抽象的
鞘脂是质膜的主要组分。特别地，神经酰胺用作复合鞘脂的基本建筑枢纽，而且作为膜结构域的组织者分离受体和信号弹素。由于鞘磷脂酶激活后，鞘磷脂蛋白击穿在多种受体中的连接之后是在质膜处释放的神经酰胺的主要源。这尤其适用于T淋巴细胞，其中富含氨酰膜微瘤的形成调节TCR信号传导。因为透明释放和再分配响应于受体结扎，进一步研究这些过程的新型工具迫切需要。为了满足这种需求，我们合成无毒，官能化的透明酰胺，允许生物正交咔哒反应荧光标签掺入的神经酰胺，从而研究富含神经酰胺的结构域的形成。 Azido功能化C.6 - 在T细胞中掺入血浆膜微膜和近端囊泡中并局存在血浆膜微膜和近端囊泡中。它们在TCR后分离成簇，特别是CD28连接，表明与T细胞活化相关的血浆膜结构域有效分类;这是对鞘氨酰胺酶抑制来消除的。重要的是，在掺入该化合物时，T细胞活化不会废除，其在使用固定细胞的基于AB的研究中被高效地排除免疫突触中心。因此，官能化神经酰胺是新的，高效的工具，用于研究在T细胞活化过程中的神经酰胺的亚细胞再分布。此外，它们肯定也适用于解决活细胞中快速刺激介导的神经酰胺释放的研究。
介绍
作为de Novo合成，复合鞘脂的崩解，包括鞘氨醇（SM）或挽救途径，包括氨基吡啶的结果，包括氨基吡吡喃，包括鞘磷脂。神经酰胺分子作为鞘脂途径中的轮毂作为鞘磷脂（Smapase），锡酰胺酶，神经酰胺激酶或葡糖糖基转移酶容易地转化，从而在稳态条件下保持神经酰胺水平（1, 2）。响应于特异性受体的细胞应激或结扎，它主要是因为激活氨酰胺凝集到微摩粉中的次数，从而局部改变细胞膜的生物物理性质（3–6）。富含透明膜微摩擦分离膜受体及其相关的信号组，而且影响膜曲率，从而促进囊泡卵尿精或内吞作用（4, 5, 7–9）。
合适的工具的可用性是可视化和分析鞘磷脂定位，贩运和脂质 - 脂质或脂质 - 蛋白质相互作用的先决条件。宫酰胺特异性ABS主要是主要用于固定细胞以避免靶分子的人工聚类（ 10, 11）。可获得固定和活细胞中富含神经酰胺的膜结构域的合成类似物，例如6 - （[N - （7-硝基苯-2-氧气-1,3-大学亚唑-4-基）氨基]己酰基）鞘氨醇（NBD-C.6--cer），一种用于可视化GOLGI隔间的标记物（ 12, 13）。然而，这些，在其脂肪酸或鞘氨醇链中携带庞大的荧光团，涉及膜架构，限制其潜在使用（14, 15）。
对于生物分子的研究，点击化化学的出现带来了强大的新工具来探测贩运，新陈代谢或较高分子复合物的形成（ 15–20）。点击化学使用含有末端Azido基团的化合物或炔烃，允许与合适的荧光团的生物正交反应。这意味着引入生物分子的必要修改，包括官能化脂质，是微创的，因此不干扰它们的生物学。到目前为止，使用炔烃化合物主要被限制为固定标本，因为铜离子的要求催化咔哒反应的咔哒反应是用活细胞的实验。最近，四嗪官能化C.6 - 酰胺形类似物（由终端修改 trans脂肪酸的环辛烯基团在无铜条件下成功标记，用来将Golgi隔室图像成像，而不会在活性HeLa细胞中扰乱其功能和架构（21）。然而，该化合物的掺入和标记动力学是缓慢的。当然，这限制了它在刺激刺激早期解决神经细胞积累，再分布和贩运的活细胞实验中的潜在用途，这在原发性细胞中尤为重要。因此，到目前为止，迄今为止，迅速将其迅速集成到细胞膜中并允许短，高效的生物正交点击标记的咔哒相似。因此，我们合成了氮杂官能化神经酰胺（ω-azido-c6 - Circamide [N.3-C6--cer]或ω-azido-c16 - Circamide [N.3-C16 - CERCER]）并在T细胞刺激后探讨其纳入休息和刺激的T细胞及其再分分配。
至于其他细胞类型，暴露于高水平的合成外源C.2/C6 芹菜还促进T细胞中的凋亡（22–24）。类似地，死亡受体结扎后的生理酸Smase（ASM）活化，其次是神经酰胺释放干扰TCR信号的继电器通过消除储存的CA2+ 进入，NF-AT激活，和IL-2合成（25, 26）。但是，在其他情况下，效果的激活似乎调节T细胞激活（27–29），表明刺激界面处的酰胺的量和/或分舱均需要紧密控制。为了支持这一假设，基于AB的检测研究表明，神经酰胺基本上被排除在已建立的免疫突触（是）的中心，有利于LAMELLUM（29）。
通过这项研究，我们建立了我们的新的氮杂官能化的芹菜属无毒，并且甚至在活化后，也能有效地掺入活T细胞的膜中，在标记后5分钟可以检测到它们。我们发现了n3-C6 - 血浆膜微膜和静息T细胞的近端囊泡。 TCR，特别是CD28连接后，将其分离成簇，该簇表示与T细胞活化相关的已知质膜结构域有效。镜像AB检测实验，n3-C6 - 从IS中心有效排除，而是累积在已建立的周边。这表明n3-C6 - 可用于活细胞中的神经酰胺膜结构域分区化研究。
