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饮食脂质的长期摄入改变了LDLr的膜结构和T细胞反应-/- Mice

阿比盖尔·H·波洛克, 尼哥底母·特德拉, 莎拉·汉考克, 丽亚·康妮莉, 托德·米切尔, 杨正民, 马艾克·科克斯(Maaike Kockx), 罗伯特·帕顿, 杰里米·罗西(JérémieRossy) 和 凯瑟琳娜·高斯(Katharina Gaus)
免疫学杂志 2016年5月15日, 196 (10) 3993-4002; DOI: //doi.org/10.4049/jimmunol.1501261
阿比盖尔·H·波洛克
*2052,新南威尔士州悉尼,新南威尔士大学医学院,欧洲分子生物学澳大利亚实验室,单分子科学的节点;
†新南威尔士大学澳大利亚研究委员会高级分子成像卓越中心,悉尼,新南威尔士2052,澳大利亚;
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尼哥底母·特德拉
‡新南威尔士大学医学院,悉尼,澳大利亚新南威尔士2052;
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莎拉·汉考克
§2522,澳大利亚新南威尔士州卧龙岗市卧龙岗大学伊拉瓦拉健康与医学研究所;
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丽亚·康妮莉
*2052,新南威尔士州悉尼,新南威尔士大学医学院,欧洲分子生物学澳大利亚实验室,单分子科学的节点;
†新南威尔士大学澳大利亚研究委员会高级分子成像卓越中心,悉尼,新南威尔士2052,澳大利亚;
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托德·米切尔
§2522,澳大利亚新南威尔士州卧龙岗市卧龙岗大学伊拉瓦拉健康与医学研究所;
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杨正民
*2052,新南威尔士州悉尼,新南威尔士大学医学院,欧洲分子生物学澳大利亚实验室,单分子科学的节点;
†新南威尔士大学澳大利亚研究委员会高级分子成像卓越中心,悉尼,新南威尔士2052,澳大利亚;
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马艾克·科克斯(Maaike Kockx)
¶澳大利亚新南威尔士州康科德,康科德遣返总医院澳大利亚和新西兰陆军兵团研究所,澳大利亚2139;和
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罗伯特·帕顿
‖澳大利亚昆士兰大学分子生物科学研究所和显微镜与微分析中心,澳大利亚布里斯班,圣卢西亚,昆士兰州4072
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杰里米·罗西(JérémieRossy)
*2052,新南威尔士州悉尼,新南威尔士大学医学院,欧洲分子生物学澳大利亚实验室,单分子科学的节点;
†新南威尔士大学澳大利亚研究委员会高级分子成像卓越中心,悉尼,新南威尔士2052,澳大利亚;
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凯瑟琳娜·高斯(Katharina Gaus)
*2052,新南威尔士州悉尼,新南威尔士大学医学院,欧洲分子生物学澳大利亚实验室,单分子科学的节点;
†新南威尔士大学澳大利亚研究委员会高级分子成像卓越中心,悉尼,新南威尔士2052,澳大利亚;
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抽象的

尽管已经认识到T细胞中的脂质和膜组织会影响信号传导和T细胞活化,但在没有肥胖和炎症的情况下,饮食中的脂质在多大程度上改变T细胞的反应性仍是未知的。在这项研究中,我们为低密度脂蛋白受体敲除小鼠喂食了1或9周的西方高脂饮食,并检查了体内T细胞反应以及T细胞脂质组成,膜顺序和离体激活。我们的数据显示,长期高水平的循环脂质升高CD4+和CD8+T细胞增殖并导致CD4比例增加+诱导接触性超敏反应后,引流淋巴结内的中央记忆T细胞。此外,9周西方高脂饮食提高了总磷脂含量和单不饱和脂肪酸水平,但降低了T细胞内的饱和磷脂酰胆碱和鞘磷脂。循环中以及T细胞中脂质成分的变化也反映在离体活化T细胞活化部位的膜顺序增强,这与IL-2 mRNA水平升高相对应。总之,即使在没有体重增加和促炎环境的情况下,饮食脂质也可以调节脂蛋白受体敲除小鼠的T细胞脂质组成和反应。

介绍

现在,营养被广泛认为能够增强和抑制导致免疫功能改变的免疫反应( 1)。营养不良是全球免疫缺陷的主要原因,不仅与营养不足有关,而且还与特定的营养缺乏症以及饮食中大量和微量营养素的失衡有关(2, 3)。因此,营养不良不再仅仅是发展中经济体所关注的问题,而且还影响到西方社会,在西方社会,富含饱和脂肪的饮食,通常缺乏必需的营养素,导致肥胖病流行(4)。

肥胖患者免疫功能低下的证据越来越多,其中降低的抗体效价是一个很好的例子(5)。此外,这些患者的免疫反应性降低可能导致继发和手术部位感染的发生率增加,伤口愈合降低以及抗生素治疗所需的时间增加( 6, 7)。所有这些信息表明,饱和脂肪酸和胆固醇的过度消费是营养不良的一种形式,可能导致免疫力受损。

T淋巴细胞既是适应性免疫反应的调节剂又是效应细胞,因此在对抗病毒和细菌感染中起着至关重要的作用(8)。已经进行了大量研究来研究膳食脂质对T细胞功能的影响,临床和动物研究均表明,响应肥胖症,各种T细胞亚群的频率和功能能力发生了改变(9–13);对T细胞类花生酸合成,脂蛋白代谢/过氧化,基因和受体表达或膜流动性的修饰都是潜在的解释(14–16)。

尽管膜磷脂是从头合成的(17),从它们的饮食或这些饮食脂肪酸的衍生物中可以得到构成其疏水尾巴的许多脂肪酸(18)。因此,由于脂质在质膜上不断地被去除和替换,因此膜上的脂肪酸谱被认为对饮食具有很高的适应性(18)。膜脂质通过充当信号分子的前体,直接促进细胞信号传导(19),并通过形成富含饱和鞘脂,甘油磷脂和胆固醇的有序膜结构域来控制信号蛋白的时空组织20–23)。这些微区通常被称为脂质筏,它们在膜内的流动性较弱,凝结的区域较少,影响蛋白质的扩散并分隔信号传导过程(20–23)。因此,认为细胞膜内存在的脂质组成和脂肪酸饱和度会影响膜的流动性,进而影响T细胞信号传导(24)。

