抽象的
中性粒细胞是先天免疫应答的关键介质，并有助于组织损伤。然而，在非缺陷炎症期间调节中性粒细胞募集对受伤组织的免疫途径仍然明确。 DAP12是一种细胞膜相关蛋白，可在骨髓细胞中表达，并且可以在感染期间增加或抑制先天炎症反应。为了阐明DAP12在肺部缺血/再灌注损伤（IRI）中的作用，我们利用了一种临床相关的移植介导的肺IRI小鼠模型。这种技术使我们能够将DAP12在组织植物细胞中的重要性讨论，并且在非缺陷炎症期间从周边渗透受伤组织的重要性。巨噬细胞在鼠标和人肺中，已经受到冷缺血性储存表达DAP12。我们发现捐赠者，但不是受体，DAP12的缺乏保护免受肺部IRI。对免疫反应的分析表明，DAP12促进组织常见的肺泡巨噬细胞的存活率，并有助于局部生产中性粒细胞趋化物。腔内成像证明了转型迁移缺陷进入DAP12缺乏肺部，其可以通过局部施用中性粒细胞趋化因子CXCL2来抵押。通过调节中性粒细胞贩运的调节介导急性无排血组织损伤，我们发现了在组织静脉肺泡巨噬细胞中的DAP12表达的先前未被识别的作用。
本文介绍 在这个问题上 ，p。 3531
介绍
嗜中性粒细胞渗透急性受感染的组织是很好的，在那里他们在宿主防御中发挥着重要作用。然而，中性粒细胞也在非缺陷过程中进入组织，其中它们有助于组织损伤。缺血/再灌注损伤（IRI）是一种临床相关的无排血炎症损害，可以影响各种组织。在几种临床情景中表现出肺IRI，包括肺动脉栓塞，心肺旁路和肺移植后的血流恢复（1）。肺部IRI的标志包括肺泡损伤，肺水肿和低氧血症（2）。在肺移植的情况下，在瞬时进行冷缺血的再灌注是该程序的固有组分，IRI是短期和长期发病率和死亡率的关键决定因素（3）。我们和其他人表明中性粒细胞是肺炎的重要介质（4, 5）。使用腔内成像我们已经表明，中性粒细胞迅速渗透新鲜灌注的肺移植，形成移植组织内的动态簇（5）。此外，我们报道了在移植后G-CSF介导的紧急粒细胞，加剧了肺损伤，中性粒细胞耗尽改善了移植物功能（6, 7）。虽然已经提出了几种细胞因子，趋化因子和细胞种群在调解贩运中性粒细胞的培养中发挥作用，但调节其迁徙行为的精确细胞和分子提示很难理解。
在传染性模型中，已经出现了数据，即可以通过细胞膜相关蛋白DAP12调节先天免疫途径，其与几种配体结合受体相关（8）。 DAP12及其相关的受体在各种骨髓细胞上表达。调查DAP12的作用主要集中在传染性免疫上，其作用是争议的争议，一些研究报告抑制和其他对炎症反应的影响（8–12）。然而，DAP12在非缺陷炎症中的作用仍然很大程度上是未开发的。
在这项研究中，我们发现DAP12在加剧肺IRI中的作用。移植模型的使用允许我们鉴定供体肺常见的肺泡巨噬细胞中的DAP12信号传导促进它们的存活率并影响局部中性粒细胞趋化因子产生，该产生调节中性粒细胞进入发炎肺组织。因此，我们描述了将中性粒细胞募集成急性受伤的肺部的临床相关的途径，该肺部有可能靶向治疗。
材料和方法
老鼠
C57BL / 6J（CD45.2+）和b6.sjl- PTPRC. a Pepcb/ boyj（CD45.1+）小鼠购物从杰克逊实验室（Bar Harbor，Me）购买。溶菌酶M（Lysm）-GFP小鼠从Klaus Ley（La Jolla Institute）获得，DAP12缺陷（DAP12敲除[KO]）小鼠来自Marco Colonna（华盛顿大学）。机构动物研究委员会批准程序。动物遵守人文护理 实验动物的护理和使用指南 由国家科学院编制，由国家卫生研究院发表 实验室动物护理原则 由国家医学研究协会制定。
外科手术
将野生型（WT）或DAP12KO肺移植到CD45.1中+ B6 WT，DAP12KO或Lysm-GFP小鼠18小时后冷缺血（5, 13, 14）。如前所述评估移植函数（7）。为了检查嗜中性粒细胞，注射了3μg抗Ly6G AB（1A8）I.v.牺牲前5分钟（15）。对于选定的成像实验，1×10614 ）。
免疫染色
补充图2 使用与Alexa Fluor 488直接缀合的AB，而使用Alexa氟缀合的二次ABS（分子探针，Carlsbad，CA）检测所有其他初级ABS。使用Leica DM5000（Leica，Wetzlar，Germany）进行荧光显微镜，用Retiga 200R CCD摄像头（Q-成像，萨里，BC，加拿大）与Q-Capture Pro（Q-成像）接口。使用Adobe Photoshop（Adobe Systems，San Jose，CA）全局调整图像。华盛顿大学的机构审查委员会批准人类议定书。
流式细胞仪
使用CD45.2（104），CD45.1（A20），GR1（RB6-8C5），LY6G（1A8），CD11C（N418），CD11B（M1 / 70），I-A评估渗透细胞。b
定量PCR.
