FcεRII在人B细胞和单核细胞中的独特表达和功能

彭文明, 威廉·格罗伯, 吉塞拉·沃尔根巴赫-布鲁纳尔, 萨宾闪烁, 于春风, 马克·西尔维斯特, 让·皮埃尔·阿拉姆, 约翰尼斯·奥尔登堡, 纳塔利奥·加尔比（Natalio Garbi）, 鲁道夫·瓦伦塔（Rudolf Valenta） 和 娜塔莉娅·诺瓦克（Natalija Novak）
免疫学杂志 2017年4月15日， 198 (8) 3033-3044; DOI： //doi.org/10.4049/jimmunol.1601028
载入中

抽象的

FcεRII是一种多功能低亲和力IgER，与变应性，炎性和肿瘤性疾病的发病机理有关。尽管人们越来越多地认识到FcεRII介导的功能差异，但尚未完全理解FcεRII激活的后果。在这项研究中，我们评估了FcεRII在人血细胞上的表达，发现它主要在单核细胞和B细胞上表达。尽管IL-4促进了B细胞和单核细胞上FcεRIIb同工型的表达，但FcεRIIa同工型的表达并不依赖于IL-4。此外，FcεRII主要在B细胞而非单核细胞上结合变应原-IgE复合物。 B细胞吸收FcεRII介导的变应原-IgE复合物，使Ags进入富含MHC II类的区室。带有FcεRII的单核细胞和B细胞表达高水平的FcεRII脱氢酶，整联蛋白和金属蛋白酶10，这表明它们是可溶性FcεRII的重要来源。此外，我们发现，FcεRII的IgE免疫复合物刺激通过Syk在B细胞而非单核细胞中激活了细胞内酪氨酸磷酸化。重要的是，在变应原特异性免疫疗法的建立阶段，变应原– IgE免疫复合物介导的FcεRII信号传导增加了变应性患者B细胞中IFN-γ的产生。总之，我们的结果证明FcεRII在变态反应中介导细胞类型依赖性功能。此外，这些结果在过敏反应中发现了一种新型的过敏原-IgE复合物/FcεRII/ Syk /IFN-γ途径，表明FcεRII可能通过调节B细胞中的IFN-γ产生来调节过敏反应。

介绍

过敏性疾病影响>工业化国家人口的20％，并代表着日益严重的全球公共卫生问题（1, 2）。经典的过敏性免疫反应在很大程度上取决于IgE与IgER的相互作用（3）。 IgE与人免疫细胞上的FcεRI和FcεRII（或CD23）结合会引发并协调过敏反应（3–5）。 FcεRI介导的作用已在动物模型，人类肥大细胞，嗜碱性粒细胞，单核细胞和树突状细胞（DC）中进行了广泛研究（2, 5, 6）。相比之下，FcεRII激活的后果仍不完全清楚。

作为人B细胞，滤泡DC，单核细胞以及肠道和呼吸道上皮细胞表达的C型凝集素受体，FcεRII被认为通过调节IgE合成，过敏原跨肠和气道上皮的运输而严重参与过敏性和炎症性疾病。屏障，IgE促进的过敏原呈递和炎症反应（4, 7–11）。尽管FcεRII单体以低亲和力结合IgE，但FcεRII也能够形成以更高亲和力结合IgE的三聚体（12）。然而，FcεRII三聚体的稳定性对温度敏感，这导致FcεRII在较低温度（4–20°C）时比在较高温度（37°C）时更有效地结合IgE（13, 14）。此外，解整合素和金属蛋白酶10（ADAM10）裂解膜结合的FcεRII，并释放各种形式的可溶性FcεRII（sFcεRII）（15, 16），进一步与B细胞膜上的CD21相互作用以调节IgE的产生（17–19）。在人类中，FcεRII以两种同工型存在，即FcεRIIa和FcεRIIb，它们仅在胞质N端结构域不同。 FcεRIIa在B细胞上表达并参与IgE结合Ag的内吞作用，而FcεRIIb的表达可被IL-4在不同细胞类型上诱导表达，包括B细胞，单核细胞，DC和上皮细胞（2, 4）。 FcεRII在各种类型的免疫细胞中介导不同的信号。活化的FcεRII诱导cAMP（20），钙通量和多磷酸肌醇水解（21），并介导白血病B细胞（22），而活化的FcεRII会触发人单核细胞中NO的产生和NF-κB的活化（23, 24）。然而，尚未详细阐明FcεRII在人单核细胞和B细胞过敏反应中介导不同信号的机制。此外，与FcεRI不同，FcεRI的胞质部分包含ITAM，并在FcεRI交联后介导信号分子的磷酸化（5），FcεRIIa和FcεRIIb的胞质尾非常短，仅包含6或7个氨基酸（4）。因此，FcεRII很可能需要使用衔接子来介导细胞内信号转导事件，例如蛋白质磷酸化。

患有过敏性疾病的患者外周血FcεRII升高（25–27）。 FcεRII在变应性疾病中的功能已在人和动物模型中显示（28–30）。在人类中，过敏原患者可以通过在过敏原特异性免疫治疗过程中反复和持续暴露于过敏原所致的大量过敏原中来诱导过敏原特异性耐受（31）。因此，变应原特异性免疫疗法可以作为研究人的变应原刺激的IgER（包括FcεRII）功能的良好模型。

我们研究的目的是研究FcεRII在刺激天然配体后对人外周血细胞（如B细胞和单核细胞）的细胞类型依赖性功能。 FcεRII在受到IgE免疫复合物刺激后在B细胞和单核细胞中发挥不同的信号传导作用，酪氨酸磷酸化水平不同。蛋白质组学分析确定Syk是B细胞中FcεRII信号转导的衔接分子。此外，变应原– IgE免疫复合物通过FcεRII介导的信号传导增加了B细胞中IFN-γ的产生。我们的结果提供了重要的证据，证明FcεRII介导的细胞类型依赖性功能可能在调节过敏反应中起关键作用。