先前我们已经证明,破坏T细胞活化位点的膜凝结会抑制T细胞信号转导和体外下游效应器功能(25)。在这项研究中,我们研究了饮食脂质对T细胞脂质组成和膜顺序的影响以及这与体内和离体T细胞反应的相关性,特别是在没有肥胖和肥胖引起的炎症的情况下。在低密度脂蛋白受体敲除(LDLr)中引起接触性超敏反应(CHS)-/-)喂了9周的西方高脂(WHF)饮食的小鼠导致CD4增加+和CD8+ 引流淋巴结中的T细胞增殖以及CD4的增加+ 中央记忆T细胞。体内T细胞应答增强与这些细胞内总磷脂升高和胆固醇水平降低有关,以及磷脂酰胆碱(PC)和鞘磷脂(SM)的磷脂脂肪酸饱和度降低。从这些高脂饮食小鼠中分离出的T细胞表现出增强的膜秩序和IL-2 mRNA表达,以响应离体TCR激活。

材料和方法

动物和饮食

年龄和性别匹配的LDLr-/- (B6.129S7-LDLRtm1Her / J)和C57BL / 6J野生型(WT)小鼠在Australian BioResources Pty(Mossvale,NSW,Australia)繁殖。首先将6到8周大的小鼠维持标准的日常饮食(澳大利亚新南威尔士州Yanderra的戈登特种饲料),然后随机分配给WHF(特种饲料,Glen Forrest,华盛顿州,澳大利亚)或研究期间的标准食物。在无病原体的特定条件下,以12小时光照/ 12小时黑暗周期将小鼠关在笼子中五只。使动物自由获得食物和水,并在整个研究期间每周称重。所有动物工作均由新南威尔士大学动物保健和伦理委员会批准。

CHS的敏化

在喂食的最后一周,用25μl0.5%(v / v)的2,4-二硝基氟苯(DNFB; Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)在含有4的载剂中给小鼠剃光的腹部表面上漆: 1个丙酮/橄榄油(v / v)和1μg/ ml不含内毒素的BSA(Sigma-Aldrich)。第二天,在同一辆车中用0​​.25%DNFB重新粉刷腹部。在这两天中,仅用媒介物将对照小鼠涂在剃刮的腹部上。

引发CHS和评估耳肿胀

初始致敏后第5天,对照组和致敏小鼠的小鼠耳廓两侧均涂有20μl0.2%(v / v)DNFB,该介质中含有0.8μg/ ml无内毒素的BSA。对侧耳廓单独涂有20μl媒介物。耳涂后24小时,使用工程师的千分尺(日本东京三丰市)测量耳肿胀程度。进行两次测量并取平均值。如前面所述,通过从受攻击的耳朵的厚度中减去对照耳朵的厚度来计算耳朵肿胀的增量( 26),即(挑战耳朵-未挑战耳朵)/未挑战耳朵×100。

外周血收集

通过心脏穿刺收集外周血。然后将血液转移到未经处理的微量离心管中,并在室温下凝结1小时,然后在2000× g at 4°C持续15分钟。分离血清级分并保存在-80°C直到分析。

血清IL-6分析

按照所有制造商的说明,使用市售的小鼠IL-6 DuoSet夹心ELISA试剂盒解冻血清成分并测定IL-6水平(R&D Systems(明尼苏达州明尼阿波利斯)。

血清甘油三酸酯和胆固醇分析

解冻血清部分,并使用商业酶测定试剂盒(Wako Chemicals,Fuggerstrasse,Neuss,德国)测定总甘油三酯和胆固醇水平。为了监测每个测定的准确性,在收集的血清样本的旁边测试了异常对照血清(Fisher Diagnostics,Middletown,VA)。

收集和准备淋巴器官

通过仔细解剖除去左右腹股沟腹股沟淋巴结,收集每只动物,并收集在2 ml FACS缓冲液(1%BSA,PBS中0.1%叠氮化钠)中。立即使用精细天平称重淋巴结,并准备两个淋巴结的细胞悬液。简而言之,将组织置于六孔板中,切碎以通过1 ml塑料注射器柱塞末端在2 ml FACS缓冲液中的70 µm细胞过滤器(BD Biosciences,San Jose,CA)完全解离。 。然后将细胞转移至15 ml离心管中,加10 ml FACS缓冲液,以300× g 在4°C下5分钟,然后重悬于2 ml FACS缓冲液中进行细胞计数。使用Innovatis CASY细胞计数器(Roche Applied Science,Penzberg,Upper Bavaria,德国)计数细胞计数和活力。

表面标记的流式细胞仪

用于表面染色的mAb包括:抗CD3-Pe-cy7,抗CD4-V500,抗CD8-太平洋蓝,抗CD62L-FITC和抗CD44-藻蓝蛋白,均购自BD Biosciences。相关同种型对照用于所有实验(BD Biosciences)。每个样品10个6 淋巴结来源的单细胞用50μlMiltenyi Biotec FcR阻断剂(德国,Bergisch Gladbach,Rheinisch-Bergische Kreis)阻断10分钟°然后将细胞与上述单克隆抗体在黑暗中于4°C孵育30分钟。最后,将细胞用1 ml FACS缓冲液洗涤两次,然后重悬于300μlFACS缓冲液中进行分析。在收集当天使用BD Biosciences FACSCanto II或FACSVerse流式细胞仪完成细胞样品的采集,并使用FlowJo软件(TreeStar,Ashland,OR)分析数据。总共获得了50,000个事件。 CD4的比例+和CD8+ 淋巴细胞门内的T细胞亚群(70%T淋巴细胞,>每个7-氨基放线菌素D排除90%的存活率。进一步分析这些T细胞亚群的CD62L和CD44共表达,以分别区分幼稚和记忆细胞。 T细胞显示CD62L高CD44低 表型被认为是幼稚的,而CD62L低CD44高 细胞被称为效应物记忆T细胞。 CD62L高CD44高 被提名为中央记忆细胞(图3A)(27)。