使用Beckman Coulter Moflo将肺泡和间质性巨噬细胞以及内皮细胞（CD31，克隆MEC13.3）分类为Trizol（Life Technologies，Grand Island，NY）。将RNA分离并转化为cDNA。对DAP12，CXCL1，CXCL2，IL-6，TNF-α和β评估cDNA（30ng）2使用ITAQ Universal Probes Supermix（Bio-rad，Hercules，CA）的罗氏灯笼夹480上的猪胶蛋白（Life Technologies）。
体外培养
BMDM 被收获，107
中性粒细胞迁移测定
使用MACS负选择从WT和DAP12KO骨髓纯化中性粒细胞。将细胞与生物素化的ABS孵育至TER119（TER-119），CD11C（N418），NK1.1（PK136），CD3ε（145-2C11），CD5（53-7.3），CD4（GK1.5），CD8（53 -6.7），B220（RA3-6B6），CD19（1D3），F4 / 80（BM8），CD115（AFS98），IA / IE（2G9）和CD117（2b8），然后是链霉抗生物素蛋白缀合的微珠。温育和洗涤后，将细胞施加到LS柱中，并在流过中收集中性粒细胞。将介质单独或补充有10或100ng / ml CxCl2的底部井，而1×10 6 将WT或DAP12KO中性粒细胞添加到3μmtranswell插入件的上腔室中。孵育2小时后，洗涤Transwell插入物，平板旋转，并且迁移到Transwell底部的嗜中性粒细胞的数量。
双光子显微镜
我们进行了滚动式双光子（2P）显微镜（5, 16–18）。首先，将655-nm q点（30μl）（寿命技术）注入标记血管。然后用映像瓦布（a）用定制2p显微镜进行麻醉，暴露的移植物，并进行成像（a &B软件，新伦敦，CT）。获得序列Z-部分（每次21，2.5μm），其成像体积为220×247.5×50μm3。用Imaris（Bitplane，瑞士）进行分析。对于每只鼠标，对于所示三个时间点中的每一个，分析了最多50μm的肺区至少为80μm深。每个基准点表示肺的一个区域的独立测量，并且每实验组的三到四只小鼠汇集了数据。
统计分析
棱镜用于分析数据。配对 t 试验用于比较检查中性粒细胞数的实验结果及其通过流式细胞术和巨噬细胞数通过流式细胞仪进行分布，其中一个WT和一个DAP12KO肺移植平行进行，以算用于日常变化（p <0.05; ±SEM）。用单向ANOVA分析氧水平，用Tukey Postest。用双向ANOVA和Tukey Hostest分析了2P的细胞数和百分比。
结果
DAP12肺居民细胞的缺乏改善IRI
为了检查DAP12是否在介导急性肺损伤方面发挥作用，我们使用了我们之前描述的IRI的移植介导的模型（13, 14, 17, 19）。除了在提供稳健的临床相关模型外，肺移植允许评估肺居民与移植物渗透细胞造成的贡献。将B6 WT或B6 DAP12KO肺移植到Syngeneic WT受体中，再灌注后通过6小时评估。 DAP12KO肺的移植导致损伤的显着改善，通过改善移植物中的氧气交换（图。1A）。然而，当我们将WT肺移植到同造DAP12KO宿主中时，接枝函数显着差，并且与将WT肺移植到WT受体后观察到的。消除DAP12KO移植物的接受者中的DAP12表达没有导致接枝功能的进一步改善。因此，DAP12在肺居民中表达，但未移植渗透，细胞调节肺移植后急性缺血/再灌注介导的肺损伤。
图1。
