
抽象的
B细胞活化通过BCR与抑制因子FcγRIIB和激活的团簇CD19来调节通过BCR的相互作用来调节。最近的研究表明,Ag驱动的BCR微生物蛋白在与CD19微生物蛋白的分致化上有效地转化为信号活性状态。使用总内部反射荧光显微镜,高分辨率,高速活细胞和分子成像方法,我们表明,当共连接到BCR时,FCγRIIB可以通过阻断BCR和CD19的分致化来抑制B细胞活化B细胞免疫学突触中的微生物蛋白。值得注意的是,FcγRIIB的这种抑制功能不依赖于其特征含有含ITIM的细胞质结构域,而是其跨膜结构域。实际上,来自系统性狼疮的人的原发性B细胞纯合体纯合的基因,编码函数跨膜域域突变体FcγRIIB-I232T的BCR未能用CD19阻断BCR的突触分层,导致下游信号分子P-Pi3k的招募。到膜近端信号组。这种抑制FcγRIIB在B细胞免疫突触中损害BCR和CD19微蛋白的空间 - 时间分层化的抑制作用可能有助于解释报告研究中系统性红斑狼疮患者B细胞的超反应性特征。这些观察结果还可为全身自身免疫疾病提供新的疗法。
介绍
B淋巴细胞的主要功能是为异国AGS建立和维持AB记忆。对于B细胞来区分来自非自我AGS的自我Ag至关重要,这是通过表面表达的BCR完成的(1, 2)。一旦受AG结合,BCR就启动了B细胞的激活(1–3)。自我AGS诱导的异常B细胞活化与B细胞肿瘤和自身免疫疾病如全身狼疮红斑(SLE)有关,尽管下划线机制不完全理解(4–6)。为了平衡免疫保护和免疫病理学,通过激活CD19或抑制性FCγRIIB受体受到严格控制的B细胞活化(7–9)。早期生化研究发现CD19和FcγRIIB对BCR上的作用取决于相应受体的细胞质结构域(8, 9)。小鼠模型研究表明CD19缺陷小鼠的AB反应严重受损(10–12),而FcγRIIB缺陷小鼠表现出对某些遗传背景中的自身免疫疾病的易感性,与各自的激活和抑制功能一致(13, 14)。机械地,生物化学研究表明,FCγRIIB通过其ITIM在细胞质结构域中施加BCR信号,以募集含有摩尼醇-5-磷酸酶的SH2结构域(15)。
最近对B细胞激活研究的高级活细胞成像技术应用已经提供了在BCR的AG识别秒内遵循的动态,复杂但有序的分子事件的更新视图。这些研究表明,BCR微生物厂用作介导B细胞激活的信号传导级联的中心平台( 3, 16),又通过CD19和FCγRIIB施加的调节。 Batista和同事(17)是第一个报告BCR和CD19微光栅分子化在BCR信号发起中的关键重要性的关键重要性,这通过其最近使用超分辨率显微镜进行了先进的研究,以显示Syk信号传导微燃烧室中的BCR和CD19分子的温和伴随浓度BCR-AG识别(18)。
最近,我们通过活细胞成像技术表明,BCR微生物蛋白在我们称为BCR MicroCluster生长的过程中的BCR结合到AGS后不久将它们的集成荧光强度(FI)随时间改变而随时间的时间改变19),它本身可能受到FCγRIIB的调节(20)。在生理条件下,B细胞活化可能受到FCγRIIB和CD19团簇的竞争性调节。在该研究中,我们使用总内反射荧光显微镜(TiRFM),基于全内反射,高分辨率,高速活细胞和分子成像技术,表明FcγRIIB可以有效地破坏B中BCR和CD19微蛋白的空间间隙细胞免疫学突触(是),表明FCγRIIB的新抑制功能。此外,我们表明,该抑制特征依赖于FcγRIIB的跨膜(TM)结构域,而不是含ITIM的细胞质结构域,表明TM畴基蛋白质和蛋白质 - 脂质相互作用可能在受体的调节中起重要作用介导的跨膜信号转导。我们将这些发现与临床疾病联系起来,证明来自SLE患者的初级B细胞在FcγRIIB的TM内窝覆单个核苷酸多态性I232T,以其纯合形式与SLE显着相关的突变(21, 22),失去了通过CD19和下游信号分子小组阻断BCR的突触分层化的能力。 FcγRIIB在B细胞中损害BCR和CD19微蛋白的空间 - 时间分层化的这种抑制功能可以有助于解释SLE患者B细胞的报告的超反应性特征(4–6)。
材料和方法
小鼠,细胞,年龄和ABS