材料和方法
化学合成
Azido-鞘氨酶n3-C6--cer，n3-C16--cer，和α-azido-c16通过在CH中加入叠氮化物改性脂肪酸（1当量）的溶液来制备 - Circlamide2CL.2 （60mL / mmol鞘氨醇）滴定鞘氨醇（1.00当量），羟基苯并三唑一水合物（1.20等式），1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺（1.20等式）的混合物。 N,N - 干CH中的二异丙基乙胺（1.8当量）2CL.2 （每Mmol鞘氨醇60mL鞘氨醇）在0℃的2小时内，然后在氮气氛下搅拌18-h搅拌。除去溶剂，通过柱色谱法（CH）纯化残余物（CH2CL.2/ MeOH 100：1）。
细胞培养和试剂
将来自健康供体的外周血单血细胞进行Ficoll梯度离心，用作原代人T细胞的源（富含尼龙羊毛柱）或单核细胞（通过塑料粘附分离）。通过含有10％Fcs和人GM-CSF（500u / ml; BERLEX）/ IL-4（250 U / ML; Miltenyi Biotec）的RPMI 1640中的培养物将单核细胞分为成熟的树突状细胞（DCS）。3-6 d然后在T细胞缀合之前加入24-h加入LPS（100ng / ml; sigma）并随后用超抗原（1μg/ ml 30分钟; seb; sigma）。主要人和Jurkat T细胞维持在RPMI 1640/10％FCS中。对于刺激，初级T细胞保持高密度（8×106 12孔板的细胞/孔）3-5d，或者，或者，与CD3特异性（克隆UCHT-1）和/或CD28特异性ABS（克隆CD28.2）一起温育（每1μg/ ml）（Becton Dickinson Biosciences pharmingen）48小时。当指示时，将细胞暴露于37℃（12.5μm; sigma）的细菌Smase 30分钟。
标记和共焦和结构化照明显微镜
共2×105 Jurkat或初级T细胞被广泛洗涤并重新悬浮在含有NBD-C的HBS中6 - Ccer（DMSO中的5毫米，如果没有否则，最终5μm; Life Technologies），n3-C6 - 或者n3-C16 - CERCER（ETOH中10mm的股票，如果没有陈述25μm），并在室温（RT）下孵育30分钟，用HBSS洗涤三次。对于点击反应，请点击-T alexa fluor 488 dibo alkyne（20μm;寿命）或dbco-sulfo-cy5（20μm; jena bioscience）5分钟，如果没有说明，并且细胞在室温下保持直到显微镜分析。初级T细胞遵循相同的进料和标记方案：当指出时，将饲养缓冲液加入Pluronic F-127（在DMSO [VWR International]中20％，最终浓度0.25％），当指出时，用抗CD3预孵育/冰上的CD28 ABS并转移到含有10μg/ mL抗小鼠IgG（Dianova）（在37℃的偶联）（1小时）的载玻片上，加入抗CD3 / CD28涂覆的Dynabeads（Invitrogen）或以比例与DC缀合通过捕捉到4：1l - 覆盖涂覆的载玻片（μ-幻灯片8孔，Ibidi）或8孔盖玻片（Labtekii; Nunc）。
使用孵育系统和40×Plan-Apochromat油目标（NA 1.4）和激光线488和633，使用LSM 780（Zeiss，Germany）进行共聚焦激光扫描显微镜成像。或者，LSM 700（德国Zeiss ）配备63×1.4油目的，并使用639个激光线。使用共聚焦激光扫描显微镜软件ZEN2012处理图像。当指示时，获取Z堆栈，并使用ZEN软件工具完成三维重建。对于簇定量，在AB在最大细胞扩散的Z高度的Z高度的刺激载玻片上进行25分钟的图像进行图像，并且计算每个细胞的簇。使用imagej分析图像，并且簇被定义为显示膜环的更高强度的信号。对于群体频率的统计分析，分析了至少三种供体的每个条件下至少150个细胞。 GraphPad 6.0软件用于图形和统计分析。
使用Zeiss Elyra S.1系统（Zeiss）进行染色Jurkat T细胞的结构化照明显微镜（SIM）成像。使用配备有平面膜浸泡物镜（63×，NA 1.4）的倒置AXIO观察器Z1显微镜获取SIM图像。 DBCO-SULFO-CY5用642nm固态激光激发并用PCO.EDCH 5.5 SCMOS相机（PCO）记录。用三个网格旋转和每个Z部分产生的Z叠，分离为100nm。对于SIM计算，使用软件ZEN 2012 SP1。使用FIJI软件实现了图像处理。