DAP12缺乏供体细胞衰减移植介导的肺IRI。 （A）动脉PO2 Syngeneic肺移植后6小时（B6 WT→B6 WT， n = 14; B6 DAP12KO→B6 WT， n = 8; b6 wt→b6 dap12ko， n = 7; DAP12KO→DAP12KO， n = 5). *p <用Tukey Posttest单向ANOVA 0.05。 （B) DAP12 quantitative PCR on donor-derived alveolar macrophages and endothelial cells sorted 2 h after B6 WT CD45.2→B6 WT CD45.1或B6 DAP12KO CD45.2→B6 WT CD45.1肺移植。结果标准化为β2-microglobulin并代表四个单独的实验。 *p < 0.05 by paired t 测试。 (C）缺血性肺的免疫荧光染色。 顶面板，b6 wt。 中间板，b6 dap12ko。 底板，人肺组织后冷缺血储存，在再灌注后立即进行移植和2小时。为DAP12（绿色），CD68（红色）和DAPI（蓝色）染色组织（原始放大倍数×20）。
DAP12在移植之前用小鼠和人肺移植物表示
已经确定在供体肺中的DAP12表达调节移植介导的IRI，我们接下来想检查哪些移植犬细胞介导这种效果。先前的研究表明，DAP12可以以各种骨髓衍生的细胞类型表达，包括淋巴细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和树枝状细胞，以及在基质细胞如内皮细胞中的程度较小（20）。我们首先分析了肺移植物细胞中DAP12的基因表达。我们移植了WT CD45.2+ or DAP12KO CD45.2+ 肺进入Congenic WT CD45.1+ 再灌注后2小时，我们将供体肺泡巨噬细胞分类（21）（CD45.2.+CD45.1−CD64+CD11c+SIGLEC-F.+CD11b lo ）和内皮细胞（CD45.2−CD45.1−CD31+）来自肺移植组织（补充图1）。定量RT-PCR分析显示，DAP12在WT肺泡巨噬细胞中表达，但内皮细胞中DAP12的表达水平非常低（图。1B）。与移植前移植后，肺泡巨噬细胞中DAP12的表达水平没有显着差异（补充图2A）。为了证实这些发现，我们通过免疫染色的幼稚WT肺以及18小时的冷缺血后，通过免疫释放的幼稚WT肺以及WT和DAP12KO肺后评估DAP12的蛋白表达。荧光显微镜表现在幼稚WT肺中的DAP12表达（补充图2b）和wt肺移植物（图1C.）（用最小的背景染色在DAP12KO中），其主要用CD68与CD68结合，溶酶体相关膜蛋白家族的成员。 CD68的表达在很大程度上仅限于组织植物巨噬细胞，包括肺巨噬细胞，但尚未在肺树突状细胞中观察到（22）。我们没有观察在基质细胞如内皮细胞（如内皮或气道上皮）中的DAP12染色。我们在植入到终级肺部衰竭患者之前和几个小时后，在冷缺血储存后，我们在患有冷缺血储存后染色的人肺一部分。类似于我们的小鼠的发现，我们观察到DAP12染色与CD68共定位（图1C.）。同样，基质细胞没有表达DAP12。因此，在小鼠和人类肺常血巨噬细胞表达DAP12之后，在冷缺血储存之后。
DAP12调节巨噬细胞存活和体外炎症细胞因子的生产
很明显，冷缺血和随后的再灌注诱导组织坏死（23）。此外，在IRI设置中释放的内源性物质可以引发有助于器官损伤的先天免疫应答（23, 24）。因此，我们的结果引发了巨噬细胞DAP12表达的可能性在调节由这种内源配体介导的应答中起重要作用。进一步评价这一点，我们刺激了再灌注后从移植的同胞B6肺移植物2小时产生的裂解物的BMDM。用肺裂解物孵育培养的巨噬细胞不会导致DAP12表达水平的变化（补充图2C）。与WT巨噬细胞相比，无论在没有DAP12的情况下表明细胞死亡增强的细胞死亡是否存在图2A, 2B）。 DAP12KO巨噬细胞分泌较低量的TNF-α，IL-6和中性粒细胞趋化因子CXCL1和CXCL2在用肺移植裂解物刺激后的大多数实验中（图2C.）。另外，与WT相比，DAP12KO巨噬细胞具有较低的基线TNF-α，但类似的IL-6，CXCL1和CXCL2生产而无需治疗。我们的研究结果表明，在用生理学相关的内源物质刺激后，通过DAP12对巨噬细胞产生炎性细胞因子和趋化因子的产生，这可能至少部分地是由于其存活中的改变。
图2。