材料和方法

研究批准

在毒液免疫治疗下患有膜翅目毒液过敏的患者（n = 18; 7男11女；平均年龄50.7±12.9岁;在征得他们的知情同意后，将波恩大学皮肤病学和过敏学系的年龄范围（25-75岁）纳入研究。该方案已获得当地伦理委员会的批准，并根据国际准则进行了治疗（32–34）。

检测特异性IgE

在免疫治疗开始之前，开始之后以及术后2天和1周后，从接受膜内毒素治疗的膜翅目蛇毒过敏患者的血液样本中采集。通过Phadia 250免疫分析仪检测针对膜翅目毒变应原（Ves v 5或Api m 1）的血清特异性IgE（赛默飞世尔 科学，瑞典乌普萨拉）。

试剂种类

先前已描述了FITC偶联的桦树花粉变应原Bet v 1（Bet v 1–FITC）和嵌合Bet v 1特异性IgE（35）。 Natural Bet v 1来自室内生物技术公司（弗吉尼亚州夏洛特维尔）。人FcR阻断剂，与PE结合的小鼠抗CD19 Ab（克隆LT19），与FITC结合的小鼠抗人类CD34 Ab（克隆AC136），蛋白G MicroBeads，人CD19和CD14 MicroBeads来自Miltenyi Biotec（Bergisch Gladbach，德国）。 FITC偶联的小鼠抗人CD14 Ab（克隆RPA-T4），Allo藻蓝蛋白偶联的小鼠抗人CD14 Ab（克隆M5E2），FITC偶联的小鼠抗人CD14 Ab（克隆M5E2），FITC偶联的小鼠抗人CD4人类CD103 Ab（克隆Ber-ACT8），FITC偶联小鼠抗人类CD19 Ab（克隆HIB19），单克隆小鼠抗人类CD23 Ab（克隆M-L233），PerCP-Cy5.5偶联小鼠抗人类CD23 Ab（克隆M-L233），PE缀合的鼠抗人Syk（pY348）Ab（克隆I120-722），PE缀合的鼠抗人IL-6 Ab（克隆MQ2-6A3），PE缀合的鼠抗-人IL-10 Ab（克隆JES3-19F1）和与PE结合的小鼠抗人IFN-γAb（克隆4S.B3）来自BD Biosciences（德国海德堡）。抗GRB2的兔多克隆抗体，抗CD23的山羊多克隆抗体，抗GAPDH的小鼠单克隆抗体，抗Syk Ab的小鼠单克隆抗体（克隆4D10）和蛋白G加琼脂糖均来自圣克鲁斯生物技术公司（加利福尼亚州圣克鲁斯）。小鼠抗磷酸酪氨酸单克隆抗体（克隆4G10）来自密理博（Millipore）（德国舒瓦尔巴赫）。人嵌合IgE抗4-羟基-3-硝基苯基乙酰半抗原（NP）和NP缀合的BSA（NP-BSA）（比率>20）来自AbD Serotec（德国普赫海姆）。用于阻断FcεRII的单克隆小鼠抗人CD23 /FcεRIIAb（克隆138628）来自 R&D Systems （德国威斯巴登-诺登施塔特）。人CD23 ELISA试剂盒和单克隆小鼠抗人HLA DR + DP + DQ Ab（克隆CR3 / 43）来自Abcam（剑桥，马萨诸塞州）。 PE标记的小鼠抗人CD23 Ab（克隆EBVCS2）和PE标记的小鼠抗人FcεRIαAb（克隆AER-37）来自eBioscience（圣地亚哥，加利福尼亚）。太平洋蓝共轭标签的小鼠抗人HLA-DR Ab（克隆LN3）来自 生物传奇 （加利福尼亚州圣地亚哥）。多克隆兔抗人ADAM10 Ab来自New England Biolabs（德国法兰克福）。 FITC偶联的山羊抗小鼠抗体来自杰克逊免疫研究公司（宾夕法尼亚州，西格罗夫）。用于阻断目的的正常小鼠血清获自Dianova（德国汉堡）。蜜蜂和黄夹克毒液来自BÜHLMANN实验室（瑞士Schönenbuch）。除非另有说明，所有其他试剂均获自Sigma-Aldrich（Taufkirchen，德国）。

隔离CD14+ 和 CD19+ 人类外周血细胞

按照制造商的方案（Axis Shield，挪威奥斯陆）中的描述，通过Lymphoprep梯度分离技术从膜翅目毒液过敏患者的血液或健康供血者的血沉棕黄层（从波恩大学血库获得）中分离PBMC。 。阻断Fc受体后（货号130-059-901； Miltenyi Biotec），CD14+ 和 CD19+ 根据制造商的说明，通过针对人CD14和CD19（Miltenyi Biotec）的mAb进行免疫磁选择，从PBMC中分离出细胞。 CD14的纯度+ 和 CD19+ cells was >90％，通过流式细胞仪染色测得。将细胞在含有1％抗生素和抗真菌药以及10％灭活的FCS的极低内毒素培养基RPMI 1640（Biochrom，柏林，德国）中培养。在某些实验中，PBMC，分离的单核细胞和B细胞在含有500 U / ml rIL-4（Gentaur，亚琛，德国）的培养基中培养。

