Roquin Paralogs差异调节功能性NKT细胞基集

Christoph. Drees.; j。 Christoph. Vahl.; Sabrina. Bortoluzzi.; 克劳斯D. Heger.; 朱利叶斯C. Fischer.; F。 Thomas. Wunderlich.; 基督徒Peschel.; 马克 Schmidt-Supprian

doi:10.4049 / Jimmunol.1601732

抽象的

NKT细胞代表了甘油脂识别T细胞的小亚颗粒，其严重涉及人体过敏性，自身免疫和恶性疾病。在胸腺中，前体细胞通过它们的半不变TCR识别自糖脂，其触发NKT细胞谱系承诺和成熟。在其开发期间，NKT细胞通过它们的细胞因子分泌模式和关键转录因子的表达来偏振成NKT1，NKT2和NKT17亚群。但是，我们在很大程度上忽略了如何调节如何分化进入NKT细胞亚群。在本文中，我们将MRNA结合的Roquin-1和-2蛋白描述为小鼠NKT细胞命运决策的中央调节因素。在胸腺中，T细胞特异性消融犬蛋白常规导致NKT17细胞的显着膨胀，而外周成熟NKT细胞基本上不存在。 Roquin-1/2缺陷NKT17细胞显示出几乎所有NKT17定义蛋白质的夸张谱系特异性表达。我们通过混合骨髓嵌合实验表明，NKT17极化在NKT细胞发育期间通过细胞固有机制介导。相比之下，外周NKT细胞的损失是由于细胞外部因素。令人惊讶的是，Roquin Paralog缺陷的NKT细胞是与常规T细胞的对比，损害其分泌细胞因子的能力。完全，我们表明Roquin Paralogs规范了胸腺和外围中NKT细胞亚群的开发和功能。

介绍

天然杀手T细胞表达了一种进化的半不变性TCR，其特征在于，响应先天和抗原刺激，通过活化表型和效应细胞因子的快速分泌。在小鼠中，NKT细胞在肝脏，脾脏和骨髓中占淋巴细胞的0.2-0.5％，肝脏中〜30％，而在人类中，馏分较小（<0.1和1％）分别）（1）。尽管它们很少，但NKT细胞应答可以驱动炎症或耐受，从而影响各种免疫细胞，例如树突细胞，NK细胞和B和T细胞（2）。 NKT细胞保护其来自某些细菌菌株的宿主生物，维持抗病毒反应，并有助于抑制某些类型的癌症和免疫疾病（1, 3–6）。相比之下，NKT细胞参与过敏反应，溃疡性结肠炎和肝癌的病理生理学（7–9）。因此，根据不同的环境因素，NKT细胞活化可以显着不同的结果。

稀有的Vα14-Jα18（Vα14i）在CD4 CD8双阳性（DP）胸腺细胞中的TCRα链重排，与有限数量的TCRβ-链相结合，以表达糖脂识别TCR。绝大多数NKT细胞表达含有含Vα14i的半不变性TCR。因此，它们被称为不变的NKT或Vα14i-NKT细胞，但为简单起见，我们将把它们称为NKT细胞。通过前体细胞表达的半不变TCR在DP胸腺细胞上识别CD1D在DP胸腺细胞上识别（第0阶段：CD24^高的, CD44^低的，NK1.1.⁻）触发NKT细胞开发（10, 11）。这些TCR信号诱导大规模增殖的膨胀，下调CD24（第1阶段），以及NKT细胞成熟的关键转录调节剂，早幼细胞白血病锌指（PLZF）的表达（12–15）。通过随后上调记忆标记CD44（第2阶段）和NK细胞标志物的表达，最突出的NK1.1（第3阶段）（16, 17）。在通过阶段1-3的同时，NKT细胞也区分为NKT1所谓的功能子集（PLZF^低的，t-bet⁺），NKT2（PLZF^高的，gata3.⁺）和NKT17（PLZF^㈡，RORγT.⁺）细胞，其朝向优先产生细胞因子的偏振，使各自的细胞谱系中联想（18, 19）。驱动这些NKT小区子集的差异的信号和事件被不完全理解。

Roquin-1及其哺乳动物Pararog Roquin-2，编码 rc3h1 和 rc3h2 分别是mRNA结合蛋白质，可通过基因的冗余和独特的术后调节抑制免疫反应，包括共刺激分子和促炎细胞因子（20–24）。因此，这些蛋白质通过防止自发产生毛囊TH（T.）来充当自身免疫的保障措施_FH.）细胞，产生IL-17的Th17细胞，和IFN-γ-产生短效应效应CD8 T细胞（20, 22, 25）。然而，它们在激动剂选择的T细胞亚群（例如NKT细胞）中的作用是未知的。

在本文中，我们报告说，在T细胞中的roquin副葡萄球菌病的条件消融基本上防止了胸腺中的成熟NKT细胞的产生，除了NKT17细胞，其产生通过细胞内在机构显着增加。 Roquin-1/2缺陷NKT细胞表达大量的NKT17相关标记，但显示出低响应表型，如障碍的细胞因子产生所示。此外，外周roquin-1/2缺陷的NKT细胞基本上不存在，主要是由于细胞外部机制。

材料和方法

老鼠

CD4Cre (26）， Rc3h1^{F / F.} (24）， Rc3h2^{F / F.} (22）， Vα14i^stopf. (27）， IL6Rα^{- / -}，和 IL6Rα^{F / F.} (28）将小鼠保持在C57BL / 6遗传背景上。在Max-Planck生物化学研究所和TechnischeUniversitätMünchen，将小鼠置于特定的无病原体动物设施中。除非另有说明，否则在6-12倍的年龄分析年龄匹配的动物。 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 在任何可见的病理迹象之前分析了小鼠。所有实验均按照德国联邦动物保护法进行，并由Oberbayern的瑞尼隆批准。在大多数实验中， Rc3h1^{F / F.} Rc3h2^{F / F.}, Rc3h1^{F / F.} Rc3h2^{F / +}和/或 CD4Cre 小鼠用作对照。汇集了控制，因为一个副本 CD4Cre 转基因不会显着影响胸腺细胞数或脾脏NKT细胞数（29）。