流式细胞仪
为了检测细胞死亡，将细胞与Pi染色溶液（5μL/试验; eBioscience）孵育或活性染料780（1：1000; eBioscience）在用官能化脂质进行处理后，并立即通过FacScalibur分析。为了检测神经酰胺掺入，将T细胞用未修饰的（C.6 - CER，C.16--cer; Avanti极性脂质），功能化（n3-C6--cer，n3-C16--cer），或nbd-c6 - 在室温下表示30分钟的浓度，使用抗神经酰胺IgM（1：1000; Enzo Life Science）在冰上洗涤并染色30分钟，然后用Alexa 488-uncogated抗IgM（1：1000; Thermo Fisher） 。当指出时，细胞在室温下点击5分钟。对于CD69的检测，将初级T细胞未经处理或用每种25μm神经酰胺（未改性或n3 - 官能化在室温下30分钟，用1μg/ ml抗CD3 / CD28或PMA /离子霉素（或不）刺激16小时，并使用抗CD69-联合粘蛋白（1:50;免疫池FRIESOYTHE）染色冰上45分钟。通过Dibo488点击，在16-H刺激期后控制官能化神经酰胺的掺入。加利福尼亚州2+ 在用25μm神经酰胺喂养的原发性T细胞中检测到动员（未修饰或n3 - 官能化）30分钟洗涤，用氟-4AM（1μm;分子探针，Thermo Fisher）加载30分钟，30分钟酯化（在37℃），并用20μg/ ml抗刺激通过在活细胞上浇注流式细胞术CD3 / CD28（用山羊抗小鼠IgG预期）（>分析所有人口中的94％）。
质谱
将神经酰胺处理的细胞收集并通过在冰上进行10分钟，溶解在1ml甲醇中。离心后（15,000× g2O / HCOOH，99.9 / 0.1V / v）和60％流动阶段B（CH3OH / C.2H3N / HCOOH，49.95 / 49.95 / 0.1，v / v）和样品注射后，A / B比在40/60保持3分钟，然后将线性梯度为95％B超过9分钟，将其保持在95％B 3分钟，然后返回40/60 A / B的1分钟梯度。 N3-C6 - CER，C.6--cer，n3-C16--cer和c16通过精确的质量检测到的 m / z. 439.3643， m / z. 398.3629， m / z. 579.5208和 m / z. 分别通过使用外部校准曲线来分别进行538.5194。用大规模猎人软件（安捷伦技术）进行量化。
统计分析
使用未配对的学生进行统计分析 t test with ****p < 0.0001, ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05.
结果
用于生物正交化学，毒性试验的叠氮化物官能化神经酰胺，含染料选择
为了在活细胞中获得生物正交标记的神经酰胺，我们合成了n3-C6--cer（图。1B）其中叠氮化物组可以通过生物正交点击化学与化学报告联系。 N3-C6通过碳二亚胺介导的酰胺偶联从ω-azido六烷基酸和鞘氨基合成。我们也合成了n3-C16--cer（图1C.）和α-azido-c16 - Cistamide（图。1D）用于稍后概述的一些实验中（30）。
改性神经酰胺类似物的结构。 NBD-C的化学结构6--cer（A），n3-C6--cer（B），n3-C16--cer（C）和α-azido-c16 - Cistamide（D）。圆圈标记叠氮化物的位置。
第一组实验相对分析了官能化神经酰胺诱导的毒性（n3-C6--cer）和nbd-c6--cer（图。1A）使用恒定浓度的化合物（25μm）随着时间的推移在Jurkat和初级T细胞中。虽然nbd-c6在孵化10分钟后，在孵化10分钟后，造成了大量的细胞死亡，这没有用n观察到3-C6 - 甚至在更长的曝光后（图2A）。此外，NBD-C的毒性6 - 但不是官能化化合物，似乎依赖于Jurkat和初级T细胞的浓度（图。2B，t = 30分钟）。值得注意的是，在测试的任何条件下，官能化化合物的毒性没有超过其未修饰的对应物的毒性（图。2B, 上部面板）。为了选择适合于活性T细胞的咔哒反应的功能化染料，我们将11种不同的染料分别在37℃下将具有11种不同染料的T细胞分别孵育30分钟并通过共聚焦显微镜进行分析。虽然一些染料容易被渗透到T细胞中并积聚在大聚集体中，但其他染料在染色中检测到其他物质，但被排除在活T细胞中（图3A, 表I.）。从测试的11个染料中，仅选择Dibo488和DBCO-磺基-Cy5用于生物正交咔哒反应，其在活细胞的无铜条件下进行。点击DIBO488或DBCO-SULFO-CY5至化合物显示出没有关于染色模式的染料相关差异（数据未显示）。咔哒标记化合物的检测似乎忠实地反映了包含的化合物量，因为标记强度是剂量依赖性和未缀合的（不可点击）炔染料，但未缀合的DBCO-磺酰硅染料扩散到胞质溶胶中（举例说明3-C6 - 在Jurkat细胞中; 图3B., 3C）。最后，点击后的产品未透露在孵化120分钟后在Jurkat T细胞中测定的增强细胞毒性（图2A）。