DAP12KO BMDM在与肺移植裂解物中体外孵育时，在肺移植裂解物时减少了存活和细胞因子/趋化因子。 （A）B6 WT和B6 DAP12KO BMDM活力后17小时孵育与B6 WT→B6 WT移植裂解物证明Annexin V的百分比+7-氨基酰胺霉素D（7AAD）+。图表代表四个单独的实验，以与类似结果的重复进行。 （B）与移植裂解物孵育17小时后B6 WT和B6DAP12KO BMDM的代表性点图。 （ C) BMDM production of cytokines and chemokines as measured by ELISA following 17 h of incubation with B6 WT→B6 WT移植裂解物。在三个独立实验中的两个中，DAP12KO BMDM在DAP12KO BMDM中显着降低了IL-6，CXCL1和CXCL2。图表表示一个独立重复的一个实验，至少重复执行三次± SEM. *p < 0.05, **p <双向ANOVA 0.01。
DAP12在体内IRI期间调节肺部常规巨噬细胞的细胞因子和趋化因子的表达
已经表明，DAP12在体外对巨噬细胞对内源物质的影响，我们接下来探讨DAP12如何调节体内供体肺常规巨噬细胞。我们移植了WT CD45.2+ or DAP12KO CD45.2+ 肺进入CD45.1+ 在再灌注后，宿主并评估它们的丰度2小时。我们观察到较少数量的供体肺泡巨噬细胞（CD45.2+CD45.1−CD11c+CD64+SIGLEC-F.+CD11b− ）（ 25）当供体肺缺乏DAP12的表达时，在肺移植物中图3A, 3B）。另外，我们在WT和DAP12KO肺中进行了裂解的Caspase-3和CD68的免疫抑制，所述冷缺血储存18小时。我们没有观察到CD68和切割的Caspase-3的分致化，在实验条件下提高DAP12KO巨噬细胞在冷缺血储存期间死亡的可能性，或者与再灌注相关的信号可能引发DAP12KO巨噬细胞的死亡（补充图3A）。与已发表的数据一致，在基线的WT和DAP12KO小鼠中，肺中肺泡巨噬细胞的丰度类似（数据未显示）（26）。我们下次流动细胞血细胞上分选过未处理和移植的WT→WT和DAP12KO→WT肺（补充图1）定量分析了据报道的细胞因子和趋化因子的基因表达，以促进急性肺损伤。与未经处理的对照相比，来自WT的分选肺泡巨噬细胞→WT移植肺部表达明显较高的IL-6，CXCL1和CXCL2（补充图2D）。在移植的移植物中，在缺乏DAP12的供体肺泡巨噬细胞中，TNF-α，CXCL1和CXCL2的表达水平显着降低（图3C.）。因为趋化因子和细胞因子的表达水平被标准化为β2-microglobulin，观察到的减少表明这些基因表达的细胞内在缺陷，而不是由于细胞死亡增加而简单地减少。因此，DAP12在肺部IRI期间调节细胞因子和趋化因子在肺常规巨噬细胞中的表达。
图3。
降低丰富的DAP12KO供体衍生的巨噬细胞，并且在体内肺炎术后细胞因子/趋化因子的表达减少。 （A）供体衍生的肺泡巨噬细胞的代表性点图（CD64+CD11c+SIGLEC-F.+CD11b−）在B6 WT CD45.2之后的移植组织2小时内→B6 WT CD45.1或B6 DAP12KO CD45.2→B6 WT CD45.1 lung transplantation. Cells were first gated on CD45.2+CD45.1− 细胞如所示 补充图1 。 （ B）每毫克组织的供体巨噬细胞数的图形表示（n = 7 /实验组）。 *p < 0.05 by paired t 测试。 (C）细胞因子和趋化因子在供体衍生的，分选肺泡巨噬细胞中（CD45.2+CD45.1−CD64+CD11c+SIGLEC-F.+CD11b− ）（ n 通过定量PCR评估4 /实验组）。结果被标准化为β2 - 与每个实验中的WT种群相比，与WT群相比。 *p < 0.05, **p <双向ANOVA 0.01。
中性粒细胞的组织浸润进入DAP12缺乏肺部