流式细胞仪

使用以下商用ABS和试剂盒染色单细胞悬浮液：BCL-6（K112-91），B220（RA3-6B2），CCR-6（29-2L17），CD4（GK1-5，RM4-5）， CD8A（53-6.7），CD11b（M1 / 70），CD44（IM7），CD45.1（A20），CD45.2（104），CD62L（MEL-14），CD90.2（53-2.1），CD127 （A7R34），CD138（281-2），C-MAF（SYM-0F1），CXCR5（2G8），EGR2（ERONGR2），FOXP3（FJK-16S），GATA3（TWAJ），GR-1（RB6-8C5），IL-17（EBIO17B7），IL-4，（11B11），IL-6Rα（D7715A7），INF-γ（XMG1.2），LY-6C（HK1.4），神经疏松素-1（JE12），NK1。 1（PK136），PD-1（J43），PLZF（9E12），RORγT（AFKJS-9，Q1-387），TCRβ（H57-597），T-BET（4B10）和THPOK（2POK）。对于细胞内转录因子染色，用FoxP3转录因子染色缓冲液（eBioscience）固定细胞并透化。对于细胞内细胞因子染色，用Cytofix / Cytoperm试剂盒（Bd）或FoxP3转录因子染色缓冲液（eBioscience）透滤细胞。为了分析细胞内磷酸化蛋白，使用无血清缓冲液制备单细胞悬浮液。使用转录因子磷咯酸盐缓冲液组（用Phosflow Lyse / Fix缓冲液固定）处理细胞，并用烫发缓冲液III（来自BD）的渗透化。使用可商购的MAb对P-STAT3（PS727），P-MTOR（MRRBY），P-4EBP1（236B4）和P-AKT（S473）（M89-61），P-ZAP70（N3KOBU5）进行，并且磷酸化磷脂酶-Cγ（PLCγ）（K86-689.37）（来自BD）。对于凋亡细胞的检测，使用膜蛋白V检测试剂盒（eBioscience）用膜蛋白V和7-氨基酰胺霉素D（7-AAD）用细胞染色细胞。 MCD1D PBS-57四聚体由国家卫生学核心机构提供。用于富集胸腺NKT细胞，CD8 ⁺ 使用CD8a microbeads（Miltenyi Biotec）耗尽胸腺细胞。对于细胞内细胞因子染色，用100ng / ml pMA（sigma）和1000ng / ml离子霉素（Calbiochem）刺激细胞4小时，与2μm蒙蛋白（ebioscience）一起。在Facscanto II或LSRFortessa（BD）上获得样品，并用Flowjo软件分析。用于在NKT细胞上浇注，使用以下门控策略：单体→活/死亡染色，在活细胞上门→淋巴细胞门→TCRβ^㈡ mCD1d-PBS57⁺ 细胞。如FACS图中所示所示所示的NKT细胞阶段和子集。为了分析细胞外和细胞内蛋白的相对表达，计算中值荧光强度（MFI），以及MCD1D-PBS57四聚体的平均MFI⁻TCR.β⁺ 将各种对照小鼠的T细胞设定为1。

椎相子秃头和肺淋巴细胞的分离

为了分离淋巴细胞，去除Peyer的贴剂和脂肪组织，用冰冷的PBS冲洗肠。蚕纵向打开并切成1-1.5厘米的碎片。在PBS中剧烈涡旋后，将样品在含有5％FCS和5mM EDTA，1mM DTT和10mM HEPES的HBSS缓冲液中在37℃下在37℃下孵育两次。然后，将细胞在PBS中洗涤，并在37℃的PBS中消化肠45分钟^{+ ca / + mg} 含有5％Fcs，1mg / ml胶原酶，2型（细胞系统）和0.1mg / ml DNase I（Roche）。然后通过40/80％的Percoll（Biochrom）梯度纯化淋巴细胞。

为了制备单细胞悬浮液，使用含有0.02mg / ml钠酶Tm和10u DNase（来自Roche诊断）的RPMI 1640来消化肺部。

骨髓嵌合体

b6.sjl-ptproppcb / boyj（b6.sjl-congenic）; C57BL / 6杂合子受体小鼠（CD45.1 / 2）致死地用2×5.5Gy（4小时）辐射并注射I.V。 4-5×10⁶ B6.SJ1（CD45.1）/ C57BL / 6（CD45.2）的骨髓细胞为1：1。移植前，使用CD90.2微珠（Miltenyi Biotec）骨髓耗尽T细胞。在移植受体小鼠的两到三天之前直到2周，用Borgal 24％（Virbac Animal Health）以0.1ml / kg体重/ d的剂量在饮用水中处理。移植后分析7-9个WK的小鼠。

统计分析

通过GraphPad Prism版本6进行统计分析6. p 根据图例中所示计算值。

结果

扎氏蛋白的消融导致胸腺NKT细胞的减少和外周NKT细胞的损失

为了评估Roquin蛋白在NKT细胞中的作用，我们分析了具有T细胞特异性消融的小鼠的一体或两种蛋白质。我们为此目的使用了CD4Cre，因为它有效地重组条件等位基因，包括 Rc3h1^{F / F.} (24）和 Rc3h2^{F / F.} (22），在DP胸腺细胞中。 CD4CRE介导的蛋白烧蚀在NKT细胞前体中完成（16, 17, 30, 31），代表较旧的DP胸腺细胞，因为Vα14-Jα18重新排列的晚期时间（16, 17, 31, 32）。 Roquin-1的敲除以及Roquin-1/2的核果导致NKT细胞比例和胸腺中的数量减少2倍（图。1A, 1B）。胸腺发育阶段的分析1-3在第1阶段显示正常数，第2阶段的数量，并且在NKT细胞中的第3阶段中的数量显着损失 CD4CRE RC3H1^{F / F.} 与对照小鼠相比的小鼠;当扎管2被调节时，这会强烈加剧（图。1A, 1C）。因此，平均32×10的阶段3 NKT细胞的绝对数量减少⁴ 控制中的细胞到16×10⁴ 在 CD4CRE RC3H1^{F / F.} 老鼠 and 1 × 10⁴ 在 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 老鼠 (图1C.）。