N3 官能化神经酰胺是T细胞的无毒。 （A）Jurkat（上部面板）或原发性人体T细胞（中间伙计）没有治疗（上 和 中间板，白色条）或用25μmn喂食3-C6--cer（黑条）或nbd-c6--cer（灰色棒）（上 和 中间板）在室温下，时间间隔或在室温下点击120分钟（底部面板，n3-C6 - Cercer'Inclicked'，Jurkat细胞），并通过流式细胞术确定死细胞的频率。显示了三个与SDS独立实验的手段。 （B）Jurkat（上部面板）或初级T细胞（中间伙计）用n喂食3-C6--cer（黑条），nbd-c6--cer（深灰色棒），或n3-C16在浓度下，用活力染料780（未处理的细胞，每个白色棒），在浓度下，洗涤和分析并分析的浓度为30分钟，并分析可活力。对于Jurkat T细胞，还评估了未改性神经酰胺的毒性（C6--cer：深灰色吧; C16--cer：斑点酒吧）。示出了三个实验的一个代表，如25μmNBD-C在25μm的活力检测中所例类6 - eeding，初级T细胞中的门控策略（底部面板）。 *p < 0.05.
Dibo488和DBCO-磺基-CY5被排除在活T细胞之外。 （A）Jurkat（上面面板）或原发性人体T细胞（下面的面板）暴露于Dibo488（左侧面板）或dbco-sulfo-cy5（右图）在室温下30分钟并通过共聚焦显微镜分析（显示代表实施例）。 （B 和 C）N.3-C6在所示（b）的浓度中施用，与Cyanin-3-alkyne染料（c）共同施用到Jurkat细胞和dbco-sulfo-cy5。以标准和优化的激光设置（A）分析信号。
将官能化化合物掺入T细胞中
接下来，在用进料期之后，在活靶T细胞中建立了官能化神经酰胺的掺入动力学和效率，然后进行了5分钟的荧光团偶联。使用流式细胞仪，我们比较了NBD-C6--cer-和n3-C6 - 喂养的jurkat t细胞显示n3-C6 - 在这些细胞中高效累积，饲料25分钟给出最佳结果（图4A）。我们通过质谱法验证了我们的流式细胞术数据证实n3-C6 - 在25分钟内高效地掺入Jurkat和初级T细胞中（大约70％，如pmol /样品所确定的; 图4B.）。
将外源神经酰胺掺入T细胞中。 （A）DIBO488-CONCULATED的积累3-C6--cer或nbd-c6通过在Living Jurkat T细胞上浇注流式细胞术，通过流式细胞术分析随时间随时间的量的--Cer（每25μm）。显示了三个实验的一个代表。 （B）n的含量水平3-C6 - 通过MS确定暴露于Jurkat或初级T细胞后25分钟。值在样本水平（左图）或在单细胞水平（右图）。显示了两个实验中的一个。 （C）用未修饰的伯氏细胞（c6 - CER，C.16--cer），功能化（n3-C6--cer，n3-C16--cer），或nbd-c6在室温下，在室温下表示30分钟的浓度，通过使用抗透明酰胺IgM Ab（未改性的神经酰胺）染色检测到透明糖掺入水平，在5分钟Dibo488咔哒（官能化神经酰胺）或直接（NBD-C.6 - 通过流式细胞术）。显示了SDS的三个独立实验。 （D）在用MS的未改性或官能化神经酰胺喂养后，在Jurkat或初级T细胞中测定掺入水平（PMOL / CELL）。显示了SDS的三个独立实验。
相对分析NBD-C的融合6 - ，未修饰（C6 - CERS和C.16--CER）和官能化神经酰胺，将它们在指定的浓度下送入初级T细胞30分钟，然后通过AB染色（未改性神经酰胺）检测，5分钟DIBO488点击（官能化神经酰胺），或直接（NBD- C6 - 通过流式细胞术）。只有C.6 - ，但不是c16被发现通过AB介导的检测并入（与EtOH溶剂对照相比）掺入（图4C.）。这表明c16在此时间间隔内，CENTER可能效率低下。相比之下，官能化和NBD-C6在稀释时，通过减少对照水平（具有或不带DMSO的DIBO488的信号良好的信号掺入。再次，n的含量为n3-C16 - 25μm的Ccer基本上低于短链神经酰胺（图4C.）。掺入C.16 - Circamides也低于C的 6 - 在Jurkat和初级T细胞中由MS确定时（图4D）。有趣的是，功能化增强了C的积累6 - catramides但强烈降低了c16 - 与未改性对照的相比（图4D）。