我们和其他人以前表明中性粒细胞是肺移植后IRI的关键介质（7）。事实上，我们的小组先前据报道，中性粒细胞的部分耗尽导致移植物功能的显着改善与移植DAP12KO肺部时观察到的可比程度（7）。由于我们发现在供体巨噬细胞中的DAP12表达调节中性粒细胞趋化因子的产生，我们下次出发以检查肺移植物中的DAP12表达如何调节移植后的中性粒细胞渗透。我们首先移植WT（CD45.2+）或dap12ko（CD45.2+）肺部进入CD45.1+ 主持人。植入后六小时相似的收件人CD45.1+CD45.2−Gr1+Ly6G 你好 中性粒细胞被贩运到WT和DAP12KO肺部（Fig. 4）。为了区分血管内和间隙中性粒细胞，注射了PE标记的中性粒细胞特异性AB，抗LY6G，I.V。如前所述牺牲前5分钟（15）。在加工组织后，用抗LY6G在联苯脲素中标记细胞，允许血管内中性粒细胞的差异标记（PE+联素键素+）和质嗜中性粒细胞（PE−联素键素+）。显着更多的中性粒细胞在DAP12-足够的肺移植物中经过外渗而不是进入DAP12KO肺（图4A, 4B）。值得注意的是，原生右肺中的绝大多数中性粒细胞位于血管内隔室（补充图3B）。体外迁移测定显示WT和DAP12KO中性粒细胞以可比的方式迁移到CXCL2（补充图3C）。总之，这些结果表明，无论其表达DAP12的表达如何，中性粒细胞对肺的交通，在没有DAP12的情况下损害中性粒细胞的外渗。
图4。
DAP12KO肺的接受者降低了中性粒细胞的接枝浸润。 （A）B6 WT CD45.2→B6 WT CD45.1肺移植物（n = 7 /实验组）。嗜中性粒细胞被置于受体CD45.2上−CD45.1+ 细胞并识别为LY6G+Gr1+。这些细胞是CD11b 你好 并且侧面散落。 （B) Representative dot plot showing percentage of extravasated neutrophils in B6 WT CD45.2→B6 WT CD45.1或B6 DAP12KO CD45.2→B6 WT CD45.1 and assessed based on their staining for PE-labeled Ly6G, which was injected i.v. into recipient mice prior to sacrifice. Intravascular neutrophils were Ly6G-PE+ly6g-苯并键合粘合剂+ 虽然间质中性粒细胞是ly6g-pe−ly6g-苯并键合粘合剂+ 。 （ C）嗜中性粒细胞的绝对数的图形表示（ 剩下 ）嗜嗜中性粒细胞（EV）与血管内（IV）分布（正确的）。图表代表七个单独的实验。 **p < 0.01 by paired t test.
腔内成像显示DAP12KO移植物中的中性粒细胞外渗缺损，可以通过局部中性粒细胞趋化因子给药来克服
为了进一步评估DAP12在肺部植物细胞中的表达调节中性粒细胞行为，我们利用了我们最近描述的方法在体内通过2P显微镜进行图像肺（5）。我们首先将WT肺移植到Syngeeic Lysm-GFP小鼠中，该小鼠在Lysm启动子（Lysm-GFP）的控制下表达GFP，并在再灌注后开始将移植物3小时成像。我们和其他人使用这些小鼠在体内跟踪中性粒细胞（5, 18, 27）。注射量子点以可视化脉管系统。与我们之前的报告一致，我们观察到将中性粒细胞的标记募集到这些新鲜再灌注的WT肺中（5）。在45分钟的成像期间，我们观察到逐渐增加的中性粒细胞的外渗，导致它们的组织浸润形成动态簇（图5A, 补充视频1,5）。相反，虽然类似数量的中性粒细胞迁移到DAP12KO肺部（图5B.），积聚在肺部血管中的中性粒细胞，并没有有效地迁移到肺动脉间（图5C., 补充视频2,6）。在血管壁上发现了被捕中性粒细胞的浓度。已经显示肺部表达DAP12中的巨噬细胞，我们接下来希望探索WT巨噬细胞是否能够在DAP12KO肺移植物中恢复嗜中性粒细胞的外渗。为此目的，我们在再灌注前立即将WT BMDM施用于DAP12KO→Lysm-GFP肺接受者的供体支气管。