数。使用TOPHAT（V2.0.9）（v2.0.9）将读取与MM10组装（国家生物技术信息集合数据库）对齐（26）。使用FASTQC（V0.10.1）和RSEQC检查原始测序读取的质量（27）。基因读数的计数由HTSEQ（V0.6.0）计算（28）。通过Degseq（V1.24.0）分析差异表达的基因（DEG）（29）在带有截止的软件中 p ≤0.001，假发现率（FDR）≤0.1％，折叠变化≥1.5，为进一步的路径分析。
途径和生物功能浓缩分析
使用David进行Degs的功能分析进行基因本体学（30）分析和熟练途径分析（IPA）（31）对于孤立的典型途径富集。使用切断选择基因本体学分析中的富集的生物过程条款 p < 0.05 and FDR <25％，由条形图显示。富集的术语与聪明的规范途径（p < 0.05, FDR < 0.05, and z-score≥1.5）由条形图显示。
LPS引起的化粪池休克模型
LPS诱导的冲击模型由I.P建立。将LPS（011：B4,25mg / kg）注入8周龄古代古代ko和wt雌性小鼠。每12小时记录小鼠存活。
统计分析
一个双尾学生 t 测试用于数据分析。一个 p value <0.05被认为是显着的。通过Kaplan-Meier曲线和日志秩（Mantel-Cox）测试分析生存数据。
结果
识别新的IL-12–inhibiting activity secreted by B cells as GOLPH2
来自Ag-Immunated的DCS，B缺陷小鼠比来自WT动物的DCS产生更高水平的IL-12P70，导致朝向TH1（32），暗示B细胞在抑制IL-12的产生方面发挥作用。为了了解B细胞对DCS影响其影响的分子机制，我们研究了霉菌DC慢性淋巴细胞白血病（CLL）慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的外周B细胞的影响。如图所示 图。1A，LPS刺激的DCS产生了稳健的IL-12和IL-10。添加来自CLL患者的B细胞导致IL-12P40和P70的强抑制，但不是TNF-α，IL-6和TGF-β（数据未示出）。此外，将B细胞与DC分离的rosswell分离表明该IL-12抑制活性被B细胞分泌为可溶性因子。因此，我们将其分泌IL-12抑制剂（SIL12-I）。进一步了解SIL12-I在转录层面的监管机制，我们使用了良好的 IL12 Ploteer-Reporter基因系统（33, 34）。人类 IL12P35. 将与萤火虫荧光素酶报告者连接的启动子瞬时转染到Raw264.7细胞中，加入来自各种类型的B细胞的培养上清液。 图。1B 表明，在LPS激活后测试的恶性B细胞系含有SIL12-I样活性。其中一些（例如2E2）能够构成它。然而，在Jurkat细胞的上清液中未发现Sil12-I样活性，是T细胞白血病细胞系。初级小鼠脾脏B淋巴细胞，类似于其人对应物，获得高效的SIL12-I活性以抑制 IL12P35. 仅在LPS激活时转录（图1C.）。此外，Sil12-i能够抑制两者 IL12P35. 和 p40 转录活动，尽管是不同程度的，即它抑制了 p35 比...更强烈 p40 (图。1D）。
图1。
识别新的IL-12–inhibiting activity secreted by B cells as GOLPH2. (A）纯化的CD14+ 来自CLL患者的PBMC的单核细胞用GM-CSF和IL-4培养6天，分化为髓体DCS（MDC）。通过抗CD19珠粒纯化B细胞。 MDCS（0.3×106) and B cells were cocultured or separated in a Boyden chamber device (Transwell) with B cells in the upper chamber and mDCs in the lower chamber, in ratios of DCs/B cells of 1:2 (2×) or 1:3 (3×），在存在或不存在LPS的情况下为48小时（1μg/ml) in both chambers. Cell-free culture supernatants were analyzed for cytokines by ELISA. LPS-stimulated B cells or CLL did not produce any detectable IL-12p40, p70, and IL-10 (data not shown). Data represent summary of three donors each with SD. (B）从瞬时转染的RAW264.7细胞上刺激的2E2和正常原发性B细胞中的刺激Jurkat细胞的上清液。 