T淋巴细胞的增殖细胞核Ag分析

为了确定响应体内DNFB攻击的增殖淋巴细胞的比例,可从eBioscience(加利福尼亚州圣地亚哥)购买抗与PE缀合的增殖细胞核Ag(PCNA)的mAb和相关同种型对照。 PCNA在细胞周期的S期表达更为丰富(28)。共10个6 如上所述,首先用Abs,抗CD3–Pe-cy7,抗CD4–V500和抗CD8–太平洋蓝对源自淋巴结的单细胞进行染色。然后将细胞在1 ml的2%多聚甲醛中固定2分钟,然后用1 ml的冷PBS洗涤。然后将细胞在-20°C下于1 ml 100%甲醇中孵育10分钟,再次离心,并用1 ml含0.1%Triton×100的PBS洗涤(赛默飞世尔 科学,沃尔瑟姆,马萨诸塞州。然后在室温下将细胞与抗PCNA Ab(0.125μg)或相关同种型对照在含有0.1%BSA的PBS中孵育30分钟。最后,将细胞用1 ml FACS缓冲液洗涤两次,然后重悬于500μlFACS缓冲液中,以便在BD Biosciences FACSCanto II或FACSVerse流式细胞仪上进行分析。再次使用FlowJo软件分析数据。作为该分析的阳性对照,使用5μg/ ml PHA(Sigma-Aldrich)在体外刺激了淋巴结来源的单细胞48 h,显示>80%PCNA阳性细胞。

脾脏T细胞的分离

死亡后立即除去脾脏,并将其置于RPMI 1640培养基(Invitrogen,Carlsbad,CA)或含0.5%BSA的PBS中。将脾脏置于装有收集缓冲液的10 ml培养皿中,并通过将脾脏通过70μm细胞过滤器和1 ml塑料注射器柱塞的末端分开来释放细胞。对于每个饮食组,然后将来自单个小鼠的细胞合并在50 ml离心管中,根据饮食产生单独的细胞悬液。然后在分离T细胞之前,使用尼龙羊毛纤维(Polysciences,Warrington,PA)或autoMACS阴性T细胞选择(Miltenyi Biotec),通过40μM细胞过滤器(BD Biosciences)过滤细胞制备物。分离的T细胞群体的纯度范围为85%至97%(平均约92%)。

脂质提取和质谱分析

分离后,首先使用内部细胞匀浆器在缓冲液(0.25 M蔗糖,20 mM HEPES,0.5 mM EDTA和两个蛋白酶抑制剂片剂在双蒸馏水中)中的冰上机械均质脾脏T细胞。然后,使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(赛默飞世尔特,马萨诸塞州沃尔瑟姆),确定匀浆的蛋白质浓度。使用Folch方法的改进方法,将全细胞匀浆的脂质提取物至少提取两次,每次三次重复制备(29)和甲基-叔丁醚萃取(30)进行比较。然后独立进行这些重复提取物的分析。使用Folch方法提取的样品的磷脂分析通过纳米电喷雾电离四极杆飞行时间串联质谱分析,并在Q-STAR Pulsar i(AB Sciex,Framingham,MA)上进行阳离子PC / SM前驱体离子扫描。使用Analyst QS 1.1(Applied Biosystems,Foster City,CA)测量所有光谱,并使用Lipid Profiler软件(AB Sciex)对照内标实现光谱分配和定量分析(31)。使用甲基丙烯酰胺提取的样品的磷脂分析叔在配备有基于芯片的自动纳米电喷雾电离源(TriVersa Nanomate; Advion Biosciences,Ithaca,NY)的混合三重四极杆线性离子阱质谱仪(QTRAP 5500; AB Sciex)上进行丁醚法。使用Analyst QS 1.5.1(AB Sciex)分析数据,并使用LipidView 1.3β软件(AB Sciex)对照内标进行光谱分配和定量。在Accela LC和自动进样器系统上,使用液相色谱-质谱法分析脾T细胞的胆固醇含量(赛默飞世尔 科学型)与LTQ Orbitrap XL质谱仪(赛默飞世尔 科学的(32)。所有数据均针对样品蛋白质浓度进行了校正。

Laurdan染色和脾T细胞活化

总计1-2×106 分离的脾脏T细胞在微量离心管中与37μC含5%CO的150μlRPMI 1640(含10%FCS和20μMLaurdan(Invitrogen))一起孵育30分钟。2 大气层。然后将细胞与5×10混合5 CD3ɛ和CD28 Ab包被的磁珠(Spherotech,Lake Lake,IL),在250×离心10 s g,轻轻重悬,并在37°C / 5%CO下再孵育10分钟2 大气层。终止细胞活化,并通过在PBS中加入等体积的8%多聚甲醛来固定细胞。然后将细胞在500μlPBS中洗涤两次,并重悬于80–90μlPBS中,使用Cytospin离心机(赛默飞世尔 科学)。

激活的脾T细胞的Laurdan成像

使用飞秒脉冲的Ti:Sapphire激光器(Mai-Tai; Spectra-Physics)在室温下,在反向共聚焦激光扫描荧光显微镜(SP5; Leica Microsystems,Wetzlar,德国)上以800 nm的双光子激发进行成像。 (加利福尼亚州圣克拉拉)和Leica Microsystems LAS软件-×63油浸物镜,数值孔径= 1.4。在400–460 nm和470–530 nm范围内同时检测到荧光。然后,如前所述,将Laurdan强度图像用于构建广义极化(GP)图像(33)使用ImageJ软件(美国国立卫生研究院,马里兰州贝塞斯达)。将伪彩色的GP图像与平均荧光强度图像合并,以保留结构信息。测量与珠子接触的细胞膜区域作为接触区(激活位点),而非接触区用于确定非激活位点的膜顺序。