图1。

扎氏蛋白酶消融导致阶段2 NKT细胞的膨胀，并在周边减少NKT细胞。（ A）胸腺MCD1D-PBS57四聚物的百分比⁺ NKT细胞和NKT细胞阶段控制， CD4CRE RC3H1^{F / F.}，和 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 老鼠。代表性地块中的数字表示从至少三个独立实验中汇总的每个基因型的至少8只小鼠计算的平均百分比±SD。（B）绝对的细胞数（×10⁴）指定基因型的胸腺NKT细胞。每个数据点代表一个鼠标，并且条表示平均电池数，其也在图表下面描绘。图表显示了至少三个独立实验的汇总数据。 **p < 0.01, ****p <0.0001，单向ANOVA。（C）绝对的细胞数（×10⁴）指定基因型的胸腺NKT细胞阶段。酒吧显示平均数字。每个数据点代表至少三个独立实验的指定基因型的一只鼠标。 *p < 0.05, multiple t tests. (D）脾脏的控制， CD4CRE RC3H1^{F / F.}，和 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 分析小鼠的NKT细胞的存在。所示是在总淋巴细胞上浇注的每个基因型的代表性轮廓图。数字表示从至少两个独立实验中汇集的每个基因型的总共至少七只小鼠计算的平均百分比±SD。（ E）总细胞数（×10⁴）脾脏中的NKT细胞， CD4CRE RC3H1^{F / F.}，和 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 老鼠。条表示平均细胞数（也描绘在图下方），每个数据点代表从至少两个独立实验中汇集的一个分析的鼠标。 *p < 0.05, **p < 0.01, ****p <0.0001，单向ANOVA。（F）总细胞数（×10⁴）肝脏，铅板和控制的淋巴细胞和NKT细胞和 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 老鼠。条表示平均细胞数，每个数据点代表一只鼠标。从至少两个独立实验中汇集到至少六只小鼠的数据。 *p < 0.05, **p < 0.005, unpaired t 测试。 ns，不重要。

此外，Roquin蛋白的丧失也影响了外周淋巴结器官中的NKT细胞。在脾脏的 CD4CRE RC3H1^{F / F.} 小鼠，NKT细胞比例和绝对数减少>50％，主要是由于阶段3 NKT细胞的减少（图。1D, 1E, 补充图1A）。尖锐的是，NKT细胞在脾脏中几乎不存在 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 老鼠 (图。1D, 1E）。在肝脏，外周淋巴结（PLN），肠系膜淋巴结（MLNS）和肺中观察到类似的图片（图。1F., 补充图1B）。免疫细胞在肝脏中显着扩增，最突出地在PLN中，但不是在MLNS中 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 与对照小鼠相比的小鼠。因此，肝脏和MLNS中的绝对NKT细胞数减少，但不是PLNS（图。1F.）。与Roquin-1相反，roquin-2的个体丧失对NKT细胞开发和数字没有可辨别的影响（补充图1C，1D）。

连胜，扎基蛋白的消融导致胸腺NKT细胞产生的剂量依赖性降低，在阶段2和3之间的透明成熟块。在周边，NKT细胞在勉强可检测到 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} mice.

Roquin蛋白限制NKT17细胞分化

鉴于大多数NKT17细胞是表型阶段2，我们确定了子集合组合物（33）。我们发现增加了NKT17细胞的比例 CD4CRE RC3H1^{F / F.} 小鼠，而大多数NKT细胞 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 老鼠 were NKT17 (图2A）。单独roquin-2的丧失对NKT子集组合物没有影响（补充图1E）。重要的是，NKT17细胞的绝对数量增加>10倍，平均为0.5×10⁴ 在控制到6.5×10⁴ 细胞in. CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 老鼠。因此，我们得出结论，增加的比例是由于在没有Roquin介导的调节的情况下强烈增加的NKT17细胞产生，而不仅仅是降低的NKT1人群（图。2B）。此时，由于我们观察到鲁道汀蛋白质不存在更明显的变化，我们专注于胸腺NKT细胞的分析 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 进一步实验中的小鼠。

图2。

扎基辛的消融促进了NKT17谱系的极化。（A）NKT1，NKT2和NKT17细胞的百分比对照， CD4CRE RC3H1^{F / F.}，和 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 老鼠。代表性轮廓图中的数字表示从至少三个独立实验的每个基因型至少八只小鼠计算的平均百分比±SD。在MACS耗尽CD8后获得细胞⁺ thymocytes. (B）绝对的细胞数（×10⁴）指定基因型的胸腺NKT细胞亚群。条形图显示平均细胞数，每个数据点代表一只鼠标。从至少三个独立的实验中汇集了数据。（C）ICOS MFI对胸腺四聚物⁻TCR.β⁺ 表明基因型的胸腺细胞和NKT1，NKT2和NKT17细胞。条形图显示为MFI，每个数据点代表一只鼠标。 MFI被标准化为对照TCRβ的平均MFI⁺ tetramer⁻ 设置为1.显示数据的胸腺细胞从至少三个独立的实验中汇集了数据。（D）CCR-6，CD103，CD138和Neuropilin-1对胸腺NKT1，NKT2和NKT17细胞的表达和控制 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 老鼠。代表性轮廓图中的数字显示从至少两个独立实验汇总的每个标记的至少三只小鼠计算的平均百分比±SD。（a），（c）和（d）的胸腺嘧啶在收购前通过Mac耗尽CD8。 *p < 0.05, multiple t 使用HOLM-SIDAK方法进行测试。

ICOS是Roquin的后术前活动的第一个目标，但ICOS也在NKT细胞基集中差异化。因此，我们将ICOS MFIS与NKT1，NKT2和NKT17细胞进行比较。在对照中，在NKT17和NKT2细胞上发现最高ICOS表达，而NKT1细胞表达与TCRβ相似的量⁺ tetramer⁻ thymocytes (图2C.）。 roquin paralogs的丧失增强了ICOS表达在所有子集中的相似程度（图2C.），表明NKT细胞亚群中的差分ICOS表达在很大程度上独立于罗基蛋白介导的调节。