IgE免疫复合物的产生

BSA–NP–IgE免疫复合物是通过将抗NP–IgE（0.7μg/ ml）与NP-BSA（10μg/ ml）在室温下于培养基中孵育1小时而产生的。 Bet v 1–IgE免疫复合物是通过在室温下于培养基中孵育Bet v 1–FITC或天然Bet v 1（2.5μg/ ml）以及针对Bet v 1的IgE（5μg/ ml）产生的。 1小时毒液-IgE免疫复合物是通过将黄膜或蜂毒液（11.5 ng / ml）与10μl/ ml膜翅目毒液过敏患者（对rVes v 5 [30.8 kU / l]或IgE特异性的血清）孵育而产生在室温下，在培养基中针对Api m 1 [5.43 kU / l]的特异性IgE）。

流式细胞仪

如前所述进行流式细胞术（36）。对于细胞内细胞因子染色，将细胞在含有0.1％Go​​lgiPlug和GolgiStop（BD Biosciences）（BD Biosciences）的培养基中于37°C保温3小时。随后，将细胞进行流式细胞仪分析。同型匹配的小鼠或大鼠IgG被用作Ab对照。用FACSCanto（BD Biosciences）测量细胞，并通过FACSDiva（BD Biosciences）和FlowJo（TreeStar，Ashland，OR）软件进行分析。

RNA分离，反转录和TaqMan实时PCR

使用NucleoSpin RNA II或XS试剂盒（MACHEREY-NAGEL，Düren，德国）分离总RNA，包括消化基因组DNA，并根据制造商的说明使用TaqMan RT试剂与随机六聚体进行cDNA合成（Applied Biosystems （德国达姆施塔特）。 50纳克总RNA用于20 µl反应体积的逆转录。根据制造商的建议，在TaqMan基因表达预混液的帮助下，借助TaqMan基因表达预混液和预先设计的TaqMan基因表达分析法，在ABI Prism 7300序列检测系统（均来自Applied Biosystems）上进行扩增。使用了包括探针的以下引物：IL-6（Hs99999032_m1），IL-10（Hs00174086_m1），IFN-γ（Hs00989291_m1）和18s rRNA内源对照（4310893E）（Applied Biosystems）。所有测定均按照制造商的说明进行。相对定量和置信范围的计算使用比较ΔΔCT方法（37）。

逆转录PCR

为了分析人B细胞和单核细胞中FcεRIIa，FcεRIIb和ADAM10的mRNA表达，合成了引物（Microsynth，Balgach，Switzerland），并使用以下引物进行PCR，如前所述（8, 38）：ADAM10_正向：5′-TCC ACA GCC CAT TCA GCA A-3′，ADAM10_反向：5′-AGG CAC TAG GAA GAA CCA A-3′； FcεRIIa_forward：5′-ATG GAG GAA GGT CAA TAT TC-3′，FcεRIIa_reverse：5′-TCC AGC TGT TTT AGA CTC TG-3′； FcεRIIb_正向：5'-ATG AAT CCT CCA AGC CAG-3'，FcεRIIb_reverse：5'-CAC AGG AGA AGC AGA GTC AG-3'。使用以下引物，通过并行PCR测定GAPDH管家基因的244 bp片段的不同PCR中的人模板cDNA的量：GAPDH_forward：5'-CCA CAT CGC TCA GAC ACC AT-3'和GAPDH_reverse：5 '-GGC AAC AAT ATC CAC TTT ACC AGA GT-3'。将PCR产物在1.3％琼脂糖凝胶上分离，并通过溴化乙锭染色可视化。

基于SYBR Green的实时PCR分析

使用SYBR Green Supermix（Bio-Rad，慕尼黑，德国）进行了基于SYBR Green的实时PCR分析，定量测定了人单核细胞和B细胞中FcεRIIa和FcεRIIb的mRNA表达。在包含10μl2x SYBR Green Supermix，每种引物1μM和8μl10倍稀释cDNA模板的20μl反应混合物中进行测定。热循环条件如下：在95°C进行5分钟的初始变性步骤，在95°C进行15 s，54°C进行20 s和60°C进行40 s的PCR扩增35个循环，然后进行根据制造商的建议，在ABI Prism 7300序列检测系统（Applied Biosystems）上进行解链曲线分析程序。

质谱

为了鉴定活化的FcεRII的推定衔接子分子，我们用质谱（MS）进行了蛋白质组学分析。简而言之，将来自血沉棕黄层的新鲜分离的人PBMC悬浮在含有2％FCS的RPMI 1640培养基中，并在细胞培养瓶中培养（每75厘米20毫升细胞悬浮液2 烧瓶）在37°C下1小时。孵育后，将贴壁细胞用冰冷的PBS洗涤两次，并在37°C，5％CO的含500 U / ml IL-4的培养基中培养2 孵育2天以增加表面FcεRII表达。培养2天后，收集细胞并用BSA-NP-IgE免疫复合物在37°C刺激1小时。用冰冷的PBS冲洗两次后，约80×106 将细胞在冰冷的裂解缓冲液（含1 mM PMSF，5μg/ ml抑肽酶和5μg/ ml亮肽素的PBS中的1％Triton X-100）中裂解几次，方法是将25细胞针头连接25 -ml注射器。在冰上提取15分钟后，通过离心除去不溶物，并收集上清液。通过与2μg/ ml小鼠IgG同种型对照或小鼠mAb抗-FcεRII（克隆M-L233）孵育2小时，然后与G蛋白微珠在4°C旋转过夜孵育，从而免疫沉淀上清液。珠子用冷的裂解缓冲液洗涤2次，结合的蛋白用0.1 M甘氨酸（pH 2.7）洗脱。通过一维或二维SDS-PAGE电泳分离洗脱的蛋白质。使用Pierce Silver Stain Kit（Pierce Silver Stain Kit）通过银染使蛋白质可视化（ 赛默飞世尔 科学，沃尔瑟姆，马萨诸塞州。比较了由IgG同种型对照和抗FcεRIIAb沉淀的蛋白条带的银染后，将抗FcεRIIAb沉淀的蛋白条带切下并送至波恩大学生物化学与分子生物学研究所进行MS检测。使用蛋白质-蛋白质相互作用工具STRING 10（http://string-db.org/）和DAVID基因功能分类工具（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）（39）。