离体T细胞活化和定量RT-PCR

要激活孤立的脾脏T细胞,请使用2.5×105 细胞在含有RPMI 1640的RPMI中孵育 l-谷氨酰胺,50 mM HEPES和2%BSA在装有10μg/ ml板结合抗小鼠CD3ɛ和CD28 Abs(eBioscience)的96孔平底细胞培养板中于37°C在5%CO中过夜2 大气层。每个三次重复使用4口井,总共10口6 细胞。过夜孵育后,将细胞用PBS洗涤两次,并将每个一式三份的四个孔合并在1 ml TRIsure(Bioline,伦敦,英国)中,然后在-80°C储存直至提取。共10个6 每个一式三份的非活化对照细胞均保存在1 ml TRIsure中,无需过夜孵育。然后使用NanoDrop分光光度计(赛默飞世尔 使用Agilent Technologies 2100生物分析仪(加利福尼亚州圣克拉拉)检查RNA的完整性。然后,按照所有制造商的指导原则,使用SuperScript III第一链合成系统(Invitrogen)将等量的RNA反转录为cDNA。最后,使用SensiMix SYBR试剂盒(BioRad,Hercules,CA)和RG-3000 Rotor-Gene热循环仪(QIAGEN,芬洛,荷兰)进行实时PCR。简而言之,使用的反应体积为20μl,其中包含10μlSensiMix SYBR,8μl无核酸酶水,0.5μl正向引物(10μM),0.5μl反向引物(10μM)和1μlcDNA。循环条件包括:在95°C下进行1次循环10分钟以激活聚合酶,在95°C下进行40次循环15 s,在56°C下进行30 s,在72°C下进行30 s,其熔解曲线斜率为60–95 ℃。使用Rotor-Gene 6软件(QIAGEN)计算阈值周期,并使用2来确定治疗组之间mRNA表达的相对变化。−ΔΔCt method (34)。将结果标准化为参考基因GAPDH和G6PDX的几何平均值,并相对于食物未活化样品的表达进行计算(35)。所有使用的引物列在 表一。对于每次RNA提取,一式两份制备cDNA,一式三份分析基因表达。阴性对照包括假反转录反应的扩增(不加酶温育)和不添加cDNA的反应混合物的扩增(数据未显示)。

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表一 定量RT-PCR引物

统计分析

两个数据集的统计显着性以不成对的方式评估 t 假设方差相等,则检验。使用单向方差分析或双向方差分析进行了多次比较,并进行了Sidak的后验。所有数据分析均使用GraphPad Prism软件(GraphPad Software,加利福尼亚州拉霍亚)进行。差异被认为在 p < 0.05.

结果

高脂饲喂LDLr-/- 小鼠可导致血清特征改变,但不会引起肥胖

为了区分体重增加/肥胖与循环脂质对T细胞功能的影响,我们寻求了一种模仿人类情况的小鼠模型,该模型对饮食变化高度敏感,但不容易体重增加。持续给C57BL / 6J WT小鼠喂WHF饲料会导致体重显着增加,但循环脂质仅适度升高(补充图1A,1B)。相反,LDLr-/- 饮食和背景相同的小鼠体重没有明显升高(图1A),但循环胆固醇和甘油三酸酯(图1B)。低密度脂蛋白-/- 小鼠是公认的模型,可以描述免疫系统在高脂血症环境中的作用(36),因为LDL受体表达的丧失对(例如)银加工和呈递没有直接或间接的影响(37),免疫接种或抗体生产(38)。因此,我们使用了LDLr-/- 小鼠进行了两个饮食挑战:一次急性干预,其中小鼠接受WHF饮食1周,另一个长期研究为9周。标准的日常饮食作为对照,WHF饮食中含有>与该配方相比,饱和脂肪酸含量高10倍。即使在9周后,19 LDLr-/- 相对于同一时期的18只食物,高脂饮食的老鼠体重没有明显增加(图1A),在整个研究过程中小鼠平均获得5 g的脂肪,这表明这些小鼠没有出现肥胖的表型。

图1。
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图1。

高脂饲喂LDLr-/-小鼠可导致血清特征改变,但不会引起肥胖。年龄和性别匹配的LDLr-/- 在指定的时间段内,给小鼠喂食物或WHF饮食,并在整个饮食研究中每周称重。通过心脏穿刺处死后收集血液,并分离血清分数。 (A) Starting and final body weights of individual mice fed a chow (○) or WHF (■)9周饮食;结果表示为平均值± SEM. (B) Mean serum triglyceride (TG) and cholesterol (Chol) levels (mg/dl) of each dietary group following 1 and 9 wk of feeding, chow (white bar), WHF (black bar). Data are accumulative from two independent experiments, each consisting of 9–每个饮食组10只小鼠。结果表示为平均值± SEM. ****p < 0.0001.

评估高脂喂养对LDLr的潜在促炎作用-/- 小鼠,我们测试了血清中的IL-6,IL-6是脂肪细胞分泌的关键促炎细胞因子之一(39)。喂食1周或9周后,在以普通食物或WHF喂养的对照小鼠血清中未检测到IL-6(n >每个饮食组和每个时间点6点),表明高脂饮食不太可能触发这些小鼠的全身性炎症(数据未显示)。血清分析显示LDLr中总甘油三酸酯和胆固醇升高-/- 与WT C57BL / 6J小鼠相比。此外,WHF饮食引起循环脂质的快速富集,用脂肪喂养的小鼠仅喂食1周后显示总甘油三酯和胆固醇血清水平升高(图1B, p <0.0001)。在9周的喂养期后,甘油三酸酯水平进一步升高,从而提高了3倍,而胆固醇仍比普通喂养小鼠高约4倍(图1B, p < 0.0001).

