抽象的
骨髓细胞在神经炎症疾病中的诱导和持续炎症中起着至关重要的作用，例如多发性硬化症。 miR-223，一种特异性细胞特异性细胞，是多发性硬化症患者中最具上调的microRNA之一。我们证明miR-223-kexpounut小鼠显示显着降低了活性和采用转移实验性自身免疫脑肌炎，其特征在于CNS中减少了粘粒体树突细胞（MDC）和Th17细胞的数量。敲除MDC具有增加的PD-L1和IL-1β，IL-6和IL-23表达，以及减少的驱动TH17，但不是TH1细胞分化的能力。因此，miR-223在自身免疫炎症期间控制MDC诱导的病理学Th17反应的激活。
介绍
血液衍生的髓样细胞在多发性硬化症（MS）中的CNS病变中浸润血管间白细胞的大量比例占渗透羽毛状白细胞（1）及其动物模型，实验自身免疫性脑脊髓炎（EAE）（2, 3）。这些APC能够吞噬髓鞘碎片并分泌细胞因子，促进CD4的扩张和极化+ Th1和Th17 T细胞在EAE的启动和进展中至关重要（ 2 ）。
Ly6c 你好 CD11b+CD11C.+ 单核细胞衍生的树突细胞（MO-DCS）是EAE中CNS渗透细胞的突出成分（2, 3）。 Mo-DC在迁移到发炎组织后的单核细胞中出现（4）。骨髓DCS（MDCs）负责在CNS内的EAE期间启动表位扩散，诱导TH17细胞的分化（2, 5, 6）。此外，LY6C 你好 树突细胞对于Th17极化至关重要（7 ）。
microRNA.s（miRNA）是通过诱导mRNA降解或干扰mRNA翻译（pROSE）调节基因表达的17-25nt的小非编码RNA。8）。超过60％的蛋白质编码基因由miRNA调节（9）。 miRNA调节各种生物过程，包括免疫细胞谱系承诺，分化，成熟和免疫稳态的维持（10），并参与癌症和炎症和自身免疫疾病的发病机制（11 ）。
小姐 患者组织的表达研究确定miR-223作为顶部上调的miRNA之一（12, 13）。 miR-223表达，主要限制在髓细胞上（14）显示调节中性粒细胞的增殖和激活（15）和m1巨噬细胞（16）。我们证明MIR-223通过控制MDC诱导的致病性Th17细胞的活化来调节EAE发病机制。
材料和方法
老鼠
雌性野生型（WT）C57BL / 6和MIR-223 - / - 小鼠购自杰克逊实验室，并在西北中心进行了比较医学的特定病原体设施。使用凋落物或WT C57BL / 6小鼠作为对照获得相同的结果。
活跃和转移EAE
注射了八个至十周龄的女性小鼠。 100μl含有200μg的乳液 结核分枝杆菌 H37RA（Difco，底特律，MI）和200μg米35–55 （格林斯科，加利福尼亚州）在侧翼上分布在三个地点。用于转移EAE，脾脏和腹股沟淋巴结在第8天收集的沼泽后 35–55 重新激活20μg/ ml米35–556 将细胞转移到受体小鼠中。在两种模型中，200ng Pertussis毒素（LIST，Campbell，CA）在第0天和2天内施用I.P，进行两种或三个独立的实验，至少有五只小鼠/组。 EAE的临床迹象每天被评估，如前所述（2 ）。
分离CNS白细胞
通过来自均质化的组合脑和脊髓分离的CNS-IMMUNE细胞通过均质组合脑和脊髓分离，并如前所述枚举（2 ）。
流式细胞仪分析
使用抗小鼠CD16 / 32（0.25μg; eBioscience）封闭FCRS，并且使用特定ABS（BD Biosciences或eBioscience）在4℃下染色30分钟的细胞。在活化的T细胞中（18小时，18小时，1μg/ ml离子霉素和20ng / ml PMA）和APCs（18小时，18小时，测定细胞因子表达）和10ng / ml 大肠杆菌 0111：B4 LPS）（Sigma）在2μg/ mL BrefeldIN A（Sigma）存在下。在BD Canto II上获得细胞并使用BD Facsdiva 6.1进行分析。
Th1 / th17细胞分化