免疫沉淀和免疫印迹

为了检测活化后与FcεRII结合的细胞信号转导衔接子，对FcεRII复合物进行免疫沉淀，通过SDS-PAGE分离，并转移至聚偏二氟乙烯膜（Millipore，Billerica，MA）。在室温下，用含0.1％Tween 20的TBS（20 mM Tris [pH 7.5]和0.15 M NaCl）中的5％脱脂牛奶封闭印迹1小时，并在4°C下与1：1000稀释的一级抗体孵育过夜，然后1：2000稀释的HRP偶联的次级抗体（Santa Cruz Biotechnology）。使用ECL蛋白质印迹检测系统（Amersham Biosciences，弗莱堡，德国）检测蛋白质。

免疫荧光染色

如其他地方所述进行免疫荧光染色（40）。使用共焦激光扫描显微镜（Leica TCS SP8）使用Leica LAS AF软件（均来自德国Wetzlar的Leica Mikrosysteme Vertrieb）和ImageJ软件（美国国立卫生研究院）对载玻片进行分析和记录。

统计分析

使用GraphPad Prism 5（GraphPad，La Jolla，CA）或Windows的SPSS 22（SPSS，Chicago，IL）进行统计分析。使用Shapiro-Wilk正态检验检验数据分布。正态分布数据显示为平均值±SEM。非正态分布数据显示为中位数±四分位间距。使用单向重复测量方差分析（Tukey多重比较测试）或配对的学生对组之间的定量值进行比较 t 测试正态分布的数据。 Wilcoxon配对对检验用于分析非正态分布的数据。使用的统计检验和 p 值在每个图例中指示。任何 p 值是双向的，并且全球重要性水平为5％。

结果

B细胞是人外周血中主要的FcεRII表达细胞

我们发现，绝大多数表达人FcεRII的外周细胞不表达FcεRI（图1A）。为了评估FcεRII在各种类型的人白细胞中的表达，将人类外周血细胞用Abs进行了抗谱系标记的双重染色，例如CD1c（DCs），CD4和CD8（T细胞），CD14（单核细胞），CD34和CD103（干细胞）和CD19（B细胞），以及抗FcεRII的抗体。流式细胞仪结果表明，人CD14+ monocytes and CD19+ B细胞表达FcεRII（图1B）。 CD19的百分比和数量+ 表达FcεRII的B细胞比表达FcεRII的CD14高约20倍和10倍+ monocytes (图1C）。虽然CD1c很少+CD19− 髓系DC表达FcεRII，FcεRII总数+ 与单核细胞和B细胞相比，外周血中的DC可以忽略不计（图1B, 1C）。

图1。
图1。

Fc的表达εRII on human peripheral blood cells. (A）FcεRI和FcεRII在人外周血细胞上的不同表达。 （BFcεRII在CD4上的表达+, CD8+, CD14+, CD34+，CD103+, CD19−CD1c+和CD19+ cells. (CFcεRII的数量+ DCs (n = 4个供体），单核细胞（n = 8个供体）和B细胞（n =每100,000个细胞8个供体。在（A）和（B）中，一项具有代表性的实验 n = 3 is shown.

FcεRIIa和FcεRIIb由人单核细胞和B细胞差异表达

接下来，我们比较了FcεRII在人单核细胞和B细胞上的组成型表达以及在被IL-4激活后（已知诱导FcεRII表达）的表达谱（4）。评估了IL-4刺激后0、24和48小时FcεRII在单核细胞和B细胞上的表面表达。我们显示B细胞组成性表达FcεRII（ 图2A）。尽管IL-4诱导单核细胞和B细胞上FcεRII的表达，但与IL-4孵育后，人单核细胞表达的FcεRII的水平明显高于B细胞（图2B）。

图2。
图2。

IL-4诱导不同的FcεRIIa and FcεRIIb expression in human monocytes and B cells. (A) Freshly isolated human PBMCs were cultured in medium containing IL-4. At 0, 24, and 48 h, PBMCs were collected and stained with the Ab mixture anti-CD14/anti-CD19/isotype-matched IgG or anti-CD14/anti-CD19/anti-FcεRII。 Fc的一项代表性实验εRII expression on monocytes and B cells is shown (n = 8 donors). (B）单核细胞和B细胞上FcεRII表达的平均值显示为散点图（n = 8个捐献者，平均值±SEM） p 使用成对的学生计算值 t 测试。 (C) Freshly isolated monocytes and B cells from the same blood donor were cultured in medium containing IL-4. At 0 and 24 h, cells were collected and subjected to RT-PCR. Amplified PCR products of FcεRIIa, FcεIL-4的RIIb和GAPDH–stimulated monocytes and B cells at 0 and 24 h. (D) Quantitative SYBR Green–IL-4的cDNA为基础的实时PCR–在0和24 h刺激B细胞和单核细胞，以分析Fc的表达水平εRIIa and FcεRIIb. GAPDH was used as internal control. Fold change in mRNA expression over the expression of target gene in B cells at the time point 0 h is shown (n = 4个供体，平均值±SEM）。

为了进一步研究FcεRII同工型在人单核细胞和B细胞上的表达，在IL-4刺激之前和之后收集单核细胞和B细胞，并进行FcεRIIa和FcεRIIbPCR分析。 B细胞组成性表达FcεRIIa亚型（图2C）。基于SYBR Green的定量实时PCR结果表明，IL-4不会增加人B细胞上FcεRIIa的表达（图2D）。但是，新鲜分离的人单核细胞和B细胞微弱表达FcεRIIbmRNA，在两种细胞类型中，IL-4刺激均可进一步增加FcεRIIbmRNA（图2C, 2D）。