在一起,我们的发现表明,喂养LDLr-/- ≤9周的WHF饮食小鼠不会引起肥胖或全身性炎症,但会引起循环脂质快速富集。

低密度脂蛋白中长期高脂喂养不会改变CHS和对DNFB的刺激性反应-/- mice

在9周饮食干预的最后一周,我们使用了CHS的DNFB模型来评估高脂饮食和对照LDLr引流淋巴结中的T细胞反应-/- 老鼠 (图2A)。 CHS反应可分为两个阶段,称为敏化和诱导。敏化(激怒)阶段发生在与DNFB半抗原的初始皮肤接触期间,该阶段本身不会引起过敏,但局部应用会形成半抗原-载体复合物,该复合物充当新抗原并刺激引流淋巴结内的幼稚T细胞。 CHS的激发(有效)阶段是通过随后与相同的半抗原接触而发生的,刺激半抗原特异性记忆T细胞迁移至继发性皮肤接触区域,从而导致局部炎症。对于急性饮食挑战,在1周喂养期间进行CHS诱导。对于免疫挑战,每个饮食组均分为两部分,从而形成了针对每个饮食的对照组和CHS组(图2B)。

图2。
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图2。

低密度脂蛋白中长期高脂喂养不会改变CHS和对DNFB的刺激性反应-/- 老鼠。喂养1周或9周食物或WHF日粮的小鼠在第0天用0.5%DNFB敏化,在第1天用0.25%DNFB敏化;对照小鼠仅用媒介物致敏。在第5天,用0.2%DNFB攻击敏化(CHS)和非敏化(Ctrl)小鼠的耳朵;对侧耳朵仅靠车辆挑战。在24小时后(第6天),测量耳廓,处死小鼠,取出引流的腹股沟淋巴结,为每只动物汇集并称重;准备单细胞悬液进行计数。通过心脏穿刺处死后也收集血液并分离血清部分。 (A)概述体内挑战的时间表。 (B)用于体内挑战的治疗组。 (C)对于每个治疗组,每星期1和9周的饮食挑战,与用车辆涂漆的耳朵相比,用DNFB涂漆的耳朵的耳廓厚度平均增加的百分比。 (D)每个治疗组,1周和9周饮食挑战的两个腹股沟(引流)淋巴结的平均总重量。 (E)每个治疗组,1周和9周饮食挑战的两个腹股沟淋巴结中的平均总细胞数。 (F)每个饮食组,1周和9周饮食挑战的攻击小鼠的平均血清IL-6水平(pg / ml)。在(C)至(E)中,数据是来自两个独立实验的累积数据,每个实验组每个实验组由三到五只小鼠组成。在(F)中,数据是来自两个独立实验的累积数据,其中 n >每个饮食组和时间点6个。松狮犬(白条),WHF(黑条)。结果表示为平均值± SEM. *p < 0.05, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

通过用DNFB涂耳后24小时测量对照组和受攻击小鼠的耳部肿胀反应,可以成功地诱发超敏反应。在急性和长期饮食挑战后,两个饮食组均观察到明显的CHS反应(图2C)。喂食1周后,与高脂食物喂养的小鼠相比,高脂饮食挑战的小鼠肿胀降低(p <0.05);但是,在9周时间点,受挑战的食物和WHF喂养的小鼠之间没有显着差异(图2C),表明长期喂养对CHS反应性没有影响。此外,在任何一个时间点,对照组之间的耳廓厚度均无显着差异,这证实了WHF饮食未引起非特异性刺激或炎症(图2C)。 H还证实了CHS的诱导 &耳廓的E染色,显示在受到挑战的小鼠的DNFB处理的耳朵中明显的真皮水肿和细胞浸润。

为了进一步研究诱发后免疫反应的强度,我们在切除后直接称量引流的腹股沟淋巴结(图2D),并进行了总细胞计数以测量细胞活力(图2E)。与普通食物相比,在对照或挑战的WHF饮食小鼠中没有发现显着差异。

最后,我们在1周和9周时间点诱导CHS后,在攻击小鼠中测量了IL-6血清水平。在所有攻击组中均检测到IL-6,这表明由于DNFB在预致敏动物中的暴露而产生了IL-6。喂养1周后,高脂喂养小鼠的IL-6产量显着增加,IL-6水平分别为14±7.3 pg / ml和47±8.9 pg / ml(均值±SEM,从此处开始)分别在用普通食物和WHF喂养的小鼠中(图2F, p <0.05)。这表明,急性期高脂喂养可能会增强DNFB特异性炎症反应。相比之下,在进行9周饮食干预后,饮食组之间的IL-6产量没有差异,用普通食物和WHF喂养的小鼠平均分别产生31±12.5 pg / ml和17±5.0 pg / ml(图2F)。

这些结果表明,尽管1 wk的高脂喂养可能会对炎症反应产生影响,但在9 wk时,饮食组之间对DNFB的刺激性和过敏性反应程度相似。

长期高脂饲喂LDLr-/- 免疫攻击后,小鼠导致引流淋巴结中的T细胞反应过度

我们使用CHS模型通过流式细胞仪定量检测高脂饮食对体内T细胞反应的影响及其导致的血脂水平升高+和CD8+ 诱发CHS后引流淋巴结内的T细胞(图3A)。对于1周和9周时间点,效应记忆和中央记忆CD8+ 在重复实验中,T细胞反应有所不同(补充图2);因此,作为最好的代表,显示了来自重复实验的合并数据,并显示了效应物记忆/中央记忆CD8+ 合并T细胞群体(E + C记忆)。

图3。
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图3。

长期高脂饲喂LDLr-/- 免疫攻击后,小鼠在引流淋巴结中导致夸大的T细胞反应。进行了饮食干预和体内攻击,并为每只动物准备了一个淋巴结细胞悬液,如 Fig. 2。用荧光mAb将细胞等分试样染色,以通过流式细胞术鉴定CD4 / CD62L / CD44和CD8 / CD62L / CD44的表达。在另一个试管中,将细胞等分试样染色以鉴定CD4 / PCNA和CD8 / PCNA的表达。 (A)Ctrl引流淋巴结的代表性流式细胞术分析(上面板)和CHS(下面板) 老鼠。 (B 和 D)增殖CD4的平均百分比+ T细胞,中央记忆(C-Memory)CD4的平均百分比+ T细胞,平均占总CD4的百分比+ T细胞和CD4的绝对数量+ 每个治疗组(B)1和(D)9周饮食挑战的引流淋巴结中的T细胞。 (C 和 E)增殖CD8的平均百分比+ T细胞,效应子和中央记忆(E + C记忆)CD8的平均百分比+ T细胞,平均占总CD8的百分比+ T细胞和CD8的绝对数量 + 每个治疗组(C)1和(E)9周的饮食挑战的引流淋巴结中的T细胞。数据是来自两个独立实验的累积数据,每个实验组每个实验由三到五只小鼠组成。松狮犬(白条),WHF(黑条)。结果表示为平均值±SEM。 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.