NKT17细胞的特征在于趋化因子受体CCR-6的表达，整合蛋白α_Eβ7（CD103），Syndecan-1（CD138）和Neuropilin-1（NRP-1）（图2D）（34–36）。与对照不同，roquin-1/2缺陷的NKT17细胞对于所有这些标记均匀呈阳性（图2D）。有趣的是，roquin-1/2缺陷的NKT1和NKT2细胞的一部分表达了CD138，表面蛋白最忠实地代表NKT17谱系承诺。这可能表明在这些细胞中偏向NKT17分化。

总之，我们证明Roquin蛋白防止了极化进入NKT17谱系。

敲入vα14iTCR的表达有助于所有NKT细胞亚群的开发和外周积累 CD4CREvα14i^stopf. Rc3h1-2^{F / F.} mice

Vα14iTCR的转基因表达已经经常使用以拯救早期NKT细胞发育中的缺陷。存在正常数的阶段1 NKT细胞前体 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 小鼠基本上排除了TCRα重排或胸腺细胞存活中的缺陷，这在这种实验中通常克服。我们最近产生了 Vα14i^stopf. 等位基因，一种新型类型的Vα14i转基因，其在CRE介导的重组中表达来自内源TCRα基因位点的Vα14iTCR。结合CD4CRE，这导致大规模的NKT细胞过量生产（图3A）（27）。在 CD4CREvα14i^stopf. Rc3h1-2^{F / F.} 小鼠，CRE的表达导致所有有条件等位基因的重组，最终导致罗基蛋白-1 / 2等位基因的失活和Vα14iTCRα链的诱导。 vα14itcr表达在CRE表达后6小时内发生（S. Bortoluzzi，C. DreeS和M.Schmidt-Supprian，未发表的观察），而在鲁出-1 / 2蛋白的功能耗尽之前需要更长时间（S. 。波多柯，C. DreeS和M. Schmidt-Supprian，未发表的观察）。此外，很可能是细胞已激活 Vα14i^stopf. 等位基因在它灭活所有四个羊蛋白等位基因之前。因此，与情况相比 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 小鼠，在 CD4CREvα14i^stopf. Rc3h1-2^{F / F.} 小鼠最初表达的vα14iTCR最初向仍然含有一些植物蛋白的细胞发出信号，然后在NKT细胞发育过程中丢失。 Vα14iTCR表达恢复了所有阶段的NKT细胞的发展 CD4CREvα14i^stopf. Rc3h1-2^{F / F.} 虽然与对照相比，虽然整体数量仍然显着减少（图3A, 3B）。在vα14i敲击小鼠中，NKT细胞发育在其发展早期强烈偏向细胞（图3B.），这也反映在RORγT和PLZF的表达谱中（补充图2A）。在MCD1D-PBS57中的四聚体内⁺ NKT细胞，我们定义了最早的RORγT⁺ PLZF⁻ CD44⁻ CD24⁺ 祖细胞作为Vα14i-DP，因为它们基本上代表表达Vα14i-NKT细胞TCR的DP胸腺细胞（图。3D, 3E, 补充图2A）。我们称之为下一个rorγt⁻ PLZF⁻ NK1.1⁻ 发育阶段作为预先是NKT，因为它由各种NKT细胞前体群体组成（补充图2A）。比例和绝对细胞数表明在扎金-1 / 2的消融时Vα14i-DP中的轻微嵌段至NKT前转变（图3C.）。 NKT1的数量（RORγT⁻，NK1.1.⁺，PLZF.^㈡）和NKT17（RORγT⁺, CD44⁺, CD24⁻）细胞在两种基因型中相似，而羊蛋白的丧失导致NKT2减少（RORγT⁻，PLZF.^高的, CD24⁻）细胞（图3C., 补充图2A）。进一步表征早期祖先阶段和具有T-BET和GATA3的功能子集的表征证实了这些结果（图。3D-G）。在脾脏中，也检测到所有亚胞胎和阶段的成熟roquin-1/2缺陷的NKT细胞，尽管与对照相比，数量减少了数量（Fig. 4）。最小化的是plzf^高的（NKT2）细胞，而NKT17细胞数未显着改变（Fig. 4）。

图3。

V的转基因表达α14i TCR at the DP stage enables the development of diverse thymic NKT cell subsets in CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 老鼠。 Representative contour plots show the mean percentage ±SD和条形图显示总单元数（×10⁴）胸腺NKT细胞（A）和NKT细胞阶段（B）在指定的基因型的小鼠中。（C）条形图显示百分比和绝对的细胞编号（×10⁴）胸腺NKT细胞亚群 CD4CREvα14i^stopf. 和 CD4CREvα14i^stopf. Rc3h1-2^{F / F.} 老鼠。 NKT细胞子集被定义为RORγT ⁺，PLZF.⁻, CD24⁺, CD44⁻ （Vα14i-DP细胞），RORγT⁻，非NKT2和非NKT1细胞（Pre-NKT细胞），RORγt⁻，NK1.1.⁺，PLZF.^低的 (NKT1 cells), RORγt⁻，PLZF.^高的, CD24⁻（NKT2细胞）和RORγt⁺，PLZF.^㈡, CD24⁻, CD44⁺ （NKT17细胞）。（a-c）中的条形表示平均细胞数，每个数据点代表一个分析的鼠标。从至少三个独立的实验中汇集了数据。 *p < 0.05, multiple t 使用HOLM-SIDAK方法进行测试。（D）代表性的轮廓图显示了定义胸腺Vα14i-DP的门控策略（RORγT⁺，PLZF.⁻, CD24⁺），前NKT（RORγT⁻，非NKT2和非NKT1细胞），NKT1（RORγt⁻，t-bet⁺，PLZF.^低的），NKT2（RORγT⁻，gata3.⁺，PLZF.^高的）和NKT17（RORγT⁺，PLZF.^㈡, CD24⁻）细胞 CD4CREvα14i^stopf. 老鼠。 (E）轮廓图显示CD44和CD24（上面板）和CD4和CD8（下面板）的表达在胸腺Vα14i-DP和前NKT细胞中。情节是三个的代表 CD4CREvα14i^stopf. 一个实验的小鼠。条形图显示百分比（F）和绝对的细胞数（G）胸腺Vα14i-DP，预先NKT，NKT1，NKT2和NKT17细胞 CD4CREvα14i^stopf. 和 CD4CREvα14i^stopf. Rc3h1-2^{F / F.} 如（d）所示所示的小鼠。条形图显示平均百分比（f）和平均细胞数×10⁴ （g），每个数据点代表一个实验的一个单独鼠标。 *p < 0.05, multiple t tests (G) using the Holm–Sidak方法（F）。 ns，不重要。