T细胞中官能化神经酰胺的可视化
30分钟后喂养n3-C6 - 和随后的dbco-sulfo-cy5点击，可以在血浆膜中检测特定信号，以及在Jurkat t细胞的细胞内隔室中，而预削3-C6--cer（染料在喂食前点击）主要积聚在细胞内隔室中（图5A）。排除特定信号源自n3-C6 单独脂肪酸（由于N的结果）3-C6 - CERCER击穿），细胞暴露于官能化脂肪酸，然而，这仅导致背景信号（图5B.）。用n喂养Jurkat T细胞3-C16--cer（Ω位置C的叠氮基团16）导致微弱的血浆膜和氏菌信号（图5C.），最有可能反映其低掺入（图4D）。有趣的是，N.3-C16 - 在α-位置C2（α-azido-C）官能化16 - 酰胺酰胺; 图。1D）在染料点击（数据未示出）之后无法检测到，最可能表明除了掺入效率之外，反应组的可访问性是官能化化合物适用性的重要决定因素。由于N的低掺入效率3-C16 - CERR，处理亚粒细胞再分配的研究我们的官能化化合物的短链氨酰胺进行。
N3-C6 - 可以在T细胞中有效和明确可视化。单击与DBCO-SULFO-CY5的反应进行（ A）喂食后3-C6--cer或之前（预折叠），（B）与含叠氮化物官能化脂肪酸的含量后的不存在或30分钟（c6）（b或b或 C），化合物ω-n3-C16--cer（n ..3-C16--cer）。显示了Jurkat T细胞的代表性实例。
为了分析官能化化合物的掺入模式是否与神经酰胺的掺入模式相似，我们监测了n的亚细胞分布3-C6--cer和nbd-c6在Jurkat T细胞中随着时间的推移。 NBD-C.6--cer（由于其毒性为5μm; Fig. 2）有效地积聚在血浆膜和高尔基室内（图6A, 上行）。然而，即使在这种低浓度下使用时，我们也观察到在孵育75分钟后与细胞完整性损失相关的实质性变化。这对n没见过3-C6 - Ccer（用于25μm），否则将结果与NBD-C相似6关于观察到的分布模式的动力学（图6A, 底行）。除了染色等离子体膜，n3-C6 - 在细胞内的尿布结构中累积（图6B., 补充图1）和一个由Golgi标记NBD-C为目标的隔间6--cer（图6C.）。
N3-C6在标记为Jurkat T细胞后，可以在早期可视化。 （A）NBD-C6--cer（5μm）和n3-C6--cer（25μm）（举例说明Dibo488标记的n3-C6通过共聚焦显微镜在Live Jurkat T细胞中随时间检测到。 （B）来自Jurkat T细胞的SIM Z堆叠的单个图像。将细胞与25μmn温育3-C6 - and stained after 30 min with 25 μM DBCO-SULFO-CY5 10分钟。用SIM卡直接测量活细胞。记录图像∼2 μm apart from each other in z dimension. (C）NBD-C6--cer和n3-C6 - CER（举例说明了DBCO-SULFO-CY5标记的n3-C6 - ) were coapplied to Jurkat T cells and detected after 60 min at RT. (A–c）显示了三种实验之一。
与Jurkat T细胞相比，未刺激的初级T细胞较少3-C6 - 进入他们的膜（图。 4B., 右侧面板, 7A）。微弱的n3-C6然而，通过在标记步骤期间的Pluronic F-127的补充，可以提高 - 特异性信号（图7A）。在高细胞密度下通过培养反应初级T细胞（31）还增强了标记效率，表明T细胞膜的激活诱导的改变可能促进使用官能化神经酰胺（图7C.）。符合这个假设，n3-C6 - CERCER标记效率在抗CD3 / CD28 ABS中的T细胞甚至比高密度培养在高密度培养后，这也适用于n的T细胞3-C16 - 标签。在同时刺激的T细胞中，n3-C6 - 在血浆膜和细胞溶质囊泡中累积（图7C.）。使用AB检测陶瓷（29），点击了3-C6在珠子刺激的T细胞中的接触平面下方的囊泡出现在囊泡中（图7C.， 箭， 补充图2）。