喂食1周后(图3B, 3C),不更改DNFB专用CD4+ or CD8+ 饮食引起T细胞反应,但CD8的百分比除外+ T细胞,在WHF喂养的挑战小鼠中显示约3%的降低(26±0.5–23±0.9%)。但是,还应该注意的是,用WHF喂养的对照小鼠也发生了类似的下降(〜3%; 34±0.7–31±0.6%)。该发现表明在那个时间点循环脂质水平的增加没有改变T细胞的反应性。相比之下,免疫攻击后9周高脂喂养导致T细胞反应的放大(图3D, 3E),使用WHF喂养的小鼠的CD4增殖量约增加5%+ T细胞从13±0.7%增至18±1.0%,增殖CD8增加约4%+ T细胞,从6±0.4%到10±0.8%(图3D, p < 0.001; 图3E, p <分别为0.0001)。增强的细胞增殖导致中央记忆CD4的比例增加+ T细胞,从〜10 + 0.6%到〜4 + 0.8%(图3D, p <0.01),而记忆CD8没有明显增加+ T cells occurred (图3E)。但是,尽管内存CD8没有明显增加+ 在汇总数据中观察到T细胞,这很可能是由于CD8的差异+ T细胞反应,CD8的中央记忆增加了约8%(9±1.2–17±3.0%),效应物记忆的增加了约3%(9±0.4至12±1.0%)+ 在实验1和实验2中分别观察到T细胞(补充图2C,2D, p < 0.05).

尽管中央存储CD4的比例有所增加+ 9周高脂喂养后的T细胞,CD4总数+ 引流淋巴结内的T细胞未增加(图3D)。我们观察到CD4的比例降低了约5%(36±0.4–31±0.8%)+ WHF喂养的对照小鼠的引流淋巴结内的T细胞可能是这一发现的原因(图3D, p < 0.001).

我们的数据表明9周高脂喂养导致引流淋巴结中T细胞反应升高,这不是由于体重增加或全身性炎症引起的。为了支持这种观察,CHS(补充图1C)高脂喂养16周后在C57BL / 6J WT小鼠中对T细胞反应性没有影响(补充图3),尽管体重明显增加。因此,数据表明观察到的升高的T细胞应答与这些细胞暴露于由WHF饮食产生的循环脂质的改良利用度有关。

长期高脂饲喂LDLr-/- 小鼠改变T细胞脂质组成和T细胞脂肪酸饱和度

为了使扩增的T细胞应答与体内观察到的饮食诱导的T细胞脂质组成和脂肪酸谱变化相关,我们分离了脾T细胞并通过质谱分析了它们的脂质含量。对于9周的饮食干预,我们分析了主要磷脂类PC,SM,磷脂酸(PA),磷脂酰乙醇胺(PE),磷脂酰甘油(PG),磷脂酰丝氨酸(PS)的总量并计算了摩尔百分比和磷脂酰肌醇(PI)以及胆固醇。对于1周的饮食挑战,我们分析了最丰富的磷脂,PC以及SM和胆固醇的总量,并计算了其摩尔百分比。

用WHF饮食1周后,这些小鼠的脾T细胞总量没有增加(图4A)或百分比(图4B)的磷脂或胆固醇,与饲喂含有80±1.5%的磷脂和20±1.5%的胆固醇的食物的小鼠的T细胞相比。相比之下,与高脂喂养小鼠的T细胞相比,9周高脂喂养显着增加了WHF喂养小鼠T细胞内磷脂的绝对含量(图4A, p <0.001),导致磷脂与胆固醇的比例发生变化(图4B)。此外,在高脂饲喂9周后,观察到PE的百分比增加了约6%(〜10 + 1.6–16 + 1.1%)(图4B 插图 p <0.05),这与〜4%的增加相关(〜80 + 1.2–84 + 0.7%, 图4B, p <0.05)的总磷脂和约4%的细胞胆固醇降低(〜20 + 1.2–16 + 0.7%, 图4B, p < 0.05).

图4。
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图4。

长期高脂饲喂LDLr-/- 小鼠改变T细胞脂质组成和T细胞脂肪酸饱和度. 在饮食干预和体内挑战后,如 Fig. 2在处死时收集每只小鼠的脾脏,并为每个饮食组合并。然后制备单细胞悬液,并分离T细胞。将分离的T细胞匀浆,测定蛋白浓度,并提取脂质用于质谱分析。 (A)主要数据是在指定的时间点喂食普通食物或WHF饮食的小鼠脾T细胞中总磷脂(PL)和胆固醇(Chol)的倍数变化。插图:喂食或WHF饮食的小鼠脾T细胞中PC和SM(1周),PC,SM,PA,PE,PG,PS和PI(9周)的倍数变化。 (B)主要数字,是在指定的时间点喂普通饮食或WHF饮食的小鼠脾T细胞中总PL和Chol的百分比组成(所分析的总脂质的摩尔%)。插图为喂食粗饲料或WHF饲料的小鼠脾T细胞中PC和SM(1周)以及PC,SM,PA,PE,PG,PS和PI(9周)的百分比组成。 (C)以食物或WHF饮食,9 wk饮食刺激的小鼠的脾脏T细胞内含有0、1,或2+双键的PC种类的百分比(占总PC的mol%)。 (D)在9周的饮食刺激下,以普通饮食或WHF饮食喂养的小鼠的脾T细胞中,含有0、1,或2+双键的SM物种的百分比(占总SM的摩尔%)。对于1周的数据,数据代表一个实验,每个饮食组包括3个技术重复。对于9周的数据,数据是来自两个独立实验的累积数据,每个实验由每个饮食组三个技术重复组成。周(白条)和WHF(黑条)。结果表示为平均值±SEM。 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.

