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- 图1。
MERS-COVS蛋白内免疫肿瘤区域的系统评价。合成覆盖MERS-COV的整个S蛋白的重叠肽（补充表I.). (A and B）将基质肽池与肽的不同组合混合以映射免疫肿瘤区域。肽池的T细胞常数的截止值表示为红色虚线。六种免疫原性肽 - 包含诱导高水平IFN-γ分泌的池（≥600SFC/ 106 脾细胞）通过彩色柱突出显示。通过池X15和Y15的交叉鉴定肽37（蓝色）。类似地，免疫原肽122（紫色）和142（绿色）分别由X28 / Y 2 2和X33 / Y32定义。 （C）合成不同的肽截短（显示在 表二）鉴定短的免疫原性CD8+ 肽37,122和142中的T细胞表位。通过使用来自MERS-COV S蛋白疫苗免疫小鼠的新鲜分离的脾细胞来评估缩短肽的T细胞应答。 （D）S蛋白的示意性结构显示细胞免疫肿瘤区域的分布。八个免疫肿仓区显示为红线，以及明确的短CD8 + T细胞表位被显示为蓝线。 HR1 / 2，七胚重复1/2; NTD，N终端域; RBD，受体结合结构域; SP，信号肽; TM，跨膜结构域。
- 图2。
基于结构的短抗原CD8的定义+ T cell epitopes. (A and B）肽37-1（a）和37-3（b）在H-2k的凹槽中的构象d 通过2显示Fo-FC电子密度图在1.0σ时轮廓。电子密度显示为在轮廓中观察的蓝网，α2螺旋以清楚地除去。 （C and D) The 2Fo-FH-2K提出的肽142-2和142-5的C电子密度图d。对于37-3或N-末端残余物P1-Ser的N-末端残余物P1-Lys，N-末端残基P1-SER未观察到142-5的电子密度。
- 图3。
H-2K的独特构象d 绑定到37-1时。 （A）在H-2K的结构中d/ 142-2，TRP73 (green) of H-2Kd 突出到凹槽中。亲6 肽142-2用作肽的M形构象中的二次锚定。 （B）肽37-1的主链显示为紫色环，侧链为紫色棒。肽37-1的P5-ILE用作肽中间部分的二次锚定残余物。 TRP.73 of H-2Kd在紫色棒和球体中显示，显示向上构象。 （C）肽37-1（紫色环）与来自所有先前确定的H-2K的肽（紫色环）的肽（紫色环）叠加d 结构（1VGK，2FWO，3NWM和4WDI）。只有锚定残留物的侧链在杆中示出。 37-1主链的较低位置由红色箭头表示。红场中的细节显示在（D) and (E）。 （d）凸出的C termini [（c）中的红平方]的上侧视图，显示H-2K呈现的肽37-1（紫色）的肽37-1（紫色）的构象差异d。 （e）TRP的协调73 of H-2Kd 用凹槽中的肽。 37-1的较长的P5-ILE侧链导致与TRP的空间障碍73 在H-2K的结构中d 当与其他肽结合时。
- 图4。
肽37-1的构象依赖性抗原性。 （A）通过使用来自MERS-CoV疫苗的新鲜分离的脾细胞，通过IFN-γ检测肽37-，37-1-和I5A（37-1的突变体，从ILE到ALA的位置） - 特异性T细胞应答。免疫小鼠。用cDNA pcaggs-s仅表达S蛋白的cDNA pCAGGS-S疫苗免疫PCAGGS-S，BALB / C小鼠;通过CDNA PCAGGS-S疫苗疫苗的蛋白质的素线免疫PCAGGS-S + RVV-SQ，BALB / C小鼠通过表达S蛋白质的素，然后通过染伤疫苗RVV-SQ携带患者的蛋白质的疫苗疫苗。 （B人体化细胞因子染色被操纵以检测肽特异性CD8+ T细胞。使用不同的肽作为刺激剂，以在测试前诱导IFN-γ的分泌。没有肽刺激（无PEP）的样品用作阴性对照。通过侧光散射/前光散射参数浇注淋巴细胞。 CD8.+ 随后选择T细胞用于分泌IFN-γ。 （C）MERS-COV特定的CD8+ 从接种疫苗的小鼠中染色的新分离的脾细胞中的T细胞用四聚体37-1（H-2K之间的络合物）染色d 和野生型肽37-1），I5a（H-K之间的复合物d 和突变的肽I5a）和w73a（H-2k之间的复合物d Trp73Ala突变体和野生型肽37-1）。通过侧光散射/前光散射参数浇注淋巴细胞。 CD8.+ 随后选择T细胞用于分析四聚体。 （D）对四聚体的统计分析+CD8+ 总CD8之间的T细胞+ T cells in (C). (E）分别在肽37-1和I5a的刺激下在体外培养来自接种疫苗的小鼠的脾细胞。在第9天，MERS-COV特定的CD8+ 通过四聚体37-1和I5a的染色分析T细胞系。 （F通过肽37-1和I5a分别通过体外培养建立的T细胞37-1染色的四聚体37-1染色的统计分析。 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
- 图5。
H-2K的构象偏移d depends on the Ile5 of peptide 37-1. (A）肽37-1和I5a至H-2k的结合d 通过体外重折叠阐明。肽具有与H-2K结合的能力d help the H-2Kd H chain and murine β2m在体外重折叠。在适当地重折叠后，MHC的高吸收峰具有45kDa的预期分子量，在Superdex 200 10/300GL柱上的估计体积为16ml。该轮廓标有67.0,35.0和14.0kDa的分子量标准的近似位置。通过重新折叠肽37-1和37-3来形成复合物，表明两种肽对H-2K的相当结合能力d。可溶性MHC I复合物通过复饱和形成，表明肽37-1和I5a至H-2K的相当结合能力d. (B）37-1,37-3和突变体I5a / MHC复合物的热稳定性，如CD光谱透露。这 Tm不同肽的s由灰色虚线50％展开的灰色虚线表示。 （C）W73对H-2Kα1螺旋的构象d 当绑定到i5a时与trp不同73 in the H-2Kd/ 37-1复杂。 TRP的实心构象73 在这两个结构中都显示通过2Fo-FC电子密度图在1.0σ时轮廓。 （D）用其突变体I5a（青紫环和棍棒）叠加肽37-1（紫色环和棍子）。突变的位置由红场表示。