B cells predominantly bind 通过Fc的IgE免疫复合物εRII

为了研究其天然配体与人B细胞和单核细胞上FcεRII的结合，我们将IL-4–与Bet v 1–FITC（主要的桦树花粉过敏原）以及FITC结合的Bet v 1–IgE免疫复合物进行了孵育。刺激单核细胞和B细胞。孵育24和48小时后，单核细胞有效吸收Bet v 1和Bet v 1–IgE免疫复合物。但是，阻断FcεRII并不能减少单核细胞对Bet v 1–IgE复合物的摄取（Fig. 3）。相比之下，与Bet v 1相比，B细胞显示出更高的结合Bet v 1–IgE复合物的能力（Fig. 3）。此外，FcεRII的阻断显着降低了B细胞对Bet v 1–IgE免疫复合物的摄取（Fig. 3）。

图3。
图3。

人类B细胞结合并吸收Bet v 1–通过Fc的IgE免疫复合物εRII. (A) Monocytes and B cells from the same blood donor were cultured with Bet v 1–FITC and Bet v 1–FITC/有或没有Fc的IgE免疫复合物ε在含有IL-4的培养基中，RII受阻。 Bet v 1的一项代表性结果–FITC+ 距离0、24和48小时的单核细胞和B细胞 n = 8 is shown. (B）Bet v 1–FITC百分比的统计分析+ 在0、24和48小时的单核细胞和B细胞（n = 8 donors). *p < 0.05, Wilcoxon-test.

此外，我们使用FITC共轭葡聚糖作为Ag对照，以研究IgE免疫复合物的形成对于FcεRII介导的B细胞结合和变应原摄取是否重要。我们显示，与单独使用FITC偶联葡聚糖的FITC偶联葡聚糖和IgE预先针对Bet v 1进行预温育而制备的混合物相比，B细胞不会增加FITC偶联葡聚糖的结合和摄取。但是，B细胞仍然有效地吸收了Bet v 1–FITC / IgE免疫复合物，该复合物是通过将Bet v 1–FITC与针对Bet v 1的特异性IgE预孵育而制备的（补充图1）。

Fc捕获的过敏原复合物εRII are directed to MHC class II–rich compartments in B cells

符合先前的研究（41），我们的免疫印迹结果表明，BSA–NP–IgE免疫复合物刺激后，II类MHC（MHC-II）分子和FcεRII形成复合物（图4A）。

图4。
图4。

Fc捕获的过敏原复合物εRII针对MHC-II–rich compartments in B cells. (A）用IL-4培养2天后，用BSA-NP-IgE免疫复合物刺激人PBMC 1小时。然后，按照 材料和方法. Coimmunoprecipitation experiments were performed with cell lysates prepared in the presence of mouse monoclonal anti-FcεRII Ab。小鼠IgG用作Ab同种型对照。沉淀的蛋白质通过SDS-PAGE解析并转移至聚偏二氟乙烯膜上。使用针对HLA-DR，DP，DQ的小鼠单克隆抗体进行Western印迹。还标记了小鼠IgG L链和H链的交叉反应（左图）。检测后，将膜剥离并进行Fcε使用多克隆山羊抗Fc的RII免疫印迹εRII Ab (right panel). Results are representative of n = 3个独立实验。 （B) Triple immunofluorescence confocal laser scanning microscopy of Bet v 1, Fcε人类B细胞上的RII和MHC-II分子。白介素4–stimulated human CD19+ B cells were cultured with Bet v 1–FITC / IgE免疫复合物或Bet v 1–单独使用FITC（绿色）作为对照，在37°C持续3小时。借助PE-Cy5进行免疫荧光染色–conjugated anti-FcεRII（红色）和太平洋蓝–conjugated anti–HLA-DR（蓝色）绝对显示了三个独立实验之一（比例尺，10μm). (CBet v 1与B细胞结合的半定量荧光分析。通过共聚焦激光扫描显微镜检测随机选择的单个B细胞的FITC荧光强度。结果显示为相对荧光强度，报告为每个细胞强度与Bet v 1 – FITC结合的平均荧光强度之比。 ** p< 0.005，曼·惠特尼 U test.

为了研究变应原– IgE免疫复合物刺激后FcεRII与MHC-II分子的相互作用，我们在三重免疫荧光染色中使用了Bet v 1–FITC，以及针对MHC-II分子和FcεRII的抗体。与单独用Bet v 1刺激的B细胞相比，用Bet v 1-IgE免疫复合物刺激后，B细胞中观察到了FcεRII–MHC-II–Bet v 1结构的扩大（图4B）。此外，基于共聚焦激光扫描显微镜图像的半定量分析表明，当Bet v 1与IgE形成免疫复合物时，Bet v 1结合增加（图4C）。这些数据表明，在过敏原-IgE免疫复合物刺激后，B细胞中FcεRII与MHC-II密切相关。

IgE免疫复合物在人B细胞而非单核细胞中激活FcεRII诱导下游蛋白的酪氨酸磷酸化

酪氨酸磷酸化代表了所有真核细胞信号转导的重要机制（42）。为了研究FcεRII介导的B细胞和单核细胞信号传导，我们将BSA–NP–IgE免疫复合物与IL-4刺激的人PBMC进行了孵育。我们发现，刺激BSA-IgE免疫复合物可在表达FcεRII的B细胞中诱导强烈的胞内蛋白磷酸化，而在单核细胞中则不会（图5A）。

图5。
图5。

刺激Fcε人B细胞而非单核细胞上的RII介导磷酸酪氨酸的细胞内水平升高。将人PBMC与IL-4培养24小时以增强Fc的表达εRII. (ACD14的细胞内磷酸酪氨酸水平+FcεRII+ monocytes and CD19+FcεRII+ 具有或不具有IgE免疫复合物刺激的B细胞。 （ B) Intracellular phospho-tyrosine levels of the cells stimulated with anti–NP-IgE，NP-BSA或BSA–NP–Fc中的IgE免疫复合物或与抗NP-IgE预孵育，洗涤并与NP-BSA交联的细胞εRII+ 单核细胞和B细胞。所有结果均代表来自 n = 3 donors.