IL12P35. 记者。在如所示适当刺激Raw264.7细胞后，测量荧光素酶活性。 （C）与IL-12P35荧光素酶测定中的2E2上清液将用LPS刺激的磁性珠粒纯化的小鼠脾脏B淋巴细胞的上清液。 （D) The human IL-12 p35 promoter and the p40 promoter linked to the firefly luciferase reporter gene were transiently transfected into RAW264.7 cells. Cells were treated with IFN-γ和7小时的LPS，没有培养上清液，从静置初级人B细胞或LPS刺激的B细胞7小时。测量荧光素酶活性。结果显示为平均值± SD of three individual experiments. (E）纯化的小鼠CD4+ T细胞镀以1×106 cells per well in 1 ml and stimulated with Con A at 5 μ在MDCs的存在或不存在培养上清液中，G / ml 24小时（500μl）。用Sil12-I（1mL 2E2上清液）和/或LPS培养MDC（1μg / ml）或不为6小时。 IFN-γ production was measured by ELISA. Data are from one of two independent experiments each with triplicate wells. (F）通过SDS-PAGE凝胶和银染色分级，通过SDS-PAGE凝胶和银染色来分级从静息和LPS刺激的Ramos细胞，然后切除来自休息和LPS刺激的Ramos细胞的箭头带，并通过洛克菲勒的质谱分析大学。实验进行两次，结果是相似的。 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 by Student t test.
IL-12的主要作用之一是通过活化的T细胞诱导IFN-γ产生（35）。接下来我们评估SIL12-I是否能够影响T细胞产生IL-12的IFN-γ的能力。如图所示 图1E.，休息的鼠脾脏T细胞分泌低水平的IFN-γ（柱2），当加入LPS刺激的直流上清液（B）时被提升（塔7），表明DCS产生了增强T细胞生产的可溶因子IFN-γ。当SIL12-I处理的时，将LPS刺激的直流上清液（D）加入到静止的T细胞（塔9）中，IFN-γ分泌降低至DC制作的IFN-γ（柱4）的分泌。将LPS刺激的直流上清液（B）添加到CON激活的T细胞引起IFN-γ分泌（第12栏）的强大增压，远远超过LPS刺激的DCS（柱2）的组合产生和刺激T细胞（柱10），表明DCS产生的额外T细胞刺激因子的效果。当DCS未刺激（柱11）或LPS刺激而且也用SIL12-I（柱14）处理时不存在该因子。重要的是，将SIL12-I处理的LPS刺激的直流上清液添加到CON A刺激的T细胞仅将IFN-γ产生的水平降低到LPS刺激的DC和CON刺激的T细胞的组合水平（第2栏加上第10栏），表明SIL12-I不会直接影响T细胞。相反，它通过影响DC产生T细胞刺激活动的能力来工作。该结论由IFN-γ生产（柱13）的水平支持，其中未刺激但SIL12-I-PREACED DC上清液不抑制CON刺激的T细胞（柱10）的基线IFN-γ产生。统称，这些数据表明Sil12-i可以抑制 IL12 基因转录和IL-12诱导的IFN-γ通过活性T细胞产生。随后，通过辅助质谱分析的生物化学和蛋白质组学方法的组合，我们鉴定了SIL12-I的主要成分，从LPS刺激的拉莫斯和未刺激的2E2作为GOLPH2（图。1F.）。
GOLPH2是具有多种功能的II型Golgi跨膜蛋白。内体贩运通常的膜结合的GOLPH2导致其分泌到血液中，使其成为几种癌症的潜在生物标志物，包括HCC（ 36）， 前列腺癌 （37）， 和别的。 GOLPH2也已经在病毒感染中进行了研究（38, 39）。然而，GOLPH2如何运作和正常和疾病环境中调节的机制仍然很大程度上是未知的。
