呼吸环境转移抗病毒记忆CD8 T细胞的发育

希拉里L. Shane.; 凯蒂L. riegin.; 金伯利D. Klonowski.

doi:10.4049 / Jimmunol.1701268

抽象的

我们对记忆CD8的理解⁺T细胞主要来自急性，全身感染模型。但是，内存CD8⁺由粘膜感染产生的T细胞表现出独特的性质，并且在呼吸道感染后，不保持在肺部长期。为了更好地了解感染术路线如何修改内存分化，我们比较了鼠CD8⁺T细胞应对鼻内（I.n.）或I.v产生的囊泡口炎病毒（VSV）攻击。 I.n.感染导致VSV特异性CD8的峰值扩增⁺T细胞。然而，这种数值优势在免疫应答的收缩阶段迅速丢失，导致记忆CD8⁺与I.V相比，T细胞数值缺陷。感染。有趣的是，抗病毒CD8⁺响应于i.n的T细胞。 VSV表现出偏见和持续的早期效应细胞比例（CD127^loklrg1.^lo）类似于I.N的发育计划。流感感染，旨在呼吸道感染广泛地利用不完全的内存分化计划。相应地，I.N. VSV感染导致VSV特异性CD8降低CD122表达和eOMesodermin水平⁺T细胞，进一步指示对Bona FIDE记忆的劣化过渡。这些结果可能是由于截然不同的（CD103⁺CD11B.⁺）I.N的树突细胞亚群。与i.v。 T细胞灌注环境，其表达分子调节T细胞信号和耐受性和免疫之间的平衡。因此，我们提出了不同的免疫路线调节抗病毒效应器和内存CD8的质量和数量⁺T细胞响应相同的病原体，应在CD8中考虑⁺T基于细胞的疫苗设计。

介绍

呼吸道感染，包括流感，继续成为全球发病率和死亡率的主要原因（1）。目前的流感疫苗靶向保护菌株特异性AB反应，防止病毒进入宿主细胞（2）。然而，由于靶向流感血凝素AGS的突变和演变，这些疫苗失去了效力，并且不提供长期保护免受感染的影响。小鼠模型和人类研究的证据不仅含有CD8⁺ T细胞作为病毒间隙的必要条款，但也具有与新的流感菌株的异源攻击保护（3）。迄今为止，没有开发批准的疫苗，以专门产生CD8⁺ memory T cells (T_MEM.）尽管鼻内（I.N）流感疫苗闪光灯引起更大的效应CD8⁺ T cell (T_eff.）比小鼠和人类的灭活或亚基疫苗的响应（4）。虽然CD8的贡献⁺ T_MEM. 在后一种群体中尚未全面或纵向测试疫苗疗效，小鼠的研究表明CD8⁺ T细胞应答是从单个I.N产生的。闪光剂剂量。然而，这些细胞在30天内丧失，并且不受致死异质挑战（5）。相应地，在2016年6月，疾病控制和预防的咨询委员会关于免疫惯例的咨询委员会投票表决于2016-2017流感季节不应使用，因为与灭活的流感疫苗相比缺乏保护益效果（3％与63％分别为63％）（6）。这些研究表明，CD8⁺ T_eff. 在呼吸道感染或递送过衰减的流感疫苗后产生的，也不形成或保留t_MEM. 在保护水平。

在过去的几十年中，几个实验室在CD8中有划定的途径⁺ T_MEM. 开发和定义支持鲁棒T细胞存储器长期的属性和分子。这个CD8的黄金标准⁺ 在急性病毒感染的鼠模型中定义了T细胞记忆，从而通过I.V递送感兴趣的病原体。路线（5）。但是，它越来越明显，形成的形成_MEM. 是一种动态过程，内存可能受到各种因素的影响，包括细胞因子（6），所涉及的APC的类型（7），以及AG暴露的强度和持续时间（8），所有这些都可以差异地受到病原体和曝光部位的固有性质的差异影响。实际上，我们的实验室和其他人表明，粘膜衍生的抗病毒CD8⁺ T细胞从系统性感染模型中定义的内存形成，获得性能不一致（9, 10）。例如，通过简单地改变病毒采集的路线，从I.v.到I.N.，CD8⁺ T_MEM. 不仅整体少且较少，而且那些发展的人是否与细胞因子IL-15无关（10）。相比之下，IL-15缺乏导致T_MEM. 系统性感染后衰变（10–12）。因此，作为CD8⁺ T_MEM. 生成似乎并不是一个型号适合所有场景，重要的是要了解呼吸器如何以及为什么_MEM. 程序偏离基准t_MEM. 衍生在系统性模型系统中以改善疫苗配方。

迄今为止，呼吸道感染对CD8的唯一贡献⁺ T_MEM. 潜力尚未确定，因为许多呼吸道病原体，如流感，不会在这种环境之外产生生产性感染。在这项研究中，我们使用了接种同一病毒，血管性口腔炎病毒（VSV）的差分途径，以确定呼吸环境的性质如何影响CD8⁺ T_MEM. 发展。 VSV非常适合我们的研究，作为CD8⁺ 系统I.v后的T细胞响应。感染具有很好的特征，并且产生了长期的t_MEM.。此外，与流感病毒不同，VSV通过小鼠及其天然牛宿主中的多条路线传播，包括呼吸道（13）。重要的是，我们已经表明了_MEM. 来自i.n. VSV感染数值和表型类似于抗流感CD8⁺ T_MEM. (14），验证使用此模型的使用，以评估呼吸环境如何影响t_MEM. 形成。在本文中，我们报告说，尽管肺部VSV感染导致更高的CD8⁺ T_eff. 回应早期活动，这种数值优势通过CD8的收缩阶段迅速丧失⁺ T细胞响应，导致定量减少_MEM. 水池。通过改变的编程，促进了这种损失。感染有利于T的发展_eff. 随着CD127的延迟表达和随后降低这些细胞表达eOMesodermin（eomes）和CD122的能力，作为新兴T._MEM.。巧合，即感染促进了CD11C的不同群体的积累⁺CD103⁺CD11B.⁺CCR2⁺ 在CD8 T细胞灌注期间，呼吸道中的单核细胞/树突状细胞（MODCS）在CD8 T细胞灌注中排出淋巴结（DLNS），其可以调节CD8⁺ T_MEM. 差异化。总之，我们的数据表明，在不同的免疫途径中遇到的环境足以调节抗病毒T的质量和数量 _eff. 和 CD8⁺ T_MEM. 响应于相同的病原体，应该在CD8中考虑⁺T基于细胞的疫苗设计。