图4。

脾脏中的NKT细胞 CD4CREvα14i^stopf. 和 CD4CREvα14i^stopf. Rc3h1-2^{F / F.} 老鼠。 (A) Representative contour plots show the mean percentage ±脾脏细胞（左侧面板）的SD，NKT细胞阶段1–3 (middle panel), and NKT1, NKT2, and NKT17 cells (right panel) in CD4CREvα14i^stopf. 小鼠与之相比 CD4CREvα14i^stopf. Rc3h1-2^{F / F.} 老鼠。 (B）条形图显示脾脏NKT细胞（左侧面板），NKT阶段1-3（中间板）和NKT1，NKT2和NKT17细胞（右侧面板）的平均细胞数，如（a）所示，和隔离所示来自指定基因型的脾脏。每个符号代表一个分析的鼠标，并且汇集了所有显示的数据，从三个独立的实验中汇集。 *p < 0.05, multiple t tests using the Holm–Sidak方法。 ns，不重要。

总之，我们表明，敲入vα14iNKT细胞TCR的表达，伴随着罗基蛋白-1 / 2的烧蚀，在很大程度上克服了胸腺NKT细胞发育中的嵌段，允许积聚鲁氏缺乏成熟的外周NKT细胞强烈降低了对NKT17细胞生产的偏差 CD4CREvα14i^stopf. Rc3h1-2^F/^F mice.

Roquin Paralogs细胞本质上驱动NKT17分化，并且外周NKT细胞的损失也是由于细胞外部因素

源自Vα14iTCR的实验结果表明，Roquin蛋白在NKT细胞发育的最早阶段起着决定性的作用。 DP胸腺细胞对于通过在信号传导淋巴细胞活化分子（SLAM）家族成员之间的偶曲型相互作用（ 16, 37）。然而，CD1D，CD150（SLAMF1）和LY108（SLAMF6）的表达是成功的NKT细胞发育所必需的（37），在DP胸腺细胞中缺乏罗基因常规（图5A），争论这些细胞的间接作用。直接区分细胞内在或细胞外部机制，我们创建了混合的骨髓嵌合体。我们养殖T细胞耗尽的CD45.1 B6.SJL-Congenic骨髓，与等量的CD45.2对照或CD45.2混合 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} T细胞耗尽的骨髓，进入致命辐照的CD45.1 / 2 DP小鼠（图5B., 补充图2b）。移植后7-9周分析了所得嵌合体的胸腺素和脾脏。即使在致命辐照后，将产生20-30％的胸肉中的胸腺NKT细胞源自宿主，并且在脾脏中发现了类似的无线电CD45.1 / 2宿主T和NKT细胞的比例（补充图2C）。此外，为了考虑典型的这些实验的植入变异，我们将CD45.1 / CD45.2的比率标准化为双阴性（DN）胸腺细胞和B细胞的比例，这是粗喹蓬的。该分析显示Roquin-1/2缺陷的NKT细胞从其前体的正常比例发育，类似于其他胸腺细胞亚组，类似于CD45.1竞争对手和CD45.2控制NKT细胞。尖锐的是，在脾脏的几乎正常比例中，也可以在脾脏中的几乎正常比较与情况上的情况下检测到roquin-1/2缺陷的NKT细胞 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 老鼠 (图。 1D, 1E, 5C, 补充图2C）。与CD45.1竞争对手和CD45.1和CD45.2细胞中的CD45.1竞争对手和CD45.2细胞在控制嵌合体中的CD45.1和CD45.2细胞相比，鲁出-1 / 2缺陷CD45.2胸腺NKT17细胞的比例强烈且显着增加（图5D）。虽然NKT17细胞仍然是显性的，但在脾脏中，可以检测到所有子集的roquin-1/2缺陷的NKT细胞，但仍然是显性图5C., 补充图2c，2d）。此外，我们发现ICOS表达升高，内存/效应样T细胞和T的自发分化_FH. roquin-1/2缺陷谱的细胞是细胞内在（补充图3），类似于San / San T谱系（38）。

图5。

罗基因消融后NKT17细胞的扩增以细胞内在方式调节;然而，NKT细胞外部机制有助于减少外周NKT细胞。（A）表示Ly108（Slamf6），CD150（SlamF1）和CD1D的表达的代表性线图在DP胸腺细胞上标准化为TCRβ的表达⁺ tetramer⁻对照小鼠的细胞。数据表示平均归一化的MFI±从三个独立实验中汇集的四只小鼠的SD。用于标准化，TCR的MFIβ⁺ tetramer⁻ 细胞设定为1.（B）骨髓嵌合体实验的实验设置。将CD45.1 / 2 DP受体小鼠移植，用CD45.1 B6.SJL骨髓的1：1混合物与CD45.2对照或CD45.2一起移植 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 骨髓。使用CD90.2珠子，MAC骨髓耗尽了T细胞。在移植后处死7-9周，分析了胸腺嘧啶和脾脏中的NKT细胞。（C）分析了所指示的胸腺（上面板）和脾（下面板）两组的免疫细胞群进行CD45.1和CD45.2的表达。数据代表来自两个独立实验之一的七个实验和四个对照小鼠的平均百分比±SD，并被归一化为DN胸腺细胞（胸腺）或B细胞（脾）的植入。（D）代表性点图显示了所指示的骨髓嵌合体的胸腺中NKT1，NKT2和NKT17细胞的分布。在MACS耗尽CD8后获得细胞⁺ 胸腺细胞。数字表示从两个独立实验中的四种对照和七个实验小鼠计算的平均百分比±SD。 *p < 0.05, multiple t tests using the Holm–Sidak方法。 ns，不重要。