接下来，我们证实IgE免疫复合物对于FcεRII介导的B细胞下游蛋白的酪氨酸磷酸化很重要。为此，将IL-4刺激的人PBMC用抗NP–IgE，NP–BSA或BSA–NP–IgE免疫复合物进行处理，或与抗NP–IgE预孵育，洗涤并与NP交联-BSA。我们发现只有刺激BSA-IgE免疫复合物才能在表达FcεRII的B细胞中诱导强烈的细胞内蛋白酪氨酸磷酸化（图5B）。

IgE免疫复合物刺激后，人B细胞上的FcεRII使用Syk

为了研究人PBMC中FcεRII介导的信号传导，在IL-4刺激后，沉淀并结合了IgE免疫复合物激活的FcεRII的分子并用MS检测。除了我们的研究结果表明IgE免疫复合物在人B细胞中诱导强酪氨酸磷酸化外，许多分子（例如整联蛋白，MHC分子，MAPK，Syk和GRB2）也被募集到活化的FcεRII（图6A）。

图6。
图6。

Syk鉴定为Fc的重要衔接子εRII介导的人类B细胞信号。用IL-4培养PBMC 2天，以增强Fc的表达εRII. (A) After BSA–NP–IgE免疫复合物刺激，激活的Fc的成分εRII复合物用抗Fc进行免疫沉淀εRII Ab and collected for MS analysis. A network of molecules found to be associated with B cell activation and Ag presentation is shown. (B) Molecules immunoprecipitated with activated Fcε刺激BSA后人PBMC的RII–NP–IgE immune complexes. (C) Isolated monocytes and B cells were stimulated with IL-4 for 2 d, and cells were stimulated with BSA–NP–IgE免疫复合物，并进行了免疫沉淀和免疫印迹分析。用活化的Fc免疫沉淀的分子 εRII of monocytes and B cells are shown. (D用IL-4培养2天后，将人PBMC在室温下于含有2％FCS的培养基中静置1小时。然后用抗NP–IgE，NP–BSA或BSA–NP–IgE免疫复合物刺激细胞10分钟，然后进行流式细胞仪分析。代表性的细胞内磷酸化Syk水平（上图）和通过CD14的中值荧光强度计算的磷酸化Syk相对表达（下图）+FcεRII+ monocytes and CD19+FcεRII+ 来自三个独立实验的B细胞。 （EIL-4孵育后，人单核细胞和B细胞中ADAM10的mRNA（上图）和蛋白（下图）表达。 （B）和（C）中的结果代表了来自 n = 3 donors.

Syk是造血细胞内细胞内信号转导的重要分子（43, 44），而GRB2对于B细胞功能很重要。免疫印迹结果通过证明Syk和GRB2被募集到人PBMC中被IgE免疫复合物激活的FcεRII来证实MS数据（图6B）。此外，B细胞（而非单核细胞）中IgE免疫复合物激活的FcεRII诱导了强大的Syk磷酸化（图6C, 6D）。在一起，我们确定Syk是人B细胞中FcεRII介导的信号传导的重要衔接子。

ADAM10是一种主要的FcεRII脱落酶，可释放sFcεRII，因此在变应性疾病中起着重要的作用（15, 16）。在这项研究中，我们证明了表达FcεRII的人单核细胞和B细胞均表达高水平的ADAM10，这表明两者都是sFcεRII的重要来源（图6E）。

IgE免疫复合物激活B细胞上的FcεRII诱导B细胞产生IFN-γ

在先前的研究中，我们在膜翅目毒液免疫治疗的早期阶段观察到患者的PBMC中的IFN-γmRNA水平升高（45）。最近，在小鼠模型中鉴定出产生IFN-γ的B细胞（46–51）。因此，我们调查了IgE免疫复合物的FcεRII介导的信号传导是否导致B细胞产生IFN-γ。

第一步，我们研究了变应原患者在变应原刺激过程中FcεRII介导的信号传导是否参与B细胞的IFN-γ产生。为此，在毒液免疫治疗的建立阶段从患者身上采集血液样本（ 图7A）。注射过敏原后，在过敏患者的血清中观察到针对Ves v 5的特异性IgE水平升高，这是黄夹克毒液中发现的主要过敏原之一，反映了过敏性免疫反应的激活（图7B）。此外，FcεRII（图7C）和接受免疫治疗的患者的血清sFcεRII水平（图7D）。通过基于TaqMan探针的实时PCR评估了单核细胞和B细胞中IL-10，IFN-γ和IL-6等活化和抑制因子的mRNA表达。注射变应原后，在开始变应原处理后2天和1周，在单核细胞中观察到IL-10和IFN-γmRNA的瞬时表达，而在B细胞中观察到IFN-γmRNA的表达增加（图7E）。与实时PCR结果相似，免疫疗法开始后，在单核细胞中观察到IL-10和IFN-γ蛋白表达升高，在B细胞中观察到IFN-γ蛋白表达升高（图7F）。