材料和方法

小鼠和病毒

通过国家癌症学院计划从查尔斯河实验室（威尔明顿，MA）购买C57BL / 6鼠标，并在房子里繁殖。对于VSV感染，可感染年龄和性别匹配的小鼠10⁴ VSV-Indiana Serotype或VSV-Indiana-OVA的PFU（最初从L.Lefrançois博士获得），即I.N.在50μLPBS或i.v.通过200μlPBS的尾静脉。通过BHK细胞的生长维持和分离VSV股票，而病毒滴度由斑块测定法测定。流感病毒A / HK-X31（X31，H3N2）由S.M博士慷慨提供。 Tompkins（格鲁吉亚大学，雅典，GA）。对于流感实验，感染年龄和性别匹配的动物I.N. 10.³ PFU X31在50μLPBS中。对于呼吸道同性恋病毒（RSV）感染，小鼠是I.N.感染2×10³ rsv. A2菌株的PFU（由B博士统一提供）在50μLPBS中递送。所有动物实验均由格鲁吉亚大学的制度畜牧业和使用委员会批准。

组织准备

从组织中获得单细胞悬浮液如前所述获得（10）。简而言之，在首先用〜10mL PBS /肝素灌注肺后，从肺实质中分离细胞。切除肺部，切碎，并在37℃下与1.25mM EDTA一起温育30分钟，然后用150u / ml胶原酶（Life Technologies，Grand Island，Ny）孵育1小时。通过40微米的细胞过滤器后，将淋巴细胞重悬于44％的Percoll中，用67％的Percoll，离心并收集细胞界面。机械破坏淋巴结（LNS）和脾脏组织，然后通过细胞过滤器。使用Tris缓冲氯化铵从脾样品中耗尽红细胞。通过复古眶眼渗出或在牺牲时通过心脏穿刺来获得血液样品。通过两种连续处理从血液样品中耗尽红细胞（每次在37℃下10分钟），具有Tris缓冲氯化铵。使用Z2 Coulter粒子计数器（Beckman Coulter，Fullerton，CA）测定细胞数。对于从血液样品获得的淋巴细胞数，计数250μL血液并表示为每毫升淋巴细胞。

流式细胞仪

VSV.核蛋白（N）MHC I类（MHC I）[H-2K^b/ rgyvyqgl]四聚物和流感核蛋白（NP）MHC I [H-2D^b/ asnenmetm]从国立健康核心设施（埃默里大学，亚特兰大，GA）中获得四聚体（缀合物）。与其他表面染色一起在室温下进行染色。用于染色的ABS（克隆）包括以下：PE缀合的αCD127（A7R34），αeomes（DAN11mag）或αCD103（2E7）; FITC-缀合的αCD11B（M1 / 70）或αCD44（IM7）; percp-cy5.5-缀合的αcd8a（53-6.7），αcd19（1d3），αnk1.1（pk136），αcd3e（145-2c11），或αt-bet（ebio4b10）; PE-CY7-缀合的αCD44（IM7），αCD11C（N418），αkLRG-1（2F1），αPD-L1（MIH5），或αCD86（GLI）; vielfletfluor 450缀合的αcd8a（2.43）或αcd11c（n418）; APC缀合的αcd80（16-10a1）或αsii.n.fekl-h-2k^b （25-D1.16）; APC-EFLUOR 780-缀合的αCD62L（MEL-14）或αMHCII（M5 / 114.15.2）;和APC-EFLUOR 647-缀合的磷酸-S6核糖体蛋白（SER235 / 236）（D57.2.2e）（Cell信号传导技术，Danvers，MA）。所有其他ABS都是从eBioscience购买的，Tonbo Biosciences（San Diego，CA）或BD Biosciences（San Jose，CA）。当未使用不使用四聚体时，在4℃下，细胞染色20分钟。通过血管内染色鉴定组织血管存储器单元，其中将小鼠注射I.V。在牺牲之前，在200μLPBS中，在200μLPBS中具有3μgFITC缀合的αCD45.2（104）;分离细胞并随后染色离体。用于分析细胞内蛋白（T-BET和EOMES），固定细胞，透露使用eBioscience FIX&烫发，根据制造商的指示（埃比斯科）细胞内染色。在染色之后，将细胞固定在2％多聚甲醛中，使用BD LSR II进行流式细胞术分析，并用Facsdiva软件（BD Biosciences）获取数据。为了分拣实验，FACS在Beckman Coulter Moflo（XDP）（印第安纳波利斯，IN）上进行。对于P-S6分析，从小鼠中除去LNS和脾脏，并立即如前所述在冰冷甲醇中描述。然后在BD PUSC / WASH（SAN JOSE，CA）中洗涤细胞两次，并在室温下染色45分钟45分钟。洗涤后，将细胞重新悬浮在BD Perm / kish中，并立即进行流式细胞术分析。使用Flowjo软件9.6.2来自树星的数据进行分析。在所有分析中，首先在单细胞上留下细胞，并且在指示的情况下，然后由前散散射确定的淋巴细胞栅极。在图中，在图例中指出了随后的门控策略。

统计数据

使用GraphPad Prism版本5或6进行统计分析，使用各种图例中所示的具体分析。确定时的意义 p value was <0.05.