纯化的CD4.+ 用CD4培养T细胞（≥90％）− WT或敲除（KO）脾细胞（作为APCs）加上α-CD3（1μg/ ml）在Th1促进中（200u / ml IL-2,10ng / ml IL-12,1μg/ ml抗IL- 4）或Th17-促进（10ng / ml TGF-β，50ng / ml IL-6,10ng / ml IL-23,100μg/ ml抗IFN-γ，1μg/ ml抗IL-4 1μg/ ml抗IL-2）条件并通过流式细胞术分析细胞因子表达。
骨髓单核细胞分离
CD11b+Ly6C 你好 单核细胞纯化（>来自骨髓的95％通过磁性电池分选（Miltenyi Biotec）。
定量实时PCR分析
CD11b+ myeloid cells, B220+ B cells, and CD90+ 使用磁性电池分选（Miltenyi Biotec）纯化T淋巴细胞。如前所述进行基因表达量化（15 ）。
统计分析
使用GraphPad Prism 5.0进行统计分析。学生分析了两种方法的单一比较 t 测试。对于多次数据，使用具有Bonferroni PostTest的双向Anova。这 p values <0.05被认为是显着的。
结果与讨论
MiR-223调节EAE病理学
我们观察到沼泽发病和严重程度的显着延迟35–55 - 在miR-223-ko与wt小鼠中诱导的EAE（图。1A），伴随着CD45的CNS浸润的减少 你好 CD11b+Ly6G−CD11C.+ mDCs and CD45 你好 CD11b−CD3.+ CD4+ T cells (图。1B）。巨噬细胞/单核细胞，嗜中性粒细胞，B细胞和血浆的数量没有区别（补充图1A）。我们观察到MO-DCS的显着减少（LY6 你好 ）在MiR-223-Ko小鼠的CNS中（图1C.）和CD4的百分比和数量减少+ IL-17+, CD4+ GM-CSF+, L-17+ / IFN-γ +和IL-17+/ gm-csf+ cells (图。1D, 补充图1B），确认LY6C的重要性 你好 CNS炎症中的MDCs（2, 6, 17 ）。
图1。
mir-223.的删除减少了EAE临床评分和CNS渗透的MDC和CD4+ T细胞。通过用沼泽的主动免疫接种，在C57BL / 6 WT小鼠和MiR-223-Ko小鼠中诱导EAE35–55 。 （ A）MiR-223-Ko小鼠显示与WT动物相比的临床评分显着降低。平均累积评分被计算为在实验期间观察到的日常临床评分术的总和（n = 6 mice/group). (B）CD45的数量 你好 CD11b+Ly6G−CD11C.+ mDCs, CD45 你好 CD11b+Ly6G−CD11C.− 巨噬细胞/单核细胞，CD45 你好 CD11b+Ly6G+Ly6C+ 中性粒细胞和CD45 你好 CD11b−CD3.+ CD4+ 在第18天后18天的EAE miR-223-Ko小鼠和Wt小鼠的T细胞（n = 3 mice/group). (Cly6c的比例 你好 在沼泽的CNS（脑和脊髓匀浆）中降低了MO-DC35–55 - 免除miR-223-ko小鼠与WT动物在第18天后解免疫（n = 3 mice/group). (D）IL-17-，IFN-γ-，GM-CSF和TGF-β表达CD4的百分比+ T cells in the CNS of EAE animals revealed a significant reduction in T cells producing IL-17–MiR-223中的相关细胞因子–KO animals compared with WT animals at day 18 postimmunization (n = 3只小鼠/组）。所示的数据代表在至少五只小鼠/组上进行的三个独立实验。 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