- 图6。
对MERS-COV感染37-1特异性T细胞免疫的构象依赖性保护。 （A）鼠标模型中免疫，病毒攻击和病毒检测的流程图。用肽，IFA和GP96免疫时间显示为绿色箭头。 AD5-HDPP4的鼻内转导时间迅速产生MERS-COV感染的小鼠模型的时间表示为蓝色箭头。用MERS-COV感染的时间显示为橙色箭头。安乐死小鼠，评估病理学和检测病毒的时间显示为棕色箭头。体重测量的最后一天用黑色箭头表示。 （B）MERS-COV感染后小鼠的体重。与佐剂对照相比，观察到肽37-1-免疫基团的更快恢复。 （C）MERS-COV感染后小鼠肺的病毒滴度3d。在病毒感染前用不同肽或PBS免疫的小鼠组显示在不同的柱中。 *p < 0.05. (DMERS-COV感染后，小鼠肺和小鼠气管的组织病理学检查和小鼠的气管。切片用h染色&E.原始放大倍数，×100。
Peptide 位置 顺序 绑定分数（Bimas）a 37 S（289-306） Tikyysiiphsirsiqsd. —b 37-1 S（292-300） yysiiphsi.c 2400.0 37-2 S（291-299） kyysiiphs. 86.4 37-3 s（289-300） Kyysiiphsi. 3456.0 37-4 S（292-299） yysiiphs. 80.0 I5A S（292-300） YYSIAPHSId 2000.0 122 S（969-986） aipfaqsifyrlngvgit. — 122-1 S（972-980） faqsifyrl. 69.1 122-2 S（977-985） fyrlngvgi. 2400.0 122-3 S（977-986） fyrlngvgit. 60.0 122-4 S（976-983） sfyapepi. 240.0 122-5 S（976-986） sfyapepitsl. 960.0 142 S（1187-1204） tgssfyapepitslntky. — 142-1 S（1191-1199） fyapepits. 60.0 142-2 S（1191-1200） fyapepitsl. 2880.0 142-3 S（1190-1198） sfyapepit. 24.0 142-4 S（1190-1197） sfyapepi. 960.0 142-5 S（1190-1200） sfyapepitsl. — ↵a 估计H-2K的解离半次解离d 使用BIMAS程序计算的肽复合物（http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/index.html).
↵b 估计肽解离的半阶段>10 is not available.
↵c 图1D中的抗原肽是下划线的。
↵d 突变的残留物i>A is underlined.
范围 H-2Kd/37-1 H-2Kd/37-3 H-2Kd/142-2 H-2Kd/142-5 H-2Kd/I5A PDB代码 5GR7 5GSB 5GSX 5GSV 5GSR 数据处理 Space group P212121 P212121 C2 P2 P21 Cell parameters (Å) a = 50.0 a = 50.2 a = 102.6 a = 57.5 a = 50.353 b = 74.6 b = 76.0 b = 68.5 b = 45.9 b = 79.658 c = 121.1 c = 122.3 c = 145.1 c = 71.6 c = 122.706 α= 90.0. α= 90.0. α= 90.0. α= 90.0. α= 90.0. β= 90.0. β= 90.0. β= 106.8. β= 108.7. β= 90.3. γ= 90.0. γ= 90.0. γ= 90.0. γ= 90.0. γ= 90.0. Wavelength (Å) 1.54178 1.00000 1.54178 0.97915 0.97944 Resolution (Å) 50.0-2.4（2.49-2.40）a 50.0-1.8（1.86-1.80） 50.0-2.5（2.59-2.50） 50-2.0（2.07-2.0） 50-2.2（2.28-2.2） Total reflections 168,813 274,523 123,285 131,573 230,665 Completeness (%) 97.4（86.3） 98.9（97.9） 93.6（92.3） 96.8（96.8） 98.2（94.3） Rmerge (%)b 9（36.8） 7.2（36.8） 8.5（53.4） 15.2（125.2） 6.6（27.3） I/σ 24.7（4.3） 20.0（5.7） 15.0（2.3） 1.5（1.5） 20.5（5.7） 细化 Rfactor (%)c 20.1 19.3 19.5 20.0 20.3 Rfree (%) 25.7 22.2 24.2 25.2 23.1 r.m.s.d. Bonds (Å) 0.003 0.008 0.006 0.004 0.007 Angles (°) 0.696 1.171 1.083 0.911 0.773 Ramachandran map Most favored (%) 90.4 91.0 90.9 89.2 96.2 额外允许（％） 9.0 7.8 7.9 9.9 3.8 慷慨地允许（％） 0.6 1.2 1.2 0.6 0.4 Disallowed (%) 0 0.0 0.0 0.3 0.0