结果

在。感染产生更少的CD8⁺ T_MEM. 而不是i.v.尽管源自较大的效应细胞库，但感染

呼吸道感染产生CD8⁺ T_MEM. 与系统性感染相比，在数量和寿命中有限的反应（10, 14）。这被认为至少部分地到了这些表面的免疫调节水平，这限制了无意的免疫病理学。但是，与不合标准T的发展有关的机制 _MEM. 已被清楚地理解，主要是因为使用两种不同的组织覆身和炎症信号的两种不同病原体进行了不公平的比较。因此，我们试图单独修改感染途径，以解决呼吸环境如何影响发展CD8⁺ T_MEM..

首先验证感染的呼吸道途径改变了CD8的发展⁺ T_MEM.，小鼠感染了I.N.或i.v.具有亚致死剂量的VSV。该病毒通过多条路线产生复制病毒感染（15）因此提供了一种模型来比较CD8的出现⁺ T_MEM. 产生的系统性和呼吸道感染。特定AG特定的CD8⁺ 使用MHC I四聚体评估在35 d后染色（DPI）的TETRIMERS对VSV-N（N-TET ⁺ 细胞）。如前所述（10），在。 VSV的交付导致VSV N-Tet的频率较低⁺ CD8⁺ T_MEM. 与使用相同的病毒剂量（未示出的数据）与全身感染相比。此外，I.N.感染也导致数值缺陷CD8⁺ T_MEM. 在呼吸道近端（肺）和远端（脾）的位点（图。1A）。因此，在使用相同病原体的系统中，I.N.感染导致定量减少_MEM..

图1。

呼吸道感染导致定量缺乏CD8 T._MEM. 尽管更高的效应响应，但池。（A）VSV N-Tet的数量⁺ CD8 T细胞在35 dpi中评估了肺和脾脏染色，10分⁴ PFU VSV通过i.v. （黑条）或i.n. （开放式酒吧）路线。（B）小鼠被感染I.N.或i.v. 10.⁴ PFU VSV, and CD8⁺ 在血液5-9 dpi中监测T细胞应答。数据显示为N-Tet的频率⁺ CD8 T cells (n =每组3只小鼠和数据代表两个独立的实验）。（C 和 D）小鼠感染了10⁴ 通过途径的PFU VSV和淋巴细胞在所示组织中的8 dPI下评估N-TET反应性，并显示为CD8的总频率⁺ T细胞（c）或量化（d）（n =每组10只小鼠和数据代表三个独立实验）。使用双尾学生评估组之间的重要性 t test (*p ≤ 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).

CD8的大小⁺ T_MEM. 池通常与相应的效应器种群的整体大小相关（16）。鉴于肺有多个先天障碍，可以促进免疫耐受性（17）我们推测CD8⁺ T_eff. 呼吸道感染也可能抑制反应，导致观察到的T_MEM. 减少。为了测试这个假设，我们评估了CD8⁺ T_eff. 回应i.v.和我。 VSV感染。令人惊讶的是，I.N的定量缺乏衍生的n-tet⁺ CD8⁺ T_MEM. 与特定峰的CD8直接对比⁺ T细胞响应，其中I.N.派生CD8⁺ T_eff. 更加突出。在。 VSV感染产生了更大的CD8⁺ 血液中的T细胞活化，如CD44表达（数据未示出）评估和循环VSV特异性CD8的频率增加⁺ T细胞在响应峰值（~7 dpi; 图。1B）。此外，更高的AG特定的CD8⁺ T_eff. 在脾脏，肺和肺排水纵隔LN（MDLN）8 dpi中也观察到反应（图1C., 1D）。这些数据在一起表明CD8 T降低_MEM. 在i.n中观察到的响应感染与i.v.感染不仅是数值减少的结果_eff. responses.

在。派生VSV特定的CD8⁺ T细胞显示在免疫应答的收缩阶段期间对存储器的转化减少

在。 VSV感染导致加强CD8⁺ T_eff. 响应尚未定量减少内存池（Fig. 1）。这表明呼吸衍生的CD8⁺ 与其全身衍生的对应物相比，T细胞无法过渡到T_MEM. 或者没有维持。要解决这些方案的前者，我们监控了特定的CD8⁺ T细胞应对免疫应答的收缩阶段。 CD8动力学的比较⁺ I.n之间的T细胞收缩。和i.v. VSV感染的小鼠表明AG特定的CD8⁺ 在I.N的情况下发展的T细胞在收缩阶段（8-15 dpi）中，感染在所有分析的组织中更快地丧失（Fig. 2）。平均损失_eff. 在此期间为1.7倍（在MDLN中），3倍（在脾脏中），在I.N中更大3.5倍（在肺部）。与i.v。受感染的动物（图2C.）。虽然已经知道呼吸衍生的CD8⁺ T细胞不在肺部长期维持，这种损失被认为发生在感染后几个月（14）。我们的数据表明呼吸器的不稳定性_MEM. 可能不是由于简单的磨损而是更复杂，涉及受访者的编程修改⁺ T细胞在t中早些时候_eff. response.