图7。
图7。

FcεRII介导的信号传导增加IFN-γ production in B cells from allergic patients. (A如图所示，收集了接受免疫治疗的毒液过敏患者的血液样本。 （B）针对Ves v 5的血清特异性IgE水平升高。FcεRII在PBMC上的表面表达（C）以及在开始过敏原注射之前，之后2天和1周后患者的sFcεRII血清水平（D）（n = 6 donors). (E）接受免疫治疗的毒液过敏患者单核细胞和B细胞的相对细胞因子mRNA表达。在指定的时间点分离单核细胞和B细胞，并进行基于TaqMan探针的实时PCR。 18S rRNA用作内部对照。显示了免疫治疗前，mRNA表达相对于靶基因表达的变化倍数（Wilcoxon试验， n = 11 donors). (F）新鲜分离自患者的单核细胞和B细胞的细胞内细胞因子染色。 CD14产生IFN-γ，IL-6和IL-10的一项代表性结果+ monocytes and CD19+ 显示了B细胞（左图）。 IFN-γ的百分比+, IL-6+和IL-10+ cells of CD14+ monocytes and CD19+ B细胞（右图）。结果来自 n = 5个独立实验，以中位数±四分位间距表示。 （G) Blockage of FcεRII降低了IFN-γ–产生B细胞。分离并鉴定了膜翅目毒液过敏患者的PBMC，并用毒液刺激–有或没有Fc的IgE免疫复合物εRII阻塞。培养48小时后，再用0.6％PHA刺激细胞48小时，然后进行流式细胞术分析。 IFN-α百分比的一个代表性结果γ+ CD19+ 显示了B细胞（左图）。 IFN-γ百分比的统计分析+ 总CD19的B细胞+ B细胞（右图）。 n = 7, *p < 0.05, Wilcoxon test.

为了研究FcεRII介导的信号传导是否能调节人B细胞中IFN-γ的产生，对膜翅目毒液过敏患者的PBMCs进行了毒液或毒液-IgE免疫复合物的刺激，有无FcεRII阻断。我们显示，与单独使用毒液相比，用毒液-IgE免疫复合物刺激后，产生IFN-γ的B细胞百分比增加。此外，FcεRII阻滞降低了对毒液-IgE免疫复合物刺激的反应，产生IFN-γ的B细胞的百分比（ 图7G）。

总之，我们的结果表明，用变应原-IgE免疫复合物刺激FcεRII可以诱导B细胞产生IFN-γ。

讨论

我们证明了FcεRII对人类单核细胞和B细胞具有独特的功能。我们显示人单核细胞和B细胞表达不同的FcεRII亚型。此外，人类B细胞（而非单核细胞）通过FcεRII结合并吸收变应原-IgE免疫复合物，该复合物与MHC-II途径相关。此外，变应原-IgE复合物刺激人B细胞而非单核细胞上的FcεRII使用Syk激活酪氨酸磷酸化。此外，FcεRII会激活一小部分产生IFN-γ的B细胞，这可能对过敏原刺激后的过敏性免疫应答很重要。

尽管已经对FcεRII进行了二十多年的研究，但有关FcεRII介导的信号和功能的数据并非一致，因为研究是在不同温度下使用各种类型和细胞系的细胞进行的，或者是通过使用刺激性的抗FcεRIIAbs而非活化细胞来进行的。其天然配体：IgE或过敏原-IgE复合物。 FcεRII介导的激活的结果受许多因素影响。例如，FcεRII与IgE的相互作用对温度敏感（13, 14），而Th2型细胞因子在变应性受试者中FcεRII的表达增加（4）。此外，FcεRII与其他免疫受体一起共表达于各种免疫细胞上，这些免疫受体可能对抗变应原-IgE复合物的结合和与FcεRII的吸收，从而改变FcεRII介导的活化的结果。因此，我们用正常的Th2型细胞因子IL-4维持人类外周细胞，并在正常体温（37°C）下用不同类型的过敏原-IgE复合物刺激它们，以更好地了解FcεRII在非常复杂的过敏反应中的生理作用。

患有过敏性疾病的患者中FcεRII升高（25–27），以及患有自身免疫性疾病的患者（52, 53）或B慢性淋巴细胞性白血病（22, 54, 55）。下列观察结果支持了FcεII的致病功能：在过敏性患者中给予抗FcεRIIAb剂量可降低血清IgE浓度（28）和减轻胶原蛋白诱发的小鼠关节炎（29）。此外，FcεRII的阻滞缓解了小鼠模型在胃肠道中的变应原诱导症状（30）。由于其胞内结构域的结构差异，FcεRIIa和FcεRIIb发挥不同的功能并激活不同的信号通路（4, 7）。我们的数据证明B细胞FcεRIIa的组成型表达不受IL-4刺激的影响（图2D）。相比之下，FcεRIIb是一种可诱导受体，可在多种细胞类型（包括单核细胞，B细胞以及呼吸道和肠道上皮细胞）中表达（4）。研究表明，FcεRIIa比FcεRIIb更有效地结合Ag-IgE免疫复合物（7）。我们的结果表明，B细胞上FcεRII的阻断降低了Bet v 1–IgE免疫复合物的内吞作用，而单核细胞上FcεRII的阻断并未显示出这种效果。

先前的研究表明，对人B细胞中的FcεRII进行刺激会导致ERK1 / 2，酪氨酸激酶Fyn和丝氨酸/苏氨酸激酶Akt活化，而单核细胞系U937中的FcεRII活化不会激活Fyn和Akt（56, 57）。在MS和免疫印迹的帮助下，我们证明了变应原– IgE复合物的FcεRII介导的信号传导是细胞类型依赖性的。尽管人B细胞和单核细胞在IL-4刺激后表达高水平的FcεRII，但B细胞（而非单核细胞）上的FcεRII活化了，导致Syk强烈磷酸化（ 图6D）。 Syk是一种基本的信号分子，可在多种免疫细胞（包括B细胞和单核细胞）中表达。 Syk与ITAM或细胞内适配器相互作用以启动细胞信号传导。 Syk是正常B细胞​​增殖和分化所必需的（58, 59），而Syk的组成性激活可能会将正常的B细胞转化为恶性肿瘤。在成人慢性白血病B慢性淋巴细胞性白血病中经常观察到FcεRII的过度表达（22）。此外，研究表明，Ab介导的FcεRII交联抑制了白血病B细胞的生长（22, 54, 55）。由于Syk的功能范围很广，因此活化的FcεRII可以用来调节细胞增殖和免疫反应。 FcεRII介导的信号传导中涉及哪种含B细胞的含ITAM的蛋白仍在研究中。