mir-223.在骨髓细胞中表达
CD11b+ 骨髓细胞具有最高的miR-223表达水平（图2A），表达在EAE期间上调，疾病发病和峰值的可比水平。 miR-223未在B和T细胞中表达。在转移EAE中，疾病发病是延迟，并且在WT MOG的MIR-223受者中显着降低了严重程度 35–55 - 特价CD4.+ T cells (图。2B）。总的来说，这些结果表明EAE启动所需的外周和CNS骨髓APC的MIR-223至关重要的作用。有趣的是，miR-223控制CXCL12的星形胶质细胞表达，一种吸引CD4的趋化因子+ T细胞和骨髓细胞（18），可以为在KO小鼠中观察到的降低的疾病严重程度和免疫细胞渗透来提供机械基础。
图2。
mir-223.在骨髓细胞中表达，在EAE期间上调。 （A）CD11B.+ myeloid cells, B220+ B cells, and CD90+ 从幼稚Wt小鼠和EAE小鼠的脾脏分离T细胞，在发病（第8天后解毒）和疾病的峰（第15天后期），和 mir-223. 通过实时PCR定量基因表达。在EAE发作和髓室内（白色条）中的EAE发作和峰值观察MIR-223基因表达的显着增加（n = 3-5只小鼠/时间点）。 （B）共20×106 MOG35–55 - 在第8天收集的脾脏和淋巴结，用沼泽的WT C57BL / 6只动物的后期解除35–55/ CFA被注射I.P.进入miR-223-ko或wt受体小鼠。 MiR-223 KO小鼠显示与WT动物相比的临床评分显着降低。所示的数据代表在至少五只小鼠/组上进行的两个独立实验。 ***p < 0.001.
在miR-223-ko mdcs中减少Th17-偏振细胞因子
PD-L1，但不是PD-L2，MDC和骨髓单核细胞的表达显着升高（图3A, 补充图2A）CD40和CD80表达在脾脏巨噬细胞/单核细胞上增强，但不是PDC的玉米35–55-primed ko小鼠（补充图2b）。这些结果基于MIR-223调节STAT1表达的事实（19），这是MDC上的PD-L1表达的关键调节剂（20）。来自KO小鼠的脾脏MDCs表达了IL-1β，IL-23P19和IL-6水平的显着较低，但IL-12P40和TNF水平与对照不同（图3B., 补充图2C）。来自miR-223-ko小鼠的脾巨噬细胞/单核细胞增加了TNF的表达，但脾脏Pdcs中的细胞因子表达没有差异。这些数据表明来自miR-223-KO小鼠的MDCs由于PD-L1增加，并且特别是Th17细胞而导致的，因为Th17促进细胞因子的表达减少（IL-1β ，IL-6和IL-23）。这些发现特别有趣，因为miR-223通过与3'未转换的区域结合调节roquin-1表达（21）。 Roquin-1是Th17相关细胞因子和Th17分化表达的重要调节因子（22），其损失导致IL-6的过度生产，并增加Th17细胞分化。表达植物蛋白中M199R突变的小鼠（ 扎祖 圣/圣 小鼠）开发自身免疫病理（23），并且罗氏蛋白-1显示在自身免疫中调节先天和炎症反应（24）。此外，miR-223调节炎症途径，细胞因子 - 细胞因子受体相互作用和通过TLR，JAK-STAT，FCεRI，NOD样受体和NF-κB途径的信号传导的基因（25）。我们目前正在评估这些机制中的哪一个参与MIR-223 MDC的监管。
图3。
来自mir-223的脾mdcs–KO mice express reduced levels of Th17-polarizing cytokines during EAE. At day 16 post-MOG35–55 免疫，MiR-223-KO小鼠和WT小鼠的脾脏均化，分离免疫细胞。细胞在CD11b上静态+B220−CD3.−CD11C.+ 通过流式细胞术分析MDC的谱。 （A）PD-L1和PD-L2的表达水平在WT小鼠的脾脏MDC上（左侧面板）和miR-223 ko小鼠（右侧面板）被检查了。 （B) IL-23p19, IL-1β在MiR-223中，脾脏MDC上的IL-6表达减少–KO小鼠与WT小鼠进行比较。 TNF和TGF没有区别β被观测到。显示的数据在两个独立实验中代表六只小鼠。