测试是否最初产生外围NKT细胞但随着时间的推移丢失 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 小鼠，我们在非常年轻（16-20 d-Ord）小鼠中分析了NKT细胞开发。胸腺中的NKT细胞数显着减少，几乎在年轻的脾脏中缺席 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 小鼠与对照小鼠相比（图6A, 6B）。在此时代，NKT2细胞代表对照小鼠的胸腺嘧啶中的最大子集，而在没有罗基蛋白的情况下，NKT17细胞占主导地位，产生很少的NKT1 / 2细胞（图6C.），类似于老鼠的情况（图。2B）。

图6。

NKT细胞开发年轻 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 老鼠。条形图代表胸腺的平均百分比（左侧面板）和绝对数量（右侧）（A）和脾脏（B）从16-20-D-Old隔离的NKT细胞 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 和控制小鼠。每个数据点代表一个分析的鼠标;从至少两个独立实验中汇集了数据。 **p < 0.005, ***p < 0.0005, unpaired t test. (C）胸腺和NKT细胞亚群 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 和对照动物。指示的NKT小区子集的平均百分比（左面板）和平均细胞数（右图）。每个数据点代表一个分析的鼠标;从至少两个独立实验中汇集了数据。 *p < 0.05, multiple t 使用HOLM-SIDAK方法进行测试。

因此，我们的结果表明，大规模的NKT17细胞生产 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 小鼠通过细胞内在机制介导，而成熟外周NKT细胞的还原在很大程度上是由细胞外部机制引起的。

Roquin-1/2缺陷NKT细胞的特征在于C-MAF升高，但eGR2，PLZF和磷酸化的STAT3水平降低

已经证明了罗基蛋白-1 / 2缺陷NKT细胞NKT17偏差的细胞内在性质，我们开始进一步分子表征。与对照相比，缺乏Roquin Paralogs的NKT17细胞在其表面上表达了较高量的TCR，而NKT1细胞表达较低的水平（图7A）。常规CD4 T细胞在剥夺TCR介导的自我识别时上调LY-6C（39）。在NKT谱系中，NKT1细胞具有最大的LY-6C比例⁺ 细胞，而仅少量NKT2并且基本上没有NKT17细胞被剥离自我剥夺，而不是自我剥夺的，这与TCRβ表达相反。 Roquin-1/2的丧失减少了LY-6C的百分比⁺ 所有NKT子集中的细胞，虽然差异不是戏剧性的（图7B.）。接下来，我们评估了TCR诱导的转录因子EGR2的表达，该表达也显示通过在未成熟的NKT细胞中与其启动子结合（40）。 Roquin-1/2的丧失导致TCR中EGR2水平的显着降低⁺ 胸腺细胞和所有NKT子集，包括具有最高TCR表面水平的NKT17细胞（图7C.）。在Roquin-1/2缺陷的NKT17细胞中，降低的EGR2表达伴随了PLZF蛋白的50％（图7C.）但是在其他子集中不变。显示PLZF调节C-MAF的表达（41），在Th17细胞中高度表达的细胞因子产生的转录调节剂（42）通过诱导RORγT（43）。有趣的是，我们发现在Roquin-1/2缺陷的NKT2和NKT17细胞中显着增加了C-MAF表达，与PLZF水平无关（图7C.）。为了评估TCR信号对这些变化的直接贡献，我们分析了TCR近端衔接子ZAP70的磷酸化和进一步下游作用PLCγ（图7C.）。在Roquin-1/2缺陷的NKT17细胞中，细胞内TCR信号呈趋势降低，但它没有统计学意义。完全，我们的分析表明TCR信令不会因罗基蛋白-1 / 2蛋白的损失而显着影响。 IL-6与TCR信号一起强烈诱导C-MAF表达，通过Stat3（44）。但是，按照以前的数据（45），我们没有检测到在散装NKT细胞上的STAT3激活IL-6R的显着表达。 IL-6Rα链的完全或特异性烧蚀不会影响胸腺中的NKT细胞发育和子集分化，但它导致脾脏NKT细胞数增加（补充图4）。然而，与NKT1细胞相比，对照NKT2和NKT17细胞中的STAT3磷酸化增加（图7C.），表示另一个受体可能激活stat3。然而，这种受体或下游信号似乎不受鲁代蛋白调节，因为Roquin-1/2缺陷NKT1和NKT17细胞与对照相比，STAT3磷酸化略微降低（图7C.）。 NKT1和NKT17细胞之间的命运决定由转录因子Th Poxviruses和锌手指和Krüppel家族（Thpok）控制，其表达在NKT17细胞中强烈降低（34, 46）。除了NKT17细胞外，在所有子集中的罗基因-1 / 2中没有罗基因-1 / 2的情况下升高了THPOK水平，其中它们减少了它们（图7D），可能反映了它们对此谱系的强烈极化。