当我们以后将这些移植物拍摄3小时时，与DAP12KO移植物相比，我们观察到嗜中性粒细胞外渗水平（图5A, 5C, 补充视频3,7）。与未处理的DAP12KO移植物相比，将DAP12KO BMDM施用于DAP12KO移植物的气道导致增强的中性粒细胞外渗。然而，与接受WT BMDM的DAP12KO移植物相比，在给予DAP12KO BMDM后，中性粒细胞外移除显着降低（图。 6A-C.）。随着我们观察到在体外和体内DAP12KO巨噬细胞中的中性粒细胞趋化因子CXCL2的表达减少，我们下次出现了检查CXCL2在再灌注肺中的中性粒细胞贩运中起作用。我们将DAP12KO肺移植到Syngeeng Lysm-GFP宿主中，并在再灌注之前立即将重组CXCL2或PBS滴注到供体支气管中。与未处理的或PBS治疗的DAP12KO肺相比，CXCL2给药导致中性粒细胞的渗透显着增强（图。 5A, 5C, 6D–F, 补充视频4,8）。这些移植物中的嗜中性粒细胞行为与在植入时接受WT BMDM的WT和DAP12KO移植物中观察到的比较。注意，与我们的流动细胞计量评估一致（图4C.），中性粒细胞密度在WT和DAP12KO接枝组织中相似，表明肺部的DAP12表达不会影响中性粒细胞贩运到再灌注移植物（图5B.）。因此，我们的数据显示DAP12表达肺部驻留细胞调节中性粒细胞的转诊迁移到发炎的肺部。此外，通过施用WT巨噬细胞或中性粒细胞趋化因子，可以将DAP12KO肺中的中性粒细胞脱发至WT移植物中观察到的水平。
图5。
通过NT BMDM或CXCL2的胚胎施用抵抗DAP12KO肺移植物中的嗜中性粒细胞晶状体迁移。 （A通过移植到Lysm-GFP主体后，将脊髓手术2P显微镜检查引发3小时。在成像开始后立即采取时间点，45分钟以后显示B6 WT和B6DAP12KO移植物以及在再灌注之前立即接受WT B6 BMDM或重组CXCL2的B6DAP12KO肺部（补充视频1-8）。绿色显示Lysm-GFP+ 中性粒细胞;红色，不确定的量子点;蓝色，二次谐波发电信号。秤条，50μm。 （B）嗜中性粒细胞数的图形表示（每mm3）在开始成像后在0,30和45分钟（n = 3-4移植/实验组，每次移植肺部分析两到五个区域）。在任何时间点之间没有在四个实验组之间检测到统计学上显着的差异。 （C）在成像开始后，在0,30和45分钟的升级中性粒细胞百分比的图形表示（n = 3-4移植/实验组，每次移植肺部分析两到五个区域）。每个点代表肺移植物的单独区域（0 min，dap12ko与wt，dap12ko与dap12ko加wt bmdm，或dap12ko或cxcl2， p <0.05; 30分钟，DAP12KO与WT，DAP12KO PLUS WT BMDM，或DAP12KO PLUS CXCL2， p <0.05; 45分钟，DAP12KO与WT，DAP12KO PLUS WT BMDM，或DAP12KO PLUS CXCL2， p <0.05）。用双向ANOVA分析数据，与Tukey Hostest。
图6。
用DAP12KO BMDM或PBS处理DAP12KO肺移植物。 （A 和 D通过移植到Lysm-GFP主体后，将脊髓手术2P显微镜检查引发3小时。在成像开始后立即采取的时间点，45分钟以后显示在再灌注之前接受DAP12KO B6 BMDM（A）或PBS（D）的B6 DAP12KO移植物。绿色显示Lysm-GFP+ 中性粒细胞;红色，不确定的量子点;蓝色，二次谐波发电信号。秤条，50μm。 （B 和 E）嗜中性粒细胞数的图形表示（每mm3）在开始成像后在0,30和45分钟（n = 3-4移植/实验组，每次移植肺部分析两到五个区域）。在任何时间点之间没有在四个实验组之间检测到统计学上显着的差异。 （C 和 F）在成像开始后，在0,30和45分钟的升级中性粒细胞百分比的图形表示（n = 3-4移植/实验组，每次移植肺部分析两到五个区域）。 （b），（c），（e）和（f）中的每个点代表肺移植物的单独区域（0 min，dap12ko与dap12ko plus dap12ko bmdm，dap12ko plus wt bmdm与dap12ko plus dap12ko bmdm， p <0.05; 30分钟，B6与DAP12KO PLUS DAP12KO BMDM，DAP12KO与DAP12KO PLUS DAP12KO BMDM，DAP12KO PLUS WT BMDM与DAP12KO PLUS DAP12KO BMDM， p >0.05; 45分钟，B6与DAP12KO Plus DAP12KO BMDM，DAP12KO与DAP12KO Plus DAP12KO BMDM，DAP12KO Plus WT BMDM与DAP12KO Plus DAP12KO BMDM， p <0.05）（0分钟，B6与DAP12KO PLUS PBS，DAP12KO加上CXCL2与DAP12KO PLUS PBS， p <0.05; 30分钟，B6与DAP12KO Plus PBS，DAP12KO Plus CXCL2与DAP12KO Plus PBS， p <0.05; 45分钟，B6与DAP12KO PLUS PBS，DAP12KO Plus CXCL2与DAP12KO Plus PBS， p <0.05）。用双向ANOVA分析数据，与Tukey Hostest。
讨论
我们的工作已经确定了DAP12在介导急性无排血肺损伤方面的一种新颖作用。据我们所知，这是第一次描述肺部植物细胞中DAP12表达的研究调节炎症期间中性粒细胞的经过术前迁移。延长之前的观察结果，我们发现DAP12调节巨噬细胞的存活率及其产生炎症分子的生存（26）。中性粒细胞迁移出脉管系统和DAP12缺乏发炎的肺部恢复到腹腔内施用CXCL2或WT巨噬细胞后移植WT移植后观察到的水平。因为DAP12在移植前在人肺中纳入的巨噬细胞上表达，所以我们的观察结果在移植介导的IRI和其他形式的急性肺损伤中具有潜在的临床相关性。
雇用前体内灌注兔和小鼠肺的模型表明肺巨噬细胞有助于IRI（28, 29）。通过腹腔内施用克莱膦酸盐施用分离的灌注小鼠肺的巨噬细胞耗尽导致TNF-α，CXCL2和单核细胞化学援助剂MCP-1的表达降低。其他人报告通过i.p的全球缺乏巨噬细胞耗尽。施放克莱膦酸盐或消除CD11c+ 在CD11C-DTR小鼠中具有白喉毒素的细胞在肺血管的瞬时连接后衰减IRI（30）。这种治疗方案导致在受伤的肺中促炎细胞因子和中性粒细胞趋化因子的表达减少，并降低了组织学评价的中性粒细胞渗透。作者推断，肺泡巨噬细胞在肺IRI设置中策划早期炎症事件，可能通过损伤相关的分子模式（潮湿） - 触发TLR4信号传导。然而，实验系统不允许调查人员区分肺居民细胞和渗透来自周边受伤肺的细胞。
本研究中使用的血管化肺移植模型最初由我们的团体开发，具有几个重要的优势（13, 14, 17, 19）。首先，它代表了一种鲁棒模型的无排血肺炎症模型，其在人类肺移植后模拟IRI。与人类肺移植后的移植功能障碍类似，IRI导致鼠模型中的氧交换损害。其次，通过使用基因缺陷的小鼠作为供体或受者，该模型可以评估肺常剧与移植物渗透细胞对肺损伤的贡献。在其他模型的炎症模型中可能不可行，例如呼吸道感染，化学损伤或瞬时血管闭塞，其中组织居民和移植物渗透细胞共享相同的基因型（31）。先前的研究表明，巨噬细胞的DAP12表达调节其趋于烟雾暴露的小鼠肺部的CCL2（32）。此外，已经提出了DAP12在中性粒细胞中的表达，以有助于它们对纤连蛋白的粘附性（33）。基于这些观察结果，我们预计接受者的DAP12缺乏导致IRI的衰减，因为渗透渗透白细胞介导组织损伤。然而，我们惊讶于DAP12表达没有调节嗜中性粒细胞趋化性，并且受体DAP12表达没有冲击移植物功能。