纳入N.3-C6 - 通过激活诱导的膜改变来分为原发性T细胞。 （A）N.3-C6在5分钟的DIBO488咔哒声之前在室温下的情况下，在初级人T细胞中施加到原发性人T细胞中，在乳房的不存在或存在下，通过共聚焦显微镜点击并分析（举例说明 上面面板）。通过流式细胞术分析培养物的特异性荧光强度（在没有Pluronic F-127的培养的强度设定为100％）。显示了三个实验的平均值。 （B）检测点击神经酰胺类似物的门控策略（例如n3-C6初级T细胞中的CER和DIBO488）。用单独的染料孵育的活T细胞检测到Dibo488（上面面板）或用25μmn喂食3-C6 - 持续30分钟，然后点击（底板）。 （C）N.3-C6 - 持续物体施加到人T细胞上留下未刺激的（新鲜）或通过致密培养（HD）开始激活5d，或用溶液（CO）（48小时）中的抗CD3 / CD28 ABS刺激或偶联或与珠子偶联（用于30分钟）（DB）（一个例子由星号表示），Dibo-488点击（上面面板）。成立n的n3-C6--cer和n3-C16通过流式细胞术（在每种群体中的染料阳性细胞上浇注）测定这些条件下的。显示了三个独立实验中的一个。 ***p < 0.001, **p < 0.01, *p < 0.05.
纳入N.3-C6 - CERCER不会影响T细胞激活，但在T细胞刺激后重新分配
我们旨在开发一种在刺激后监测T细胞中的神经酰胺再分分配的工具。因此，我们首先研究了官能化神经酰胺的掺入是否会干扰T细胞活化。用未改性或官能化C喂养伯氏T细胞6 - 或c16 - 标准条件下（25μm，30分钟），随后通过抗CD3 / CD28共刺激或PMA /离子霉素激活16小时。刺激诱导的CD69的上调不受官能化神经酰胺的影响，表明它们不会干扰早期的T细胞活化（图8A）。通过实验证实了，解决了暴露于未修饰或官能化的芹菜酰胺的T细胞的能力来动员CA2+ 响应CD3 / CD28连接（图8B.）。
用官能化神经酰胺进料不会干扰早期T细胞活化。 （A）初级T细胞留下未经处理的（白色棒）或用25μm的神经酰胺喂食（未改性：C.6--cer或c.16--cer，或功能化：n3-C6--cer或n3-C16通过抗CD3 / CD28或PMA /离子霉素刺激16小时，刺激30分钟，随后染色为CD69表面表达。 （B）抗CD3 / CD28诱导的CA2+ 在初级T细胞中检测到动员，留下未经处理的（灰色线）或用25μm的神经酰胺喂食（未改性：C.6--cer或c.16--cer，或功能化：n3-C6--cer或n3-C16通过流式细胞仪在活细胞上浇注30分钟，全部：黑线）（<所有人口中的94％））。显示了两个独立实验中的一个。
因为已知透明酰胺在T细胞激活期间也被生产并重新分配，所以我们研究了功能化的n3-C6 - CERCER将用内源性释放的神经酰胺释放成活化诱导的膜簇。为此，主要T细胞喂入n 3-C6在冰上保持15分钟，随后用抗CD3，抗CD28或抗CD3 / CD28 ABS刺激，通过涂覆在平面载体上，通过抗IgG将15分钟交联15分钟。伴随地，细胞在37℃下标记的Dibo488。每个刺激方案促进在血浆膜或近端的标记簇的形成（图9A和抗CD28刺激的细胞在三维重建中， 9C）。还通过SIM分析发现Jurkat T细胞（图6B., 补充图1），这些簇的大部分出现为膜 - 近端的囊状结构，可能代表从质膜内吞咽吞噬的氨酰胺（图9C.）。 CD3和CD3 / CD28共刺激导致展开响应与n的形成层延伸3-C6[再次表明神经酰胺饲料不会干扰早期T细胞活化的细胞。预计，单独连接CD28没有诱导细胞扩散（图9A，标记的细胞边界）。如定量分析所揭示，点击n的频率3-C6与未刺激的细胞相比，在刺激的情况下增加，表明官能化神经酰胺类似物的富含激活簇。结扎CD28后，这尤其明显（图9B.），其在质膜外叶片中促进ASM活化和神经酰胺释放（27）。支持n的假设3-C6 - CCER与释放的受体结扎后的内源神经酰胺，T细胞预暴露于ASM抑制剂Amitriptyline在CD28连接后大部分防止其再分布到活化簇中（图9D）。
N3-C6 - 在T细胞中具有激活簇的Coltegare。 （A）用n喂养的t细胞3-C6通过交联的CD3-，CD28-或CD3 / CD28特异性ABS未刺激或激活15分钟，并达到Dibo488点击。显示了三个实验中的一个。 （B）在（a）中描述的样品中确定群集频率;对每个条件分析至少150个细胞。 （C）（a）中所示的抗CD28刺激细胞的三维重建。 （D）在n之前预先暴露于amitiptyline或不30分钟的细胞3-C6 - 喂养和随后的CD28连接。对每个条件分析至少150个细胞;显示了+或-AMI的代表性图像。 （b和d）****p < 0.0001, ***p < 0.001.