图2。

呼吸衍生的CD8⁺ T细胞反应更快地合同，并且比源自全身感染的程度更大。（A）从感染的小鼠分离的脾淋巴细胞的代表性流程图⁴ VSV. i.n.或i.v.并处死8,12和15 dpi。情节显示以前在CD8上门控的人群⁺ 淋巴细胞。频率（B）或总细胞数（C）VSV-N-Tet⁺ CD8⁺ 从指示的问题8,12和15 dpi中分离的T细胞（n 每组5-10只小鼠和数据代表三个独立实验）。使用双尾学生评估组之间的重要性 t test (*p ≤ 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).

发育抗病毒CD8的表型特征⁺ 来自源自全身感染的呼吸道感染衍生的T细胞

促进记忆细胞开发中鉴定的关键转录因子是eomes（18）。 eomes缺陷CD8⁺ T细胞经历一次克隆膨胀，但在长期存活中有缺陷（19）。作为呼吸衍生的n-tet⁺CD8⁺ T细胞正常扩展，但开发了不合格的内存响应，我们测试了N-Tet的假设⁺ CD8⁺ T_eff. 源自呼吸道感染未能启动eOMES表达和随后的存储器单元程序。早在6 dpi，i.n.衍生的n-tet⁺CD8⁺ 从肺和脾中分离的T细胞表达较少的浓度，而不是来自全身感染的专用细胞（图3B.）。 35 dpi，eomes表达的这种缺陷加剧并减少到t的25-50％_MEM. 衍生出以下的全身感染（图3A, 3C）。这些数据表明，在t中，存储器单元编程的已知发起者相当少得多_MEMS.，在呼吸道感染后也是数值减少的。

图3。

呼吸道感染导致n-tet⁺ CD8⁺ 具有降低浓度和CD122表达的T细胞。（A）从脾35d中分离的CD8 T细胞的eomes和CD122表达的代表性流动。或者i.n. VSV感染。 eomes的频率⁺ N-tet⁺ CD8⁺ I.v之后的T细胞。（黑条）或i.n. （白条）肺部或脾脏的VSV感染通过细胞内染色在6时评估（B）和35（C）DPI（n =每组3只小鼠;数据代表三次独立的实验）。频率（D）和数字（E）CD122^你好 of N-tet⁺CD8⁺ I.v之后的T细胞。（黑条）或i.n. （白条）在35 dpi评估肺或脾脏中的VSV感染（n =每组3只小鼠;数据代表三次独立的实验）。（F）平均比例的t_厘米 (CD62L^你好，黑色），t_em.. (CD62L^lo，灰色）和t_{R M} (CD62L^lo，血管内CD45⁻，白色）肺部和t的人口_厘米 (CD62L^你好，黑色）和t_em.. (CD62L^lo在i.v之后的脾脏35 d中，灰色）。或者i.n. VSV感染被描绘。使用双尾学生评估组之间的重要性 t test (*p ≤ 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).

CD122是eomes的下游目标（20），在t的高水平表达_MEM. (12），并赋予IL-15反应性，这是维持T的必要条件_MEM. 遵循全身感染（11）。相比之下，IL-15可分配用于在呼吸道感染后的记忆（10）。因为eomes表达在n-tet上较高⁺ CD8⁺ I.v之后的T细胞。与I.N相比感染。感染，我们评估了是否是i.v.存储器单元程序负责感染路径之间的IL-15依赖性的差异。实际上，n-tet的比例⁺ CD8⁺ T_MEMS. 表达CD122之后。与I.V相比，脾脏和肺部都减少了感染。 VSV感染（图。3D）。 CD122中的这种损失^你好当CD122的总数时，细胞更加明显^你好细胞量化（图3E.）。因此，eomes和CD122表达的减少以及CD8的收缩越大⁺ T_eff. 表明I.N的早期信号感染可能会抑制CD8的过渡⁺ T_eff. 对顽固的长寿，IL-15依赖于依赖于_MEM..

我们接下来希望确定eomes和cd122在ag特定的t中的表达是否表达。_MEM. 只是由于特定T的发展差异_MEM. 由两条路线发布的子集。因此，我们评估了中调的贡献_MEM. (T_厘米; CD62L.^你好）和效应t_MEM. (T_em..; CD62L.^lo）（21）到整体t_MEM. 肺部和脾脏35 dpi与VSV交付I.N.和i.v.我们还检查了组织居民的比例_MEM. (T_{R M}; CD62L.^lo 血管内染色阴性阴性;见参考。 22）在肺中。在i.v之后在35 d. VSV感染，T_em.. 与I.N相比，肺中的28％较大的数量在肺中达到28％。感染动物，而t_厘米和 T_{R M} 在I.N之后的肺部中有更多的代表。（与i.v.）VSV感染（图3f.）。因为t._em.. 与其他T相比，表达最高水平的eomes_MEM. subsets (23），在i.v之后的肺部中更多eomes表达。 VSV（ Fig. 3）感染可能是由于组织内该群体的表示增加。但是，t_MEM. 在脾脏产生的池与感染途径无关（图3f.），而煤气和CD122表达在脾脏中全球降低_MEM. 我之后感染（Fig. 3）。在一起，这些数据表明早期的记忆单元编程和随后的T的开发 _MEM. 泳池在呼吸道VSV感染之后是明显的，前者有利于全球减少_MEM. potential.