以前的研究描述了DAP12信号传导可以在TLR刺激后调节骨髓反应（34–36）。这些研究产生了相互矛盾的结果，一些报道显示出具有兴奋性和其他炎症反应的衰减。例如，DAP12KO动物更耐化脓性休克，由I.P诱导。注射LPS或盲肠结扎和穿刺，而不是WT小鼠（36）。 DAP12KO小鼠的增加的增加与炎症介质的较低的全身水平相关。有趣的是，在WT和DAP12KO小鼠之间募集巨噬细胞和中性粒细胞对炎症的遗传学。最近使用登革热病毒触发的休克模型进行了最近的研究延伸，这表明DAP12相关受体MDL-1对骨髓细胞的激活增强了TNF-α的产生和NO（37）。保护MDL-1缺乏小鼠免受死亡，提供了进一步的证据，即DAP12可能具有有害后果。相比之下，组织浸润巨噬细胞的DAP12缺乏导致炎症细胞因子的促进率较高，响应于TLR激动剂的刺激（ 34, 35, 38 ）。
DAP12信号传导功能结果的变化归因于不同的DAP12-相关受体的接合。已经提出，Trem2通过DAP12介导抑制信号，而TREM-1和MDL-1增强炎症反应。此外，DAP12介导的反应的质量可能受配体亲经的影响。已经鉴定了几种湿度，其在非缺血组织损伤期间被释放，例如分级透明质酸，HMBG-1，热休克蛋白和哈达福蛋白（ 23, 24）。这些湿度可以通过TLR2和TLR4刺激激活先天免疫系统。重要的是要鉴定在非缺陷炎症的背景下激活DAP12信号传导的DAP12相关的受体和内源性配体是重要的。
通过多学期的级联事件募集中性粒细胞和其他白细胞进入发炎的组织（39）。在血管内皮细胞上捕获迁移细胞并经历依赖性轧制。坚定地坚持血管壁，通过粘附分子介导的粘附分子和中性粒细胞趋化因子，然后是穿过内皮屏障的细胞。调节该过程的分子提示在组织之间变化（40）但相对较少地了解他们在肺内的贩运要求。我们最近开发了通过脊柱内2P显微镜进行鼠肺的方法（5, 17, 41）显示中性粒细胞，渗透再灌注的DAP12KO肺移植物，慢下来，沿血管壁滚动，并牢固地粘附在肺血管上，但它们不能迁移到组织中。在本研究中，我们表明CXCL2单独诱导中性粒细胞在发炎的肺中颅骨迁移，以前在其他炎症模型中延长观察（42, 43）。我们发现将DAP12KO BMDM施用到DAP12KO移植物中导致相对于未处理的DAP12KO移植物更脱嗜胞粒细胞外渗。我们推测，这种效果是由于接受DAP12KO BMDM的DAP12KO移植物中巨大的巨噬细胞较高。然而，与接受WT BMDM的DAP12KO移植物相比，在这些条件下的中性粒细胞外渗明显较低。
以前，我们观察到血液单核细胞耗尽的中性粒细胞相似的脱盐缺陷（5）。这些相似之处提高了几种可能性。 DAP12通过肺常规巨噬细胞的表达可以调节单核细胞的贩运，然后促进中性粒细胞矫直级别迁移。我们发现中性粒细胞外渗可以用腹腔切割CXCL2诱导将讨论这种可能性。我们宁愿推测血液单核细胞和肺常血巨噬细胞协同调节不同的步骤，使得经骨盆中性粒细胞迁移能够。一种可能的情况是浸润渗透单核细胞通过肺植物巨噬细胞诱导嗜中性粒细胞趋化因子的DAP12依赖性表达。
总之，我们的作品揭示了DAP12对肺常规巨噬细胞的介于促进中性粒细胞的颅骨迁移介导非缺血组织损伤。在临床环境中，移植介导的IRI对短期和长期结果产生了不利影响（3）。正如我们所证明的那样，移植浸润性嗜中性粒细胞可以提高同种疫反应，供体器官中的DAP12表达可以提供先天和适应性免疫应答之间的联系，从而撞击移植物排出（6）。在移植之前灌注肺肺肺的最近发达的方法可以提供通过靶向供体器官（ 44 ）。
披露
作者没有财务利益冲突。
脚注
该工作得到了国家卫生学院的支持R01 HL113931，R01 HL094601，R01 HL113436和R01 AG028082，国际心肺移植社会，以及Barnes犹太医院的基础。
本文的在线版包含 补充材料.
本文中使用的缩写：
- BMDM
- 骨髓衍生的巨噬细胞
- 潮湿
- 损伤相关的分子模式
- iri.
- 缺血/再灌注损伤
- ko.
- 昏死
- Lysm.
- 溶菌酶M.
- 2P
- 双光子
- WT.
- 野生型。
- 已收到 2014年6月2日。
- 公认 2015年2月4日。
- 版权所有©2015由美国免疫学家，Inc。