更详细地检查了9周饮食干预中T细胞中的PC,SM,PE和PS,我们观察到高脂喂养小鼠的细胞内饱和PC物种的百分比降低了(图4C, p <0.05)和单饱和脂肪酸的显着增加(图4C, p <0.01)。这种趋势反映在SM成分中,饱和SM种类显着减少,单不饱和SM种类增加(图4D, p <0.05)。 9周高脂喂养后,观察到单个PC和SM物种的丰度以及PC和SM脂肪酸酰基链长度的微小变化(数据未显示)。在饮食组之间未观察到PE或PS组成的差异(数据未显示)。我们还检查了多不饱和脂肪酸(例如, n-3与 n-6),但在任何饮食干预后均未发现T细胞水平有差异(数据未显示)。

我们的数据表明,饮食干预与循环脂质的相应变化具有改变T细胞膜脂质组成的能力。与来自食物喂养的小鼠的T细胞相比,来自食物喂养的WHF小鼠的T细胞的绝对PL明显增加,而胆固醇的比例却降低了。这一发现表明这些细胞不仅增加了它们的膜含量,而且改变了它们的膜组成。体内观察到的增强的T细胞反应可能是由于T细胞脂质组成的变化所致。通过在高脂喂养16周后检查C57BL / 6J WT小鼠的T细胞脂质组成,这一观点得到了进一步强调,这说明循环脂质的适度变化以及对体内T细胞反应的影响均没有与普通食物相比,它们不会改变PL和胆固醇的比例或绝对含量( 补充图4)。

长期高脂饲喂LDLr-/- 小鼠导致膜秩序增加和离体T细胞活化

为了确定观察到的T细胞脂质组成的变化如何可能转化为质膜顺序改变,我们使用Ab包被的磁珠激活了脾T细胞,并使用Laurdan显微镜在接触区域测量了膜顺序( 40)。 Laurdan是一种极性敏感的膜染料,其发射波长取决于水渗入膜的程度。在流体膜中,水可以部分渗入脂质双层,而在高度有序的膜中,水被大量排除。因此,发射光谱的比例定量(称为GP)是膜阶数的度量,其中GP值为-1表示最易流动,而+1表示最有序(33)。

与非接触区相比,Laurdan荧光显示与抗CD3 / CD28包被的珠相接触的质膜区域的GP值明显更高,这表明在珠-细胞接触位点的膜凝结(图5C, p < 0.01, p <0.0001,分别是chow和WHF)。更重要的是,从喂养WHF达9周的小鼠中分离出的细胞在活化部位的平均GP值要比来自普通喂养小鼠的细胞高得多,这表明由于细胞脂质组成的改变,膜的凝结增加了(图5C, p < 0.01).

图5。
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图5。

长期高脂饲喂LDLr-/- 小鼠导致膜顺序增加和离体T细胞活化。经过9周的饮食干预和体内攻击后,收集了每只小鼠的脾脏,并按照 Fig. 4. Isolated T cells were stained with Laurdan dye, and activated using anti-mouse CD3ε/CD28 Ab–包被的珠子,并通过双光子显微镜测量膜序。分离的T细胞也与板结合的抗小鼠CD3培养ɛ/CD28 mAbs overnight and IL-2 mRNA production evaluated by quantitative RT-PCR. (A 和 B)(A)cho和(B)WHF喂养的小鼠的细胞的代表性伪彩色GP图像;根据显示的比例伪彩色。珠-细胞接触区和非接触区的GP值由膜突出显示的区域确定。 (C)来自中国(○)和WHF喂养(■)小鼠的活化T细胞的非接触和接触区的GP。每个符号代表一个单元格中的测量值; n = 11–每个治疗组12个细胞,来自两个独立实验的代表。结果表示为平均值± SEM. (D)(由白条)和WHF喂养(黑条)小鼠的未激活(Ctrl)和激活(Act)T细胞产生的IL-2 mRNA的相对丰度。将IL-2 mRNA表达相对于参考基因GAPDH和G6PDX的几何平均值进行标准化,并相对于食物未活化样品的表达进行计算。 cDNA重复生成,数据代表在每个饮食组的一式三份样品上进行的三个定量RT-PCR。结果表示为平均值±SEM。 **p < 0.01, ****p < 0.0001.

膜凝结在T细胞信号传导中起着至关重要的作用(26),而T细胞生长因子IL-2的产生直接取决于多个T细胞信号传导途径和转录因子的激活(41)。因此,为了评估TCR信号转导的功能后果,响应高脂饮食诱导的激活位点处膜凝结的改变,我们通过定量RT-PCR测定了激活的脾T细胞的IL-2基因表达(表一)。通过CD3 / CD28进行刺激后,来自进食WHF的小鼠的细胞的IL-2 mRNA表达相对于来自进食进食的组的细胞的IL-2 mRNA表达增加了约1.5倍,这表明来自WHF进食的细胞中的信号转导可能增强了老鼠 (图5D, p < 0.0001).

总的来说,这些结果表明,我们观察到喂食9周后WHF喂养的小鼠T细胞膜脂质组成的变化导致活化后膜组织和IL-2响应发生改变,这可能导致信号转导和扩增增强体内T细胞对免疫攻击的反应。

讨论

临床数据表明,肥胖会影响T细胞免疫力。然而,关于饮食中的脂质是否直接影响T细胞活化和反应性知之甚少。通过摄入膜脂质组成和结构的变化继而影响TCR信号传导并进而影响T细胞活化,饱和饮食脂肪的高摄入量可能会引起T细胞功能的改变。以前的啮齿动物饲喂高脂饮食的研究表明,血清脂质成分发生了变化( 42, 43)和整个脾T细胞(42–44),这对应于体内和离体T细胞增殖以及IL-2信号通路的增强(44)。

我们证明了喂LDLr-/- 9周高脂饮食的小鼠导致CD4升高+和CD8+ T细胞增殖和CD4比例增加+ CHS诱导后,引流淋巴结内的中央记忆T细胞。这种增强的T细胞反应是在没有任何体重增加或IL-6产生的情况下发生的,这表明饮食诱导的促炎环境不会引起T细胞反应的改变。这是因为LDLr-/- 与LDLr相比,用WHF饮食喂养的小鼠体重和脂肪量较少+ / + 具有相同背景的小鼠,因此不易出现肥胖症和肥胖症引起的炎症(45–47)。有趣的是,1 wk的急性饮食干预不会改变CHS中的T细胞反应,这可能是因为WHF饮食1 wk后T细胞的脂质组成没有改变和/或由于对WHF的先天炎症反应增强(极化)急性高脂喂养(48),但以较低的T细胞反应为代价。