进一步证实膜区域包含n的膜区域3-C6 - 确实代表了杂志富集的域，我们暴露了n3-C6 - 喂养T细胞到细菌血液并通过伴随的点击反应检测其再分配。细菌剧曝光后，n3-C6 - CERCER被募集成大簇，也观察到基于AB的内源神经酰胺（图10A）。
N3-C6 - CERCER与内源神经酰胺共同作用。 （A通过固定和AB染色30分钟暴露于细菌Smase后，检测氨基化膜域（左侧面板）或与n一起使用3-C6 - 和随后的点击（右侧面板）在Jurkat T细胞中。 （B）jurkat t细胞加载n3-C6 - CERCER和与抗CD3 / CD28涂层珠子缀合（左侧面板，伪是）或标记的初级T细胞到上沉粒加载的DCS（右图，是）20分钟。点击的分布3-C6通过分析10个是在三个单独的供体中进行评估的。 *p < 0.05.
此外，已经示出了透明酰胺被排除在DC和T细胞之间形成的中心，并且有利于膜 - 近端囊泡和共轭T细胞的层状物（29）。当含有官能化神经酰胺类似物的Jurkat或初级T细胞与共刺激珠粒（假致）或DC（是）（以DC）缀合时，有效地模仿这种图案图10B，N.3-C6含有圆锥体的囊泡及其分别是由箭头和箭头标记的外围累积，揭示了n3-C6 - 实际上代表了一种研究快速神经酰胺偏析和亚细胞贩运活细胞的合适工具。
讨论
鉴于其膜积聚和再分配的高动态，迫切需要多才多艺的，用于快速检测和追踪活细胞中鞘脂的无源工具。为此，允许通过铜催化的生物正交咔哒反应允许快速标记的偶氮官能化类似物非常适合，并且还因为末端可点击的炔烃是稳定的，并且不太可能对生物分子的物理化学性质稳定并且不太可能发生扰动物理化学性质（18）。通过这项研究，我们展示了我们的Azido功能化神经酰胺N3-C6 - CERCER在生物相关系统中满足这些标准。这种类似物的应用不会干扰活力，甚至更重要，激活T细胞。此外，它揭示了与稳压芹酰胺相容的亚细胞分布，并且在依赖性方式T细胞刺激时，最可能与内源神经酰胺重新分布。与四嗪官能化C相反6 - 最近用于在活的Hela细胞中对Golgi进行成像的 - 酰胺类似物（21），标记，从而检测n3-C6 - CERCER很快，从而使其成为一种新颖的，高效的试剂，以在刺激后早期研究生物细胞中的神经酰胺再分布。但是，官能化的长链神经酰胺（n3-C16 - CERCER）被证明在分析的条件下非常良好地纳入。因此，不能评估其作为化合物本身的细胞活力或反应性的能力，也不能用于研究刺激依赖性再分配（图。 2, 4, 5）。
我们经常应用n3-C6 - 浓度为25μm，表明时间间隔（Fig. 2）在我们手中，这对Jurkat和初级T细胞没有任何毒性（未经刺激或重复）。该浓度近似水平，以引起莫尔特-4细胞中的凋亡（c 6 - Circamide）和Jurkat T细胞（C2但是，仅在治疗4-6小时后（32, 33）。此外，c16 - 与Jurkat或初级T细胞一起温育2小时时，2小时孵育时不会引起可检测的细胞死亡，但观察到刺激膜突起的损失（34）。虽然我们不能在长期进料时排除干扰T细胞活力或激活，但我们没有在时间帧和浓度内使用叠氮化官能化的类似物对这些参数的任何影响。如我们稀释实验所示，这些化合物也可有效地用于潜在更敏感的靶细胞（Fig. 3）。
虽然仍然看到了血浆膜掺入，但是n3-C6在延长饲料后，也累积在细胞内隔室中，可以用Nbd-c复制6--CER，在所用条件下，标志着高尔基舱（Fig. 6）。符合以前与其他细胞类型进行的观察结果（35），nbd-c6当甚至在施用10分钟后添加到寿命法规T细胞时，也被证明是有毒的，这不是我们的化合物加入相同浓度的化合物（Fig. 2）。我们看到的形态学变化已经具有低浓度的NBD-C.6--cer（图6A）。观察到毒性的差异不太可能取决于在饲养期间的庞大荧光团缀合物的存在或不存在，因为在施用之前预涂布我们的化合物并未显着增加碘化丙烯酸铅的百分比+ 细胞即使在2-H施用期后（Fig. 2）。