通过GOLPH2选择抑制IL-12基因转录
为了确定GOLPH2是否能够抑制IL-12生产，我们用RGOLPH2和IFN-γ和LPS处理BMDM，并通过RT-PCR分析细胞因子mRNA水平。如图所示 图2A，RGOLPH2抑制IFN-γ/ LPS刺激的mRNA水平 IL-12P35. 和 p40，但不是那些 TNFα. 或者 IL-10。此外，在RAW264.7细胞中转染 IL-12P35. 与萤火虫荧光素酶报告基因相关的启动子，RGOLP2抑制 IL-12P35. 以剂量依赖的方式转录（图。2B）。类似地，Raw264.7细胞的结果转染 IL-12P35. 或者 p40 促进者加上表达戈尔福的载体或控制也证实了这一结论（图2C.）。批判性地，使用GOLPH2阻断AB明确证明了细胞外凝胶2的基本度在抑制中 IL-12P35. 转录，因为AB大部分逆转2E2上清液中的SIL12-I抑制（图2D）。抗GOLPH2 AB的特异性通过Western Blot确认（补充图1B）。在我们观察到GOLPH2抑制IL-12表达的能力之后，我们接下来试图确定GOLPH2如何调节 IL-12P35. 通过顺序删除特定段和元素的策略转录 IL-12P35. 启动子，随后将这些构建体的瞬时转染成Raw264.7细胞。意外地，这种方法揭示了Golph2的 IL12P35. 转录抑制作用不依赖于临界NF-κB元素的存在 IL12P35. 启动子（数据未显示）。令人惊讶的是，先前鉴定的启动子元素命名为凋亡细胞（AC）响应元素（ACRE），即位于+13和+19之间的序列5'-TGCGCG-3' IL-12P35. 促进剂的转录起始位点，似乎介导GOLPH2的抑制，因为它的突变缺失导致抑制作用的总丧失（图2E.）。如前所述，在通过巨噬细胞的ACs吞噬作用症期间，通过对AC的表面的外化磷脂酰丝氨酸激活一种新的信号通路，导致酪氨酸磷酸化和吞噬细胞，GC-BP中的新型核锌指蛋白的激活直接绑定到 IL-12P35. AGRE的启动子，阻止转录（25）。如图所示 图2f.，RGOLPH2，类似于ACS，由标志酪氨酸磷酸化有效地活化GC-BP。为了进一步验证GC-BP在GOLPH2在调节方面的作用 IL12 转录，我们在BMDMS中进行了芯片测定。如图所示 图2G，通过RGOLPH2处理增强了GC-BP结合活性。连同，这些结果表明了戈尔福2抑制 IL12 转录和此活动通过英亩介导 IL-12P35. 涉及激活GC-BP的结合活性的启动子。
图2。
抑制 Il12 trobrph2的rasscription。 （A) BMDMs were treated with IFN-γ（20ng / ml，i）16小时或没有rgolph2（2μG / ml，RG），然后加入4小时的LPS（100ng / ml，L）。收集细胞以通过RT-PCR为指定的细胞因子基因进行mRNA分析。结果显示为平均值± SD of three individual experiments. (B）Raw264.7细胞与人转染 IL-12P35.-luc were stimulated with IFN-γrgolph2在表明浓度为16小时，然后进行LPS处理7小时。从细胞裂解物测量荧光素酶活性。结果显示为平均值± SD of three individual experiments. E, effector; R, reporter. (C）Raw264.7细胞与人类分类 IL-12P35.-luc或 p40-luc and GOLPH2 overexpressing vector or controls were stimulated with IFN-γ16小时，其次是LPS治疗7小时。从细胞裂解物测量荧光素酶活性。结果显示为平均值± SD of three individual experiments. (D）将2E2上清液加入到转染的Raw264.7细胞中 IL-12P35. 启动子与抗GOLPH2 AB或控制IgG一起。如上所述测量荧光素酶测定。 （E）WT，3'删除和三种特定的基础替代突变体构建体 IL12P35. 