低密度脂蛋白-/- 小鼠不具有LDL受体,因此肝脏和其他细胞类型无法从血浆中去除富含胆固醇的中等密度脂蛋白和LDL,从而导致循环脂质的积累(49, 50)。在免疫反应方面,LDL受体的基因缺失对Ag的加工和呈递没有影响( 37),免疫接种和抗体生产(38)或病毒诱导的免疫病理学(51)。 LDLr中脂质从循环中的清除率降低-/- WHF饮食1周后,小鼠已经很明显,与先前报道的高脂血症相对应(47, 52)。但是,循环脂质水平的这种急性变化不足以实质性地改变T细胞脂质的组成或对免疫激发的反应,这表明仅循环脂质水平的升高并未增强T细胞反应。我们还注意到,尽管LDLr中存在高胆固醇血症-/- 老鼠 on a WHF diet (53–56),即使9周后T细胞中的总胆固醇水平也没有增加。相反,高甘油三酯血症(54)似乎已经改变了喂食9周后在WHF喂养的小鼠中T细胞的磷脂和脂肪酸组成。因此,饮食中的脂质可能会影响T细胞中的磷脂代谢,但对T细胞胆固醇代谢的影响很小。我们的C57BL / 6J WT数据进一步说明了这一想法,该数据清楚地表明,即使进食16周,高胆固醇血症也不会改变T细胞胆固醇水平。

我们的数据表明WHF饮食引起的T细胞脂质成分改变,TCR激活位点的膜凝结效率以及离体和体内激活反应之间存在联系。我们之前曾报道过,通过TCR进行的参与和信号传导会重组这些部位的膜,从而产生高度有序的结构域(40)。此外,我们观察到了与本研究类似的关系,其中Jurkat T细胞的离体脂质处理特别是在T细胞活化位点降低了膜的排列,从而损害了IL-2的产生和分泌(25)。

WHF饮食包含>总饱和脂肪比普通饮食高14倍,单饱和脂肪酸高3倍。尽管循环脂质的变化很大,但在9周WHF饮食后,我们观察到T细胞中脂质组成的变化相对较小。我们检测到胆固醇与磷脂比率的变化以及向磷脂单饱和的转变,但多不饱和脂肪酸水平没有变化。这些细胞中脂质最明显的变化是总磷脂,特别是PE的增加。该观察结果与以前的发现一致,在这些发现中,膳食脂肪的相对丰度和饱和度的变化改变了细胞PE的丰度以及磷脂与胆固醇的比例(57)的细胞和膜(57–59)。在离体激活过程中,我们在T细胞中观察到的脂质变化在功能上很重要,因为我们不仅观察到T细胞活化位点的膜顺序以及IL-2 mRNA水平都发生了显着变化,这一点很明显。

个别磷脂种类(尤其是PE)的改变可能会产生许多功能性后果,因为头基通常赋予磷脂酶促活性并影响膜的不对称性(60)。已显示TCR激活域富含血浆单质PE(61),提示PE在信号转导和膜流动性中起重要作用。此外,研究表明,PE通过水解参与细胞信号传导,形成许多第二信使,例如二酰基甘油,磷脂酸和溶血磷脂酸(17)。膜PE(62)也是已知的主要磷脂类别之一,在膜融合,裂变和弯曲,膜蛋白组装和随后的T细胞信号转导(63, 64)。因此,即使T细胞脂质水平和比例的细微变化也可能对T细胞功能产生重大影响。

尚未完全了解T细胞活化位点的专门膜结构域如何促进信号传导,令人惊讶的是,饮食中的脂质会导致这方面的功能增强。但是,脂质结构域可能不是静态实体,而是在呈现脂质相分离的膜中不断重塑(65)。实际上,对于下游激活而言,功能重要的可能是在TCR触发后重组质膜的能力,而不是基膜的顺序和组成本身。因此,膳食脂质可能仅引起膜组成的细微变化,但对膜的组织,受体信号传导和T细胞反应却有很大的影响。

披露事项

作者没有财务利益冲突。

致谢

我们感谢新南威尔士大学Mark Wainwright分析中心的生物医学成像设施和生物分析质谱分析设施。

脚注

  • 这项工作得到了澳大利亚国家卫生与医学研究委员会的资助(10222182(给K.G.和J.R。),1037320(对R.G.P.和K.G.)和1059278(对K.G.),以及澳大利亚研究委员会的CE140100011(对K.G.)。

  • 本文的在线版本包含 SUPplemental material.

  • 本文中使用的缩写:

    CHS
    接触超敏反应
    DNFB
    2,4-二硝基氟苯
    GP
    广义极化
    低密度脂蛋白-/-
    低密度脂蛋白受体敲除
    功放
    磷脂酸
    个人电脑
    磷脂酰胆碱
    个人电脑NA
    增殖细胞核银
    聚乙烯
    磷脂酰乙醇胺
    PG
    磷脂酰甘油
    PI
    磷脂酰肌醇
    聚苯乙烯
    磷脂酰丝氨酸
    SM
    鞘磷脂
    WHF
    西方高脂
    WT
    野生型。

  • 已收到 2015年6月11日。
  • 公认 2016年3月13日。
  • 美国免疫学家协会版权所有©2016。

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免疫学杂志
卷196, 第10期
2016年5月15日
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饮食脂质的长期摄入改变了LDLr的膜结构和T细胞反应-/- Mice
阿比盖尔H. 波洛克, 尼哥底母 特德拉, 莎拉·E。 汉考克, 丽亚 科尼利, 托德·W 米切尔, 正民 杨, 前池 科克斯, 罗伯特·G 帕顿, 杰里米 罗西, 卡塔琳娜(Katharina) 高斯
免疫学杂志 2016年5月15日, 196 (10) 3993-4002; DOI: 10.4049 / jimmunol.1501261

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阿比盖尔H. 波洛克, 尼哥底母 特德拉, 莎拉·E。 汉考克, 丽亚 科尼利, 托德·W 米切尔, 正民 杨, 前池 科克斯, 罗伯特·G 帕顿, 杰里米 罗西, 卡塔琳娜(Katharina) 高斯
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