图7。

与TCR信号传导，NKT17细胞分化相关的分子分析，罗基因-1 / 2中的细胞凋亡–deficient NKT cells. (A）条形图显示指标胸腺NKT细胞群的归一化TCRβMFI对照或 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 老鼠。 MFI被标准化为对照小鼠的NKT1细胞的TCRβMFI，其设定为1.每个符号代表一个小鼠并从至少三个独立的实验中汇集了数据。 *p < 0.05, ns.，不重要，多个 t 使用HOLM-SIDAK方法进行测试。（B）代表性的轮廓图显示了NKT1，NKT2和NKT17细胞上的LY-6C表达。从两个独立实验中汇集了数据，数字表示LY-6C的平均百分比±SD⁺ 每个基因型至少4只小鼠的细胞。（C）对照的胸腺NKT细胞和 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 老鼠 were analyzed for expression of the intracellular transcription factors Egr2, PLZF, and c-Maf, as well as for phosphorylation of ZAP70, PLCγ和stat3。条表示指示细胞群的平均MFI。 MFI被标准化为TCRβ⁺ tetramer⁻设置为1.每个数据点代表从至少三个独立实验（PLZF和P-STAT3）或一个实验（EGR2，C-MAF，P-ZAP70和P-PLC的一个小鼠γ). Cells were acquired after MACS depletion of CD8⁺ thymocytes. (D）酒吧显示在分离的指示的胸腺细胞群中表达的细胞内THPOK的平均MFI CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 小鼠和控制。从三个独立实验中汇集了数据，每个数据点代表一个分析的鼠标。（E）从对照中分离胸腺NKT细胞 CD4CRE RC3H1-2^{F / F.} 7-AAD和Annexin V染色的小鼠分析细胞死亡。酒吧表示7-aad的平均百分比⁺ Annexin V⁺ DP细胞。每个数据点代表从三个独立实验中汇集的一只鼠标。（F) Roquin-deficient NKT cells were analyzed for expression of IL-7R α-chain（CD127）。酒吧表示平均mfi±SD标准化为TCRβ⁺ tetramer⁻设置为1.每个数据点的细胞代表一个从两个独立实验中汇集的一只鼠标。在收购之前，百里语（a–C) and (E) were depleted of CD8 by MACS. *p < 0.05, multiple t tests using the Holm–Sidak方法。 ns，不重要。

为了解决我们监测细胞死亡的NKT1和NKT2细胞的丧失，这揭示了Roquin-1/2缺陷和控制NKT细胞的细胞凋亡显着增加（图7e.）窝藏>90％的NKT17细胞。这表明Roquin-1/2不会直接影响细胞死亡，而是将NKT细胞分化引导到促进室中。 NKT细胞（ 47），特别是NKT17细胞，依赖于IL-7用于他们的发电，稳态和生存（48）。因此，对NKT17细胞的控制NKT17细胞比NKT1和NKT2细胞表达了更多IL-7Rα-链（CD127）。 roquin-1/2的丧失导致了NKT17细胞中CD127表达的选择性增加（图7F.），建议降低IL-7信号传导不会提高其增强的死亡倾向。

在一起，我们的数据表明EGR2信号和STAT3激活信号在Roquin-1/2缺陷的NKT细胞中降低。机制包括增强C-MAF表达的未定义信号，强烈驱动到NKT17谱系中，在那里更容易死。

Roquin Paralog缺陷NKT细胞在其细胞因子分泌能力中受到损害

NKT细胞亚群和细胞因子产生的分化还取决于通过雷帕霉素（MTOR）蛋白质复合物的机械靶标的信号传导（49）和消融负调节剂结核硬化剂1（TSC1）导致表型类似于罗基因-1 / 2损失引起的表型（50）。然而，与对照相比，我们没有发现Roquin-1/2缺陷NKT细胞中增加的MTOR信号传导。 MTOR或下游蛋白的磷酸化没有差异，例如4-EBP1（MTORC1）和AKT（MTORC2）（图8A）。 Roquin缺乏控制促炎T淋巴细胞的分化，以及它们的效应功能（图8D）（25, 51）。令我们令人惊讶的是，与对照相比，PMA /离子霉素刺激在所有Roquin-1/2缺陷的NKT细胞基集中显着降低了各种细胞因子产生的细胞细胞比例。图8B.）。此外，罗基因-1 / 2缺陷NKT17细胞中，每种细胞的细胞因子产生似乎较低（图8C.），而植物烧蚀后，常规效应器T细胞在罗金烧蚀后产生显着更具促炎细胞因子（图8D）。

图8。

通过MTOR的信号不促进罗基因-1 / 2的子集特异性细胞因子的减少–deficient NKT cells. (A通过流式细胞术分析细胞内P-MTOR，P-AKT（S473）和P-4EBP1蛋白的存在，分析胸腺NKT细胞。在MACS耗尽CD8后获得细胞⁺ 胸腺细胞。条形表示从两个独立实验（P-MTOR）或一个实验（P-AKT，P-4EBP1）汇集的平均归一化MFI，每个数据点代表一个分析的鼠标。多种的 t 使用HOLM-SIDAK方法进行测试。（B）代表性的轮廓图显示出从指示基因型小鼠分离的胸腺量的细胞因子产生的胸腺NKT1，NKT2和NKT17细胞。通过MAMS刺激CD8表达细胞耗尽的胸腺细胞，在具有10％FCS的完全RPMI 1640培养基中，刺激MMS和离子霉素。条形图显示IFN-γ的平均百分比⁺ NKT1, IL-4⁺ NKT2, and IL-17⁺ NKT17细胞，每个数据点代表一只小鼠汇集了总共三个独立实验。 ***p < 0.001, ****p < 0.0001, unpaired t test. (C）数据显示平均IL-17 MFI的IL-17⁺ 在MMA和离子霉素的治疗中，在蒙葡萄蛋白存在下，用PMA和离子霉素进行胸腺量的胸腺NKT17细胞。每个数据点代表一只鼠标;从三个独立实验中汇集了数据。 **p < 0.005, Student t test. (D）代表性的轮廓图显示IFN-γ和IL-17的CD4的产生⁺ Foxp3⁻ror.γt⁺ colon lamina propria lymphocytes of the indicated genotypes. Numbers indicate mean ±SD由一个实验的三只小鼠计算。 ns，不重要。

因此，与NKT17特异性标记的表达增加相反，ROQUIN-1/2缺陷NKT细胞显示出一种低于缺乏的表型，其特征在于整体有缺陷的细胞因子产生。

讨论

在胸腺中的开发期间，NKT细胞通过顺序阶段并成熟到功能不同的子集中。在本文中，我们表明RNA结合roquin-1和-2蛋白防止了NKT17谱系的过度分化。植物肺鸟缺乏的NKT17细胞的数量超过了它们的控制>10倍并表现出强烈增强的血统承诺。混合骨髓嵌合体证明NKT17偏振是细胞内在的，并且伴随着罗基因-1 / 2消融的Vα14iTCR的条件表达，表明在NKT细胞开发期间发挥着决定性的作用。