将启动子记者转染到Raw264.7细胞中，用RGOLPH2与LPS刺激以7小时后与RGOLPH2进行聚集，并为荧光素酶活性测量收获细胞。数据代表三个独立实验。 （F) BMDMs were stimulated with IFN-γ和/或LPS或暴露于凋亡Jurkat细胞（AC）或RGOLPH2。核提取物用抗体免疫沉淀–GC-BP AB随后用AB对抗P-TYR（PY99）。 ACS是通过用Staurosporine治疗Jurkat细胞产生的（5μg/ml). The experiments were repeated twice with similar results. (G）用IFN-γ和LPS或RGOLPH2处理BMDM。收集细胞并分析GC-BP的结合能力 IL-12P35. 芯片测定的启动子区域。通过类似的结果重复实验两次。 *p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 by Student t 测试。 I, IFN-γ; L，LPS; RG，RGOLPH2。
IL-12 GOLPH2在体内的抑制作用
为了进一步探索GOLPH2的物理和病理作用，我们通过靶向基因的外显子4（图3A, 3B）。 RT-PCR分析证实了纯合含氟小鼠的成功产生（图3C., 3D）。 GOLPH2 KO小鼠出生时似乎是正常的，体重和一般行为，并且它们在免疫细胞发育中没有表现出明显的异常（图3E.）。我们得出结论，GOLPH2对小鼠的稳态生理活性不是必需的。对WT小鼠的GOLPH2 mRNA水平的广泛分析表明，其在稳态的表达最多在上皮起源组织中，例如肠，胃和结肠（补充图1A）。
图3。
GOLPH2缺陷小鼠的生成和表征。 （A使用TALEN技术靶向的GOLPH2基因的示意图。 （B）通过WT，KO和杂合（HET）小鼠的PCR分析基因分型。 （C 和 D）进行RT-PCRS以测量 Golph2 指定组织和细胞类型中的mRNA水平。结果显示为三种单独实验的平均值±SD。 （E）年龄和性别匹配的WT和GOLPH2 KO小鼠（n = 4）在肝素/ EDTA涂层管中收集总血液。通过血液学分析仪分析样品。 ***p < 0.001 by Student t test.
为了进一步评估GOLPH2在原发性细胞和小鼠中的IL-12产生调节中的作用，我们通过RT-PCR和ELISA分析了来自WT和GOLPH2 KO小鼠IFN-γ/ LPS刺激的BMDMS中的细胞因子表达。结果表明，GOLPH2 KO BMDMS具有较高水平的IL-12P35和P40，但不是IL-10或TNF-α（图4A, 4B）。同时，我们还分析了一些众所周知的IFN依赖性基因的表达。 Cxcl10 和 IFNβ.. mRNA水平在GOLPH2 KO BMDMS中下调，但不是 Irf1 (图4C.）。为了评估GOLPH2在体内的作用，我们将LPS注射到WT和GOLPH2 KO小鼠中，发现与WT对照相比，KO小鼠中的血清IL-12水平但不是IL-10或TNF-α的水平（图4D），与体外数据一致。 GOLPH2抑制IL-12表达的能力表明GOLPH2可以是重要的炎症调制器。为了测试这一观点，我们将成人古代毒蕈2 KO小鼠的存活率与LPS引起的化粪池震动模型进行了比较。 图4E. 表明GOLPH2 KO小鼠显着易于脓毒症诱导的死亡。
图4。
通过GOLPH2抑制IL-12产生的IL-12产生和体内。来自WT和GOLPH2 KO小鼠的BMDMS用IFN刺激γ for 16 h, followed by LPS for 3 or 6 h (A） 或者 （B）12小时。通过RT-PCR或ELISA检测细胞因子表达。数据来自三种独立实验中的一个，每个实验中有三份孔。 （ C）BMDMS如（a）和 Cxcl10, Irf1， 和 IFNβ.L通过RT-PCR检测到evels。数据来自三个独立实验中的一个。 （D）wt和golph2 ko小鼠（n = 4）是i.p.注射LPS（10mg / kg）。三个小时后，通过ELISA收集血清进行细胞因子分析。数据来自三个独立实验中的一个。 （E）WT和GOLPH2 KO小鼠（8周龄）是I.P.注射LPS（25mg / kg体重）并记录存活。数据来自三个独立实验中的一个。 *p < 0.05, **p < 0.01 by Student t test.