mir-223.-ko apcs无法驱动Th17细胞的差异
天真的CD4.+ 将来自WT小鼠的T细胞用抗CD3和CD4培养− 在Th1或Th17-驾驶条件下的幼稚WT或miR-223-Ko小鼠和T细胞分化的脾共全在第1,3和5天进行评估。在Th1偏斜条件下，虽然IFN-γ的百分比+ 在第3天，通过KO APC，WT和KO APC在第5天诱导相当数量的TH1细胞（图4A）。相比之下，KO APC能够诱导产生IL-17的生成和产生GM-CSF的Th17细胞的分化，几乎没有GM-CSF，据报道是EAE的病原过程至关重要的细胞因子（26），在第5天生产。在Th17条件下观察到的IFN-γ的低水平证实了Th17分化的特异性偏斜。
图4。
MiR-223的APCS–KO mice are deficient in driving the differentiation of Th17 cells. CD4+ T cells were purified from spleens of naive miR-223–Ko小鼠。用CD4将细胞与CD4共培养−来自Naive Wt小鼠或MiR-223的脾APC–KO小鼠在Th1促进（IL-2 [200u / mL]，IL-12 [10ng / ml]和抗–IL-4 [1 μg/ml]) (A) or Th17-promoting (TGF-β[10 ng / ml]，IL-6 [50ng / ml]，IL-23 [10ng / ml]，抗–IL-2, anti–IFN-γ, and anti–IL-4 [1 μg/ml]) (B） 情况。通过Live CD3分析IFN-γ，IL-17和GM-CSF表达的流式细胞术分析+ CD4+ 在1,3和5 d培养后进行T细胞。 APC的起源对Th1驱动条件中的IFN-γ产生的T细胞的分化没有影响。但是，在Th17驾驶条件下，CD4+ 与用WT APCs的共络合相比，T细胞在与MiR-223-KO APC相比的与MiR-223-KO APC相比，IL-17和GM-CSF表达显着降低。所示的数据代表三个独立实验。 *p < 0.05, ***p < 0.001.
集体，我们的结果揭示了MIR-223在MDC中的新作用，并强调其在通过控制Th17-偏振细胞因子的水平来调节Th17响应的诱导能力，它在CNS炎症中发挥作用的重要作用，包括IL-1β ，IL-6和IL-23。另外，miR-223可以参与调节在发炎环境中的Mo-DC中的单核细胞分化。在没有miR-223的情况下，C57BL / 6小鼠表现出显着较少的EAE临床症状和相关的外周衍生的CNS浸润性炎性细胞，证实了该miRNA在疾病病理学中的重要性，并鉴定了潜在的新型自身免疫监管目标。
披露
作者没有财务利益冲突。
致谢
我们感谢Eva Gottwein博士和Marc Manzano从西北大学进行洞察力讨论。
脚注
该工作得到了国家卫生研究院的支持NS-026543（S.M.）和CA149669（至B.Z.）。 I.I.由国家多发性硬化协会博士后团契FG 2065-A-1支持。
本文的在线版包含 补充材料.
本文中使用的缩写：
- EAE.
- 实验性自身免疫性脑髓炎
- ko.
- 昏死
- MDC.
- 米洛片DC.
- miRNA.
- microRNA.
- MO-DC.
- 单核细胞衍生的树突细胞
- 小姐
- 多发性硬化症
- PDC.
- 血浆谱DC
- WT.
- 野生型。
- 已收到 2015年9月8日。
- 公认 2015年12月22日。
- 版权所有©2016由美国免疫学家，Inc。