呼吸衍生的抗病毒CD8⁺ T_eff. 不要完全过渡到内存前体细胞

在抗病毒CD8的增殖峰处⁺ T cell response, T_MEM. 可以使用IL-7受体α-链（CD127）和杀手细胞凝集素样受体G1（KLRG1）在效应细胞库中鉴定在效应细胞库中。（KLRG1）（24–26）。这些标记已在CD8中广泛使用⁺ T_MEM. 研究并可以预测哪种细胞将在收缩阶段存活，在很大程度上在全身病毒感染（25, 26）。内存前体效应细胞（MPEC）是CD127^你好klrg1.^lo 基于IL-7赋予的增强的生存，将随着时间的推移主导AG特定的CD8 T细胞池（24, 27）。这些MPEC分化为祖先克隆，称为早期效应细胞（EECS; CD127^loklrg1.^lo）。 EECS具有最大的发展可塑性，有可能发展成任何其他表型（28）但通常认为由于缺乏CD127表达，通常认为不会持续到记忆中。短效应细胞（SLEC）（CD127^loklrg1.^你好）构成大多数早期的抗病毒药CD8⁺ 在系统性感染期间的T细胞应答（26）在CD8期间，终端差异化和丢失⁺ T cell contraction (24）。因为呼吸衍生的AG特定的CD8⁺ T细胞被激活，但似乎没有表型或定量匹配其系统性地衍生的对应物（图。 1, 3）我们试图确定内存细胞分化是否停滞不前。感染，中止MPEC的发展并影响T._MEM. development.

为此，我们监测了上述效应CD8的出现和持续存在⁺ 血液中的T细胞亚群在i.n之后。和i.v.使用CD127和KLRG1标记的VSV感染。 I.v后早期感染（图4A），SLEC和EEC N-TET⁺ 当MPECS超过这些子集作为显性表型时，细胞占主导地位为〜11dpi。当该子集占上风时，这些MPEC的存活优势在50 dpi中非常明显。相比之下，n-tet⁺ T_eff. 来自i.n.感染（图4B.）与I.v相比，港口主要是持续持久性的eecs。感染。此外，MPEC不会成为主导子集，直到~15 DPI。在12 dpi的两种感染途径之间直接比较了12 dpi的两种感染途径之间的结论是，在I.N中观察到的EEC的延长频率。感染主要是为了牺牲Slecs和MPEC的代表（图4C.）。此外，效应CD8的模式⁺ 呼吸vSV感染后的T细胞分布类似于甲型感染后观察到的，在血液中持续时间观察到eecs（图4D）。

图4。

基于CD127和KLRG1表达导致呼吸道感染导致伴随效应细胞的偏孔。特定AG特定的CD8⁺ 随着时间的推移在血液中测量T细胞应答;评估群体的CD127和KLRG1的表达，并用这些标记鉴定为先前定义的效应器或存储器单元子集。在i.v之后表达的表型。（A）或i.n. （B）随着时间的推移，在12个DPI的两条路线之间比较VSV感染（ C）。（D）在感染后，血液中NP特异性记忆CD8 T细胞表型的频率随时间感染10³ PFU的流感A / HKX31（n ≥每个时间点每组3只小鼠两次）。

我们接下来想确认抗病毒T_eff. 和 developing T_MEM. 在组织中，在感染途径同样受到影响。因此，我们监测了各种T的外观和贡献的动力学_eff. 子集到整体CD8⁺ 在8,12和15 dpi的肺，脾和mdln中的t细胞库（Fig. 5）。在8个DPI，Slecs占据了I.v.衍生的n-tet⁺ CD8⁺ T细胞响应，总共占AG特定T的50％_eff. pool (图5A, 5B）。相反，在i.n.之后感染，VSV特异性CD8 T细胞的〜50％以上是在8和12dPI的所有组织中的EEC，与I.V相比的数量总计两倍。感染（图5C.）。虽然EEC在I.v中的收缩期间丢失。和我。 VSV受感染的动物（图5C.），I.N之后折叠损失更大。感染（图5D）。这些数据与I.V之后的早期出现的MPEC的出现相结合。感染，对T产生后果_MEM. 开发，因为由于CD127的表达，MPEC具有生存优势（24）。在I.N之后，EEC的增强型EEC的数量不能直接转换为MPECs。感染可以机械主义解释CD8的陡峭和持续衰落⁺ 收缩期间T细胞，导致数值减少CD8⁺ T_MEM..

图5。

呼吸道感染导致eec的增加和持续比例，影响MPEC数。（A）I.V之后的脾淋巴细胞的代表性流程图。或者i.n.用10感染⁴ PFU VSV在8,12和15 DPI。数据以前在CD8上门控⁺ 淋巴细胞，然后是VSV n-Tet⁺ cells. (Bn-tet⁺ 在I.V之后的指定组织中的反应。（顶部）或i.n. （底部）感染。栏的大小表示VSV N特定CD8的总频率⁺ T细胞，不同的阴影表示所示表型的这些细胞的比例。如所示，在给定的路线和组织之间的EECS（*），SLECS（†）和MPECS（＃）增加的频率增加的统计显着性。（C）N-Tet的总数⁺ IEC（顶部）或MPEC（底部）表型的细胞。（黑条）或i.n. （开放式条）在8,12和15 dpi的感染动物。（D）在n-tet中折叠变化⁺ EEC（顶部）和MPEC（底部）数字从I.V中的8到15 DPI计算。（黑条）和i.n. （开放条）受感染的动物（数据显示为日志₂ 和 n 每组5-10只小鼠）。数据代表三个独立实验。使用双尾学生评估组之间的重要性 t test (*p ≤ 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).