GOLPH2调节巨噬细胞极化
累积证据表明巨噬细胞极化在生理和病理过程中起着至关重要的作用。在M1和M2谱中存在巨噬细胞子集，其中M1细胞定义为“经典活化的”巨噬细胞，其在主要由TLR和IFN信号传导中主要支配的炎性设置中产生，而M2细胞被定义为“可选地激活”巨噬细胞，而抗辩生物炎症设置由TH2响应主导（40）。一旦我们将GOLPH2确定为调节器 IL12 基因转录在体外和体内，我们想知道戈尔菲尔2还参与巨噬细胞极化。为了解决这个问题，首先通过M1和M2刺激分析了BMDMS，腹膜巨噬细胞（PMS）和RAW264.7细胞中的GOLPH2的表达。如图所示 图5A，原型M1刺激LPS降低 Golph2 BMDMS和原始细胞中的mRNA水平，而M2刺激IL-4和IL-13增加 Golph2 在所有三种类型的巨噬细胞中的表达。为了进一步探讨GOLPH2在巨噬细胞极化中的作用，我们进行了丢失和职能效益。对于函数丧失模型，我们刺激了来自WT和GOLPH2 KO小鼠的BMDM和PMS，具有IL-4，观察到的M2巨噬细胞标志的表达降低，即Aginase 1（Arg1），炎症区1（Fizz1）， 和 Ym1 在golph2缺陷的细胞（图5B., 5C）。相反，BMDMS在BMDMS中的过度表达增强了IL-4介导的诱导 Arg1 和 Ym1 mRNAs (图5D）。总的来说，这些数据表明GOLPH2在巨噬细胞极化中起着重要作用。
图5。
GOLPH2调节巨噬细胞极化。 （A）用LPS（100ng / ml）或IL-4（20ng / ml）或IL-13（20ng / ml）刺激从C57BL / 6小鼠或Raw264.7细胞中分离的BMDM和PMS 24小时。这 Golph2 通过RT-PCR测定mRNA表达。 （B 和 C）来自WT和GOLPH2 KO小鼠的BMDM和PMS用IL-4（20ng / ml）刺激24小时。这 Fizz1, Ym-1， 和 Arg-1 通过RT-PCR测定mRNA表达。 （D）BMDMS感染PLVX-EF1α（CON）或PLVX-EF1α-GOLPH2（GOLPH2）病毒48小时。用IL-4（20ng / ml）刺激这些细胞24小时。这 Fizz1, Ym-1， 和 Golph2 通过RT-PCR分析mRNA水平。数据来自三个独立实验中的一个，具有类似的结果。 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 by Student t test.