人单核细胞由骨髓中的造血干细胞前体产生，并在血流中循环。此外，单核细胞能够从血流迁移到组织中，并根据局部环境的刺激分化为组织DC（60）。来自健康供体的单核细胞不表达高水平的FcεRII，而FcεRII表达可被炎症环境诱导。实际上，特应性患者的单核细胞上调了FcεRII（25）。在我们的研究中，IL-4刺激后，人单核细胞表达高水平的表面FcεRIIb（Fig. 2）;然而，正如在B细胞中观察到的那样，FcεRIIb的表达升高并未导致FcεRII介导的变应原摄取增加（Fig. 3）。数据与观察到的一致，FcεRIIa而非FcεRIIb充当IgE或Ag-IgE复合物的双向转运蛋白（7）。此外，实验在37℃下进行。在此温度下，由于FcεRII三聚体的解离，FcεRII降低了IgE结合能力（13, 14）。因此，减少的FcεRII介导的Ag摄取可能与其他Ag摄取机制竞争，因此，其作用被浸入了单核细胞的高Ag摄取背景中（Fig. 3）。尽管在我们的研究中刺激人单核细胞中的FcεRII不会引起细胞内蛋白质的明显酪氨酸磷酸化，但我们的数据并未驳斥FcεRII对人单核细胞的功能。研究表明，单核细胞，巨噬细胞和人单核U937细胞系等单核细胞中FcεRII介导的信号通过产生自由基，NO和促炎性细胞因子来促进炎症（ 24）。而且，我们的结果表明，人单核细胞高表达ADAM10，它是FcεRII的主要脱落酶。这表明人类单核细胞与B细胞一起通过释放sFcεRII调节IgE来促进过敏性炎症（17–19）。

FcεRII与MHC-II分子的缔合已得到充分证明（61, 62）。在小鼠模型中显示，与Ag特异的IgE一起施用Ag，可以以FcεRII依赖性方式增强T细胞和B细胞的特异性反应（63）。此外，鼠类外周血B细胞能够介导IgE免疫复合物通过FcεRII转运至脾滤泡（64）。 In line with these studies, we showed that peripheral human B cells are capable of binding and taking up Bet v 1–通过Fc的IgE免疫复合物εRII.

B细胞通过产生Ag特异的Abs是体液免疫的主要参与者，而B细胞的不依赖Ab的功能（包括细胞因子的分泌）则是先天免疫。在我们的研究中，来自患者的B细胞在毒液特异性免疫治疗的建立阶段表达了更高水平的IFN-γ。我们的结果表明，在变应原特异性免疫治疗的建立阶段，变应原IgE免疫复合物激活产生IFN-γ的B细胞是成功治疗变态反应患者的先决条件。尽管IFN-γ主要由CD4产生+ 据报道，T细胞和NK细胞，产生IFN-γ的B细胞具有传染性（46, 47, 49），狼疮（50）和自身免疫性关节炎（48）鼠标模型。 B细胞中的IFN-γ诱导T-bet表达，并由此调节寄生虫特异性B细胞的确定 疟原虫 infection (49）。在鼠狼疮模型中，B细胞产生的内在IFN-γ有助于自发生发中心的形成，这是自发体液自身免疫所必需的（50）。内源性IFN-γ信号的耗竭消除了自发的自身免疫生发中心和类别转换的自身抗体的产生（51）。有趣的是，研究中鉴定出产生IFN-γ的细胞（47）是CD11a你好FcγRIII你好 B细胞，也表达FcεRII。因此，有可能产生IFN-γ的B细胞通过FcεRII感应并与IgE-过敏原复合物发生反应。因为IFN-γ可增强B细胞活化（65, 66），可能是人类意义上的那些产生IFN-γ的B细胞IgE-过敏原免疫复合物并分泌IFN-γ以自分泌方式激活自身或以旁分泌方式激活其他免疫细胞。但是，那些产生IFN-γ的B细胞在人变态反应性免疫反应中的功能有待进一步研究。

在一起，我们的研究阐明了人类单核细胞和B细胞对通过FcεRII刺激IgE免疫复合物的反应所依赖的细胞类型依赖性功能。更好地了解FcεRII介导的免疫细胞应答对于成功控制过敏性疾病非常重要。

披露事项

R.V.已获得Biomay AG（奥地利维也纳）的研究资助， 赛默飞世尔 Scientific（瑞典乌普萨拉）和Fresenius Medical Care（德国巴特洪堡），并担任这些公司的顾问。其他作者没有财务利益冲突。

脚注

  • 这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft的Grant SFB 704，卓越免疫免疫集群，CKCare，波恩大学的BONFOR资助以及部分来自奥地利科学基金的Sonderforschungsbereich资助F4605和F4607的支持。

  • 本文的在线版本包含 补充材料.

  • 本文中使用的缩写：

    ADAM10
    整联蛋白和金属蛋白酶10
    投注v 1–FITC
    FITC共轭桦木花粉过敏原Bet v 1
    直流电
    树突状细胞
    MHC-II
    MHC II级
    小姐
    质谱
    NP
    4-羟基-3-硝基苯基乙酰半抗原
    NP-BSA
    NP共轭牛血清白蛋白
    sFcεRII
    可溶性FcεRII。

  • 已收到 2016年6月13日。
  • 公认 2017年2月14日。

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