CD8⁺ T_MEM. 人口规模最终受到细胞死亡率和表型之间转化的速度。因此，我们期望通过收缩数值减少的EEC（和SLEC），由于EEC→MPEC转换，MPEC将保持数值稳定或增加。任何加速的EEC或停滞转换为MPEC会影响结果MPEC / T_MEM. 水池。有趣的是，尽管在I.v之后，MPECs的总数仍然在脾脏中仍然相对稳定，甚至通过收缩在肺部增加。 VSV感染，在I.N的所有组织中存在MPEC的数值磨损。 VSV感染，与I.V之后产生的那些MPEC相比，折叠损失增强。感染（图5C., 5D）。重要的是，在I.N之后，从肺15 dpi中回收的MPEC的数量显着降低。感染。这些数据在一起表明EEC编程中固有的缺陷导致停滞的CD127表达，这是呼吸MPEC池的存活和充分播种的必要条件。

在呼吸道感染后，多种单核细胞和树突细胞积聚在DLN中

因此，我们的数据表明，呼吸道（与系统性）感染后的早期事件可能导致不同的发育计划，最终导致数值不足的CD8⁺ T_MEM. 发展。通过在研究中使用相同的病毒（VSV），我们已经消除了特定于特定的特定模式识别受体偏压和底层不同的模式识别受体信号传导途径的事件。此外，在与t的时间坐标时未观察到AG可用性之间的差异_MEM. programming (补充图1），建议其他外在环境因素可能对修改的T负责_MEM. programming.

两个迁移CD11c种群⁺ 肺部存在树突状细胞（DCS）：CD103⁺ (CD11b⁻）和CD11b.⁺ (CD103⁻）呼吸DCS（RDC）。激活后，CD103都⁺ 和 CD11b⁺ rdcs迁移到肺部dlns（7, 29）。 CD103⁺ RDC和LN居民DCS（CD8α⁺）被认为主要参与流感感染后间接和通过交叉呈现后参与CD8 T细胞灌注，而CD11b的作用⁺ RDC在这个过程中是有争议的（30–33）。尽管如此，CD11b.⁺ RDC是炎症趋化因子的来源，因此可能影响T细胞激活和编程（34, 35）。 CD103⁺ RDC可以在激活的CD8中驱动效力函数⁺ T细胞，增加t_eff. 转录简档和迁移能力，同时从中央记忆命运转移细胞（7）。因此，我们假设呼吸CD103的优先激活⁺ rdcs之后i.n.感染可能本身可能有利于CD8 T的发展_eff.，导致延迟和不合标准的转换到存储器。

首先评估CD103⁺ 在呼吸VSV感染后激活并迁移到LNS，在3DPI的LNS中鉴定DC群体。 DC被定义为谱系 - 负（林⁻）细胞（CD3⁻, CD19⁻，nk.1.1⁻）表达CD11C和MHC II级（MHC II）（图6A）。如前所述，遵循流感感染（30），小鼠感染I.N.使用VSV Harbored High数量的CD11C⁺ DCS在其肺部DLNS（MDLN和宫颈LN [CLN]）中，具有表达CD103的这些细胞的显着比例（图6A, 6B）。有趣的是，CD103的四分之三⁺ 与其他直流群体相比，DCS共同表达CD11b并减少了MHC II的表达（表I.）。在i.v之后，未在类似的LNS中发现这些细胞。通过途径VSV感染后感染或肺部（图6C., 6G，数据未显示）。重要的是，这些细胞也被患有流感呼吸道感染后鉴定出来（图6C.）和RSV（图6C.）。形态学（细胞质/核率，肾形核）（图6D.）和表型（CCR2⁺GR1⁺MHC I.I.级^lo）这些细胞的属性（表I.），以及在I.N的LNS中的瞬态外观。 VSV感染（图6G.），建议这些细胞衍生自循环单核细胞前体（36）。从这一点开始，我们将把这些细胞称为Modcs。

图6。

呼吸道感染导致在T细胞引发位点积累不同的DC群体。（A）表示谱系的初始浇注的代表性流动样本（CD3⁻，CD19⁻，NK1.1.⁻ 基于CD11C和MHC II（左）的细胞DCS，然后是CD103（右）。（B）DCS的总数（栏高度）和CD103⁺ 从指定的组织中分离的DCs（杆的灰色部分）。星号的颜色表示I.V内相应群体之间的显着差异。和我。 VSV受感染的动物。（C）经典CD103的代表性贡献⁺CD11B.⁻和CD103⁻CD11B.⁺ RDC. and CD103⁺CD11B.⁺ 用指定病原体的CLN发布染色中的MODC。（D）Giemsa染色CD11c的细胞螺旋素图像⁺MHC I.I.⁺ 基于CD11b和CD103表达分类的细胞FACS（原始放大率×400）。（E）在I.N之后从CLN 3 D隔离的指示DC子集的代表性OVA-H2KB染色。 VSV-OVA（白色直方图）或i.n. VSV（灰色直方图）感染与荧光减去每个子集的一个控制（黑直方图）。（F）通过指定的直流亚群，OVA-H2KB的平均调节平均荧光强度。调整后的平均荧光强度计算为平均ova-h2Kb表达（Vsv-OVA），平均背景OVA-H2KB表达（VSV）减去;从三个独立实验中汇总的数据。（G）肺组织和合并的ClN和MLN与I.N的指定的DPI分离。 VSV，以及CD103的频率和总数⁺CD11B.⁺ 通过流式细胞术确定MODC。（H）Clns，Ilns和脾脏在用I.v的显示时间分离出来。（黑条）或i.n. （开放条）VSV，以及CD44中丝氨酸235和236的S6磷酸化水平^你好 CD8⁺ 通过流式细胞术测定T细胞。使用双尾学生确定意义 t 测试在I.v之间进行测试。和我。被感染的小鼠（n =每组3只小鼠，代表两个独立实验; *p ≤ 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).