通过GOLPH2改变DCS中的转录程序
为了进一步以全面的方式探讨DCS中GOLPH2在DCS中的免疫功能，我们通过RNA测序（RNA-SEQ）在来自WT和GOLPH2 KO小鼠的活性IFN-γ/ LPS处理的BMDC中进行全局基因表达分析。 DEG的数量显示在 补充图2A 通过含有IFN刺激基因的一些含量的选择性RT-PCR分析来证实RNA-SEQ的可靠性，例如 如果它2, 如果它3, and Ido1 (补充图2b）。如火山图中所示 图6A，刺激的GOLPH2 KO细胞中鉴定出160℃，包括下调和58个上调基因的102。对这些舞台的IPA分析（图6B.）显示GOLPH2可以参与介导肝纤维化/肝星状细胞活化，针对细菌和病毒，DC成熟和其他重要的生物学过程的宿主防御中的模式识别受体。这些数据的进一步深入分析与实验验证相结合，将对GOLPH2在调节炎症，巨噬细胞极化和直流功能方面的作用方面提供更大的见解。
图6。
基因表达谱在激活的WT和GOLPH2 KO BMDCS中。 （A) Volcano plot showing changes in gene expression induced in GOLPH2 KO BMDCs in the presence of IFN-γ和lps。所有基因或在GOLPH2 KO BMDC中的所有基因或DEG - γ and LPS stimulation are marked in gray or pink, respectively. A total of 160 DEGs were identified, including 58 upregulated and 102 downregulated genes (p ≤0.001，FDR≤0.1％，折叠变化≥1.5）。 DEG的区域由虚线表示。左上方显示下调的基因;右上角显示上调的基因。 （ B）对富含次数进行巧精力典型途径富集分析（IPA），富集术语的前15名（p ≤ 0.05, FDR ≤25％）作为条形图呈现。灰色表示该途径由GOLPH2 KO激活。黑色表示途径被压抑。暗灰色表示没有能够预测通路的活动模式。该比率代表途径中总基因中富集基因的比例。
讨论
在本研究中，我们将GOLPH2识别为新型监管机构 IL12 基因转录。 GOLPH2缺乏增加了IL-12在活化的巨噬细胞中产生，加剧了LPS诱导的体内败血症。机械地，细胞外的GOLPH2通过诱导GC-BP与IL-12P35启动子结合来调节IL-12调节，抑制后者的转录。此外，内源性GOLPH2也在巨噬细胞极化中起着重要作用。
Golph2，位于Golgi设备表面上的II型跨膜蛋白，自原始发现以来已经引起了相当大的关注（41）。这些研究表明，GOLPH2的升高表达与乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒感染和几种癌症如HCC，前列腺癌和肾癌（36, 37, 42）。特别是，若干研究证明，由于其比最常用的标记AFP更好的特异性和敏感性，GOLPH2可能是HCC的有价值的血清生物标志物（43）。最近，叶等人。 （44）显示GOLPH2通过激活EGFR / RTK信号传导来促进HCC细胞的生长和转移。另一项研究（45）建议在QTL处于细胞因子QTL NAA35-GOLM1 轨迹响应多种病原体显着调节IL-6产生，并且与念珠菌症的易感性有关。这些研究表明，GOLPH2可能在癌症和炎症中具有多种功能。在我们的研究中，我们发现，恶性B细胞的分泌的GOLPH2通过调节DC的活性，通过调节DC的活性来抑制来自DCS的IL-12产生并降低IFN-γ产生。我们在本研究中的数据与先前的报告一致，即Golph2过表达抑制人胃癌细胞中IL-12 P35转录和IFN-γ合成（46）。此外，我们表明GOLPH2抑制IL-12生产的能力与TGF-β，IL-10，TNF-α和PGE无关2，所有已知的IL-12合成抑制剂（数据未显示）。进一步的机械研究表明，戈尔福2抑制了至少部分通过英亩的IL-12生产，近端元件 IL-12P35. 我们组首次描述的推动者（25）并且已知涉及激活GC-BP，这是一种新型核锌指蛋白阻断 IL-12 P35 转录。然而，因为GOLPH2不是转录因子，所以仍然阐明该转录调节的进一步细节。我们分析了 Golph2 各种小鼠器官/组织和免疫细胞中的mRNA水平，包括DC和巨噬细胞。结果表明，GOLPH2在稳态的表达中最丰富的上皮起源组织，如结肠，胃，肺和前列腺，并且在DC和巨噬细胞中很少（补充图1）。我们还检查了RAW264.7细胞（小鼠巨噬细胞），并未发现未检测到的分泌的GOLPH2蛋白水平（数据未显示）。另外，来自Jurkat（T细胞系）的上清液不会抑制与B细胞的瘙痒对比中的IL-12P35转录（图。1B）。因此，DC-和巨噬细胞或T细胞衍生的细胞外戈尔氏体不太可能在IL-12调节中起显着的自分泌或旁静脉作用。