正如NBD-C所透露6 - CERCER，其直接达到各种细胞中的GOLGI，主要转化为NBD-葡糖基胺，NBD-SM，NBD-神经酰胺-1-磷酸酯和NBD-叔烷酸，在2小时内，鞘脂类似物用作代谢的基材酶（35）。因为它们是微小的改性类似物，所以炔氧脂质也被证明是用于代谢酶的可靠底物（15）;虽然我们没有直接解决这个问题，但它很可能是n3-C6 - CERCER也进一步代谢。该代谢物还可涉及由神经酰胺合成酶催化的催化剂，这将导致官能化脂肪酸部分的损失（Fig. 1）。因为这必须发生在内质网中，这不是一个快速的过程，因此，很可能不会在我们进行的短期实验中发挥作用。该解释是通过n的掺入模式中的相似性进一步支持3-C6--cer和n3-C16 - CERCER，其不是常规基质用于重播（图5C.）。与脱乙酰化相反，n的潜在转化3-C6通过SM合成酶在Lumenal Golgi中的SM，如NBD-C所示6--cer（36），不会影响功能化分子的完整性。
我们已经将官能化神经酰胺应用于已知的高度相关的建立的刺激系统，以响应SMASE活化而涉及神经酰胺释放，以验证其适用于在细胞生物学实验中的应用。如在基于AB的实验中所见，模拟似乎被招募到Jurkat T细胞和初级T细胞中的簇，并且它被重新分布，最有可能与内源产生的神经酰胺，在TCR连接或CD28连接诱导的SMASE激活时较大的聚集体。或暴露在细菌剧中（ 图。 9A, 10A）。正如CD69，CA的高效上调所证明2+ 动员和TCR刺激后的传播响应（图。 8., 9A），模拟物没有消除信号传导或引起基于肌动蛋白的层状突起的失去损失，众所周知，在隙过度激活后发生（29, 34）。该化合物似乎被排除在is和pseudo-is（分别用dcs和刺激珠观察; 图10B），其与AB染色的固定缀合物中的发现一致（29）。正如积累的近距离覆盖的叠片结构所证明的那样（Fig. 7），来自IS中心的神经酰胺排除可能涉及内吞作用，这迄今未显示出在该界面处的鞘脂发生。
鉴于神经酰胺释放的重要性和其响应于受体的结扎响应于沉淀，还需要研究其动态再分配和与活细胞中靶蛋白的工具进行允许它们的快速和敏感的检测。然而，最重要的是揭示该工具在毒性，亚细胞膜隔室的定位方面产生了真正的鞘脂，以及刺激，但也将活化蛋白质依赖于活化簇中的血液化，并将其分类成囊状隔室。我们的Azido官能化神经酰胺类似物，证明了使用T细胞活化作为高度相关的模型系统满足所有这些标准，其中神经酰胺释放具有显着的监管作用。显然，本研究中验证的亚齐凡官能化神经酰胺目前可以广泛用作解决磷脂动力学的研究中的工具，响应于各种细胞的受体结扎。通过这些选择，我们的神圣模数可以高度乐于实验地解决了关于细胞膜中神经酰胺的动态重组和分子相互作用的重要问题。
披露
作者没有财务利益冲突。
致谢
我们感谢Ereich Bulbins，JürgenSchneider-Schiralies，Niklas Beyersdorf，以及Elita Avota的乐于助人的讨论和CharleneBörtlein，以获得优秀的技术援助。
脚注
这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft（Grant Ru2123）的支持。
本文的在线版包含 补充材料.
本文中使用的缩写：
- asm.
- 酸剧
- DC.
- 树突状细胞
- 是
- 免疫突触
- 小姐
- 质谱
- NBD-C.6 -
- 6-([N - （7-硝基苯-2-氧气-1,3-大学亚唑-4-基）氨基]己酰基）鞘氨醇
- N3-C6 -
- ω-azido-c6 - Circamide.
- N3-C16 -
- ω-azido-c16 - Circamide.
- RT.
- 室内温度
- SIM
- 结构化照明显微镜
- SM.
- 鞘豆蛋白
- smase.
- 鞘氨基氨基酶。
- 已收到 2015年11月23日。
- 公认 2016年3月2日。
- 版权所有©2016由美国免疫学家，Inc。