查看此表：

表I. RDC.子集的表型表征

在呼吸道感染后，MODC仅存在于DLN中，与T细胞引发坐标，以及偏斜的开发T_eff.。开始破译这些Modcs如何影响CD8⁺ T_MEM. 开发，我们试图确定这些细胞是否妥协_eff.-T._MEM. 通过修改的AG演示文稿或共刺激和/或抑制进行编程。因此，我们感染动物I.N.使用VSV或VSV-OVA并测量H-2K呈现的OVA Epitope Sii.n.fekl的表面表达^b。而CD103⁺CD11B.⁻ 细胞表达了最高水平的Ag / MHC I复合物（图6E., 6F）和刺激分子B7-2（表I.），MODC表达低级别的AG（图6E.），B7-2的低水平，高水平的B7-1，以及高水平的抑制配体编程死亡配体1（PD-L1）（表I.）。激活CD8⁺ T细胞表达PD-1和CTLA-4（ 37, 38）。在B7-1 / 2表达式的上下文中，PD-1的PD-1或PDLA-4的优先信令可以通过PI3K / AKT途径来影响信号传导（39），已知调节T._MEM. 通过MTOR进行编程（40）。早期灌注（48小时），我们观察到核糖体蛋白S6（P-S6）的磷酸化增加，这将通过MAPK-（41）或MTOR依赖性途径（42, 43），特别是在I.N的呼吸DLN中。感染（图6H.），表明T的多动激活_eff. 呼吸道感染后。

总的来说，本文提出的数据表明，CD8存在普遍发育途径⁺ T_MEM. 在呼吸道感染后产生，导致EEC的延长存活，伴随着转化为MPEC。这方面的总体后果是内存池的尺寸和持久性（补充图2）。为了我们的知识，我们的数据首次证明了我第一次。感染优先募集到DLN的MODC，其表达PD-L1，并在传统的RDC上增加B7-1的水平（表I.）。该抑制表型与DLN内的快速p-S6抑制相结合，表明呼吸CD8的内在调节⁺ T细胞应答。总之，这些结果提供了为什么CD8的新兴洞察力⁺ T_MEM. 发展之后的发展。疫苗和天然呼吸道感染既不是稳健，也不是持久的感染系统模型中产生的那些。

讨论

系统性感染模型主导了CD8领域⁺ T_MEM. 发展自婴儿期以来（44）。这可能是因为能够始终生产大型，可追溯的池_MEM. 使用这条路线提供的急性病毒感染（45）。然而，通过I.v获取疫苗和最自然的传播感染。路线。因此，出现了我们用于研究CD8的系统模型⁺ T_MEM. 开发可能无法完全封装CD8的属性⁺ T_MEM. 来自生理学相关的感染途径。的确，Mueller等。（9）显示通过粘膜途径（I.n.流感感染）感染导致定性缺乏CD8⁺ T_MEM. 与通过全身途径（I.V.淋巴细胞瘤核炎病毒）相比，保护能力降低。呼吸环境如何调节这种反应在这些研究中尚不清楚，因为不同引发病毒引发的不同的炎症和细胞因子型材不能被消除为混杂度。通过在我们的研究中使用VSV感染，我们直接测试了呼吸环境对负责抗病毒CD8的发育途径的影响 ⁺ T cell development.

呼吸VSV感染重新承认抗病毒CD8的许多特征⁺ 来自天然流感感染的T细胞，包括产生强大的效应电池池但是T的频率降低_MEM. (Fig. 1）。在CD8的峰值数量之后，磨损率最明显⁺ T_eff. 在所有组织中检测到（Fig. 2），它导致我们推测呼吸道感染可能差异地进行抗病毒CD8⁺ T细胞以缺乏长期保护的方式。事实上，EECS，维持可塑性以区分MPECS或SLEC（28），在特定于AG特定的CD8内富集和选择性地维持⁺ 呼吸VSV感染后T细胞库，其中它们构成了大约三分之一的AG特异性响应的响应（图。 4., 5）。在流感感染后，还观察到持续的EEC表型（图4D），提供通过呼吸道途径感染的证据可以均匀地促进发育停顿，防止完全过渡到记忆。实际上，在i.n的持续群体持续的eecs群体。感染是以生成MPEC的代价（图4C., 4D）并与最大损失的时间相关联。 VSV特定的CD8⁺ T cells (Fig. 2）。在我们的研究之前，目前尚不清楚EEC是否保持萎缩可以转换为MPEC。我们的数据表明他们没有（图5D）;但是，这仍然是一种可能性。尽管如此，CD127的延迟外观⁺ （MPECS）呼吸道感染可能占抗病毒CD8的更大损失⁺ 收缩期间的T细胞。

限制T._MEM. 在呼吸道中，给出了鉴于呼吸道侵犯的呼吸袭击，在其寿命和有限的空间到港口累积T_MEM. 不影响组织功能。但是，减少了_MEM. 在脾脏中也观察到（图。1A, 1B），建议t_MEM. 当暴露于呼吸道途径时，在呼吸道中没有选择性地抑制开发。考虑到这一点，很有可能直接或间接地直接或间接地导致某些子集的选择性发展_MEM.。我们的数据表明这至少部分是I.N的肺部薄壁症是真实的。受感染的小鼠港口更多_{R M} 和 T_厘米 but less T_em.. 而不是i.v.感染的动物，虽然池在VSV感染后脾脏在脾脏中相当于任何一条路线（图3f.）。然而，呼吸VSV感染导致浓度的表达（以及浓度调节的IL-15受体），CD122通过脾和肺部_MEM. (Fig. 3）和MPEC（数据未显示），表明T的差异_MEM. eomes在两个感染路线之间的表达可能是细胞内在的，而不是必然的 _MEM. 子集特定。 eomes表达是与维护系统派生的CD8相关的关键因素⁺ T_MEMS.部分是因为它能够上调CD122表达（20）。因此，呼吸道病毒感染可能有利于IL-15独立的存储器细胞。有趣的，T._{R M}，在粘膜网站（如肺等粘膜网站），表达比其他T的CD122少_MEM. subsets (46）在i.n之后，较为丰富的两倍。 VSV感染。另外，T的子集_{R M} 发现从LNS孤立的小鼠被发现与IL-15信号相似（47）。虽然只有一个t的子集_MEM. 减少了CD122表达式，我们已经显示出相同的T_MEM. 从IL-15缺陷和鸡尾小鼠中分离出肺部（10）。因此，CD8⁺ 呼吸道感染后的T细胞编程可能有利于T的特定子集的发展_MEM.其中许多人将在大型经典存储器单元上提供在感染部位（可能降低寿命）的保护，这被认为是依赖于IL-15。因为IL-15在CD8中的作用⁺ T_MEM. 在口腔或阴道内感染后，生成和维护尚未得到很好的研究，这些结果可能不是呼吸环境的独家;其他粘膜免疫可能会引发类似的变化_MEM. formation.