赖特等人。 （47[报道，表达C末端截短的GOLPH2转基因的小鼠与WT对照，特别是在雌性中，它们具有显着降低的存活，以及它们显着于不同程度的肾和肝疾病。但是，我们生成的golph2-null小鼠没有显示出明显的异常。截短的棘手的古代古代古代古代古代古代函数或异常函数可能强调这些小鼠的死亡率。尽管如此，需要进一步探索考虑这种不一致的必要原因。
GOLPH2 KO小鼠对LPS休克过敏，并且在体外LPS激活后，GOLPH2缺陷型巨噬细胞产生了更多的M1型炎症介质IL-12，这意味着GOLPH2可以是M1炎症反应的阻遏物。相反，GOLPH2缺陷巨噬细胞中M2基因的表达水平降低表明GOLPH2是M2偏振的正调节剂。这些结果表明，GOLPH2在巨噬细胞极化中起着重要作用。但是，GOLPH2如何调节此过程仍然不清楚。
DC.S包含异质群体的专业APC，是生产IL-12的主要免疫细胞之一。在这项研究中，我们进行了WT和GOLPH2 KO BMDS的RNA-SEQ，以综合而系统性地研究了GOLPH2的免疫功能。 LPS活化BMDCS中的DEG的IPA分析表明，GOLPH2的功能涉及到类风湿性关节炎，肝纤维化和静态状态中的巨噬细胞，肝纤维化和癌症信号中的内皮细胞的功能，而它参与了肝纤维化和对细菌的识别和激活状态的病毒。 RNA-SEQ分析中揭示的网络提供了进一步的见解，进一步了解潜伏期相关的免疫过程和相关疾病的机制。例如，我们发现IFN诱导抗病毒蛋白如 如果它2, 如果它3, Mx2， 和 ApoL9b 在活性的GOLPH2 KO BMDC中下调，表明GOLPH2可能在宿主抗病性对病毒感染中发挥积极作用。胶原蛋白的异常表达可能导致胶原蛋白疾病，其是自身免疫源性的异质炎症疾病，影响各种器官和系统，包括全身性狼疮红斑和类风湿性关节炎（48, 49）。我们发现了 col1a2, col3a1, col5a2， 和 col8a1 在休息的GOLPH2 KO细胞上上调，表明GOLPH2潜在参与这些自身免疫疾病的发病机制（补充图3）。
总之，我们报告了来自B细胞淋巴瘤培养上清液的戈尔福2的生化鉴定，并表明分泌蛋白可以通过活化的T细胞抑制DC和IL-12诱导的IFN-γ产生的IL-12产生。 GOLPH2的IL-12抑制活性部分通过涉及GC-BP磷酸化的英亩介导。此外，GOLPH2是朝向M2型巨噬细胞极化的调节剂。通过RNA-SEQ激活WT和GOLPH2缺乏DCS基因表达谱的综合分析显示了GOLPH2可能介导多种重要的生理和病理条件的方式。我们对细胞外的GOLPH2的研究有助于提高对这种新颖和有趣分子的生物学作用的科学理解，其具有诊断和预后标志物以及几种癌症中的治疗靶标，特别是病毒起源。
披露
作者没有财务利益冲突。
脚注
这项工作得到了中国自然科学基金会的支持31670913（凌晨）。
本文的在线版包含 补充材料.
本文中使用的缩写：
- AC.
- 凋亡细胞
- 英亩
- 交流响应元素
- BMDM
- 骨髓衍生的巨噬细胞
- 芯片
- 染色质免疫沉淀
- CLL.
- 慢性淋巴细胞白血病
- DC.
- 树突状细胞
- de
- 差异表达基因
- FDR.
- 假发现率
- GC-BP.
- GC结合蛋白
- GOLPH2
- 高尔基磷蛋白2
- HCC.
- 肝细胞癌
- IPA.
- 聪明的途径分析
- ko.
- 昏死
- 下午
- 腹膜巨噬细胞
- RNA-SEQ.
- RNA测序
- RT-PCR.
- 实时PCR
- SIL12-I.
- 分泌的IL-12抑制剂
- WT.
- 野生型。
- 已收到 2017年6月20日。
- 公认 2017年12月4日。
- 版权所有©2018由美国免疫学家，Inc。