在NKT细胞开发期间，何时何时以及如何启动NKT17命运。我们检测到在roquin-1/2缺陷的NKT17细胞中的选择性PLZF下调和其他亚群中的正常水平。这对PLZF调节的因果作用辩论，因为在致死-7 miRNA缺乏中，增强的PLZF水平，从NKT1到NKT2 / 17的平衡会移至NKT2 / 17（52）。 THPOK中的消融或功能丧失导致CD8和DN NKT细胞的产生，其特征在于低NK1.1表达（34, 53, 54）。这与NKT17分化的剧烈极化齐头并进，也观察到，虽然在较小程度上，但在臭氧水平（34, 46）。 Roquin-1/2缺陷型胸腺细胞和NKT1 / 2细胞的升高的THPOK水平表明，NKT17细胞中的较低THPOK水平是由于在没有ROQUIN-1/2的情况下夸大的NKT17分化的结果，而不是原因。

在缺乏MTOR阴性调节器TSC1的NKT细胞中也检测到THPOK mRNA的显着降低（50），其显示类似的表型，包括显着的NKT17偏压和成熟胸腺和外周NKT细胞的减少。该表型归因于升高的MTORC1活性，降低了T-BET的表达和ICOS依赖性信号（50）。在我们的研究中，与对照细胞相比，我们没有检测到Roquin-1/2缺陷NKT17细胞中MTORC1或MTORC2途径激活的显着差异。此外，至少在CD8 T细胞谱系中，Roquin活性的丧失强烈增强了效应状态，其特征在于高T-Bet表达（24, 51）。在TSC1缺陷的NKT细胞中，降低的TBET水平可以促进高ICOS表达的转录获取，这有助于NKT17极化（50）。通过增强ICOS mRNA在Roquin-1/2缺陷的情况下，独立地实现了关于升高的ICOS和NKT17分化的类似结果。

ICOS，IL-6与TCR诱导的CA结合²⁺ signals (44），TGF-β（55）和IL-27（56）全部涉及C-MAF表达的调节。 C-MAF在Th17细胞中表现出特性过表达_FH. cells (42），并且，正如我们在本文中所显示的那样，NKT17细胞。 NKT细胞中的正常TCR信号强度反对在不存在Roquin-1/2的情况下提高C-MAF表达的TCR信号传导的作用。因为我们和其他调查人员（45）表明，IL-6R信号可分配用于NKT17的开发，似乎更有可能在开发NKT17细胞中触发C-MAF表达的细胞因子。 IL-27还诱导Roquin目标ICOS，反过来，这反过来放大C-MAF的表达（56）。 C-MAF通过直接增强RORγT表达并通过将含有含有含义的基因位点（Th17分化）结合并结合其结合伴侣SOX5T，与其结合合作伙伴SOX5T一起诱导IL-17产生的细胞命运。43），包括Roquin目标IRF4和NFKBIZ（25）。通过没有Roquin-1/2介导的前术治疗，可以加强在初始NKT17分化期间这些和其他靶基因的进一步激活这些和其他靶基因的进一步激活，导致其他亚群的牺牲产生NKT17细胞的产生。

我们不能提供对没有Roquin-1/2缺陷的外周NKT细胞的结论性解释。在T细胞中丧失Roquin常规引起的一般炎症环境可能导致周边鲁出血压-1 / 2缺陷NKT细胞的丧失。在我们的混合骨髓嵌合体中表达Vα14iTCR和大多数野生型T细胞的存在显着减少了一般炎症。这可能部分解释为什么成熟的roquin-1/2缺陷的NKT细胞可以在两个模型中的外围维持。

常规T细胞中羊氏官能团的丧失导致疾病导致效应T细胞极化和过量细胞因子产生（20, 22, 25, 38）。在引人注目的对比中，在消融roquin-1/2之后，所有NKT细胞亚群显示出亚特异性特异性细胞因子的产生减少，即在NKT17的情况下，与降低的STAT3磷酸化相关。 NKT细胞在开发期间获得内存T细胞和先天性细胞因子 - 生产能力的特征，似乎它们在其开发期间对自身抗原识别变得脱敏（27）。我们不知道无论roquin蛋白是否损失通过直接或间接手段通过NKT细胞抑制细胞因子。 C-MAF的上调是Roquin-1/2缺乏胸腺NKT细胞的一致特征。除了促进产生IL-17产生的T细胞亚群的分化之外，C-MAF在排出的CD4和CD8 T细胞中高度表达。 C-MAF的过度表达足以抑制CD8 T细胞细胞因子产生和抗肿瘤反应（57）。因此，高C-MAF水平可有助于罗基蛋白-1 / 2缺陷NKT细胞的钝化细胞因子响应。

NKT细胞是一种小TCR曲目限制糖脂识别群，其涉及大量的人类疾病，包括感染，自身免疫和恶性肿瘤。在发展期间，它们成熟到功能不同的子集中。在本文中，我们表明，后术后调节剂Roquin-1和-2在限制NKT17细胞的过度发育产生时发挥关键细胞内在作用。

披露

作者没有财务利益冲突。

致谢

我们感谢Julia Knogler和Martina Schmickl技术援助。荧光团标记的MCD1D PBS-57四聚体由国家健康大型核心设施提供。

脚注

该工作由Deutsche Forschungsgemeinschaft通过授予Schm2440-3和SFB 1054 A02（对M.S.）来支持。 J.C.V.和K.D.H.收到博士学位。助长安斯特Schering Foundation和Boehringer Igelheim的助学金。
本文的在线版包含补充材料.
本文中使用的缩写：
7-AAD
7-氨基酰胺霉素D.
DN.
双负数
DP.
双阳性
MFI.
中位荧光强度
MLN.
肠系膜淋巴结
MTOR.
雷帕霉素的机械靶标
PLCγ.
磷脂酶-Cγ.
PLN
外周淋巴结
PLZF.
早幼粒细胞白血病锌手指
sl
信号传导淋巴细胞激活分子
T_FH.
毛囊
Thpok.
th poxviruses和锌手指和krüppel家庭
TSC1
结核硬化症1。

已收到 2016年10月6日。
公认 2017年1月18日。

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