t的差异_MEM. 呼吸道感染后的编程可能与早期活动发生的事件有关，因为VSV是一种混杂的病毒（48），最终导致简要的全身感染，即使在I.N之后。交货（49）。呼吸 - 居民CD103⁺ DCS在天真CD8的启动中尤为重要⁺ 流感感染后T细胞（30, 35）。鉴于这些DC可以影响效应细胞分化和迁移（7），我们假设这些迁移的CD103⁺ DCS还负责在I.N中观察到的改变的发育表型。感染。首先浏览，我们的数据似乎确认了这一假设，作为CD103⁺ 在I.N的呼吸道DLN中特异性富集T细胞。感染（Fig. 6）。然而，在进一步分析时，我们发现只有DLN DCS的~10％是经典的CD103⁺ RDCS，而DCS共同表达CD103和CD11b的醒目比例（〜30％），并且具有低于MHC II的表达，更低表达单核细胞衍生的CD103的表型⁺ population of DCs (50）。在i.v之后未观察到该直流表型。感染。因为许多古典组织居民CD103⁺ 在启动CD8后会死于肺部DLN⁺ T cells (36），也许这是新招聘的CD103⁺CD11B.⁺ 池开发以取代组织居民CD103⁺ DCS由于急救髓鞘。与淋巴细胞不同，淋巴细胞可以经过快速增殖，必须通过在骨髓中的造血干细胞种群的膨胀（51），这对于在许多感染模型中控制感染至关重要（52, 53）。 I.N.感染选择性或在更大的某种炎症信号中诱导，这引发髓鞘和MODC的发展。炎症细胞因子IFN-α/β和IFN-β可以刺激骨髓中造血干细胞种群的增殖（54），两者都在病毒感染后产生丰富（55–57）。仍然尚不清楚为什么在I.N之后优先募集modcs rung dln（而不是肺）。感染。一种可能性是将CCR2配体投射到DLN，选择性地招募CCR2⁺ modc. (58）。尽管如此，在那里，Modcs有可能调节CD8 T._MEM. 通过PD-1或CTLA-4接合来通过PD-L1和B7-1的高表达来传递抑制信号（表I.）。 PD-1和CTLA-4接合都可以通过直接阻塞TCR信号来导致T细胞抑制（59, 60）以及通过MTOR信令路径（39）。实际上，核糖体S6蛋白在I.v中均磷酸化。和我。 VSV感染却仅在I.N中减少。感染动物72小时在肺部DLN中发射，并与MODC到达坐标。因此，在呼吸道感染后观察到在呼吸道感染后观察到的显影术可能是由于在T细胞灌注期间通过MODC直接递送给受访者T细胞的抑制信号。未来的实验将研究髓鞘和特定免疫抑制途径在调节T的作用_MEM. development.

通过比较I.N的VSV感染。或i.v.路线，我们表明呼吸环境导致T_MEM. 这是从系统性模型中定义的原型内存发育计划倾斜，导致数值不足的记忆（补充图2）。这项工作的含义表明保护记忆CD8的诱导⁺ 应在适当的感染途径的背景下研究T细胞，作为初步途径之间的发育途径和记忆要求的要求。由于继续发展CD8越来越兴趣⁺ T基于T细胞的疫苗（特别是那些将诱导呼吸特异性反应的疫苗）（61），我们必须继续改善我们对呼吸环境如何修改t的机制的理解_MEM.。通过靶向特定的DC池或可能通过其他粘膜感染途径诱导抵抗的局部呼吸环境的微调可能是为了确保所需的T._MEM. outcome.

披露

作者没有财务利益冲突。

致谢

我们感谢Ralph Tripp博士访问LSR II，朱莉尼尔森为援助Cell Sorting的帮助，Shannon Pham博士感染RSV和DRS。 Katherine术术和戴夫玫瑰在实验中寻求帮助。

脚注

来自国家卫生研究院的补助金（AI081800和AI131093至K.D.K.）的补助金提供支持这项工作。
本文的在线版包含补充材料.
本文中使用的缩写：
Cln.
颈椎LN.
DC.
树突状细胞
dln.
排水淋巴结
DPI.
第四天
欧洲经济共同体
早期效应细胞
eomes.
eomesodermin.
在。
intranasal（ly）
klrg1.
杀手细胞凝集素样受体G1
LN.
淋巴结
mdln.
纵隔Ln.
MHC I.
MHC Class I.
MHC I.I.
MHC I.I.级
modc.
单核细胞/树突状细胞
MPEC.
记忆前体效应细胞
N
核蛋白
PD-L1
编程死亡配体1
RDC.
呼吸直流
rsv.
呼吸道合胞病毒
懒散
短效应细胞
T_厘米
中央T._MEM.
T_eff.
效应T细胞
T_em.
效应T._MEM.
T_MEM.
记忆T细胞
T_{R M}
组织居民_MEM.
VSV.
水疱性口腔炎病毒。

已收到 2017年9月5日。
公认 2018年3月24日。

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