从IGH B1-8 / B1-8 Ig1的脾脏分离B1-8特异性B细胞 - / - 如前所述的转基因小鼠(19)。 A20II1.6,拉莫斯和ST486 B细胞系是苏珊K.Pierce博士(国家过敏和传染病研究所,国家卫生研究院[NIH])的实验室科学研究礼品,所有这些都最初从美国购买型文化收集。生物素 - 共轭山羊F(ab')2 抗小鼠IgG,生物素 - 共轭山羊F(AB')2 从杰克逊免疫研究实验室购买抗人IgA + IgG + IgM(H + L)和FC5μ特异的兔Fab抗小鼠IgG。从eBioscience获得太平洋蓝色共轭小鼠MAB抗人类CD19和FITC缀合的小鼠抗人CD19(克隆HIB19)。 BD购买生物素 - 缀合的抗小鼠CD32 / CD16(克隆2.4G2)。生物素缀合的抗人CD32(克隆AT10)购自ABD Serotec。 Alexa 647-缀合的山羊Fab抗人IgM特异于FC5μ和次级AB Alexa Fluor 568-Congugated F(AB')2 从Invitrogen获得兔IgG的山羊腹肌。磷扎皮70(Tyr319/ syk(tyr352),磷酸-CD19(TYR531)和p-pi3k p85(tyr458/ p55(tyr199) - 从细胞信号技术购买的特定ABS。通过在我们发表的研究中的议定书中使用Fab Micraperation试剂盒,通过在我们发表的研究中的议定书中使用Goat Fab抗小鼠CD19(克隆1D3)和小鼠Fab抗人CD19(克隆HiB19)(19, 20, 23–25)。使用Alexa Fluor mab标记试剂盒(分子探针)进行ABS与Alexa Fluor(Alexa Flul 405,488,568或568)的缀合,而制造商的方案则进行生物素化ABS,以遵循制造商的EZ-Link磺酰硫化的方案NHS-LC-BIOTIN(Thermo Scientific)。
质粒构建体和转染
PEYFP-N1购自CLONTECH,使用Quikchange II XL位点定向诱变试剂盒(Stratagene)来修饰该质粒中的YFP基因,以减少出版研究中所提出的GFP的二聚化(26)。 Z.I鉴于含有含有人FcγRIIB野生型(WT)或I232T型官能突突突变体的小鼠FCγRIIB1和PMSCVPURO质粒的PBLUESSCRICT质粒。本田(东京大学,东京,日本)(21)。使用这些质粒作为模板,通过PCR扩增编码小鼠或人FcγRIIB的基因,并通过限制酶位点和HindIII插入PeyFP-N1中。在小鼠FCγRIIB的情况下,BGL II限制性位点AGAT由小鼠FCγRIIB携带的CT与AGA同义突变CCT使用Quikchange诱变试剂盒(Stratagene)和突变体由PCR产生。通过双脱氧序列证实克隆片段的序列,并将DL238,Y235F,DL238-Y235F,FFTM,FF-TM-DL238和LAT-TM-DL250的CDNA克隆到PEYFP-N1中。对于表达载体构建体,通过电穿孔转染A20II1.6细胞和ST486细胞,选择在0.5或1mg / ml G418中的生长,并使用流式细胞仪与抗FCγRIIB特异性ABS一起分选于等效水平的FcγRIIB表达。类似地,将含有人FcγRIIBWT或I232T的cDNA的质粒转染到A20II1.6小鼠B细胞或ST486人B细胞中,并且表达当量的人FCγRIIB-WT或FcγRIIB-I232T的稳定的载载B细胞将至少分选通过流式细胞术进行回合。
sle患者和健康对照组和FCγRIIBTM域基因分型
本研究报名参加了符合美国风湿病学院修订的SLE分类标准的三十七名患者。包括二十九岁的女性和8岁的男性,其中12至62岁,平均年龄为34±15岁。健康的志愿者被招募为控制科目。北京联盟医院医院伦理委员会批准了这项研究,并从每位患者和健康的志愿者获得了知情同谋。从SLE患者和健康的志愿者获得了4至8毫升外周血。通过进行Ficoll-Paque Plus密度分离和冷冻直至成像实验,从这些样品中分离出PBMC。在制造商的协议之后,使用天阵血液DNA MIDI套件(天根BIOTECH,北京)从外周血样品中提取基因组DNA。为了鉴定FcγRIIB1核苷酸多态性的TM区域,我们通过使用引物(前进:5'-aAggggGagcccttcctctctt-3',反向:5'-catccaccaccatgtctcac-3')与先前报道的外显子5的侧翼内含子结合(21, 22)。 DNA测序由BGI(中国北京)完成。
细胞内免疫荧光染色和分子成像
在遇到在平面脂质双层(PLB)膜上遇到的替代AGS的替代AG在我们发表的方案后通过修改后(19, 20, 24, 25)。简而言之,用alexa粉647缀合的山羊抗人IgM Fc部分Abs或200nm Fab片段标记为200nm fab片段,或alexa粉647缀合的山羊抗小鼠IgG Fc部分Abs的200nm Fab片段。将标记的细胞洗涤两次,然后装载到含有AGS的脂质双层,其单独的交联BCR或共升温BCR和FcγRIIB1。用含有37℃,5%Co的替代Ags的PLB膜孵育后,用4%多聚甲醛5分钟固定。2。固定的B细胞用0.1%Triton X-100透露透析化,并用含有100μg/ ml山羊非特异性IgG(杰克逊免疫研究实验室)和2%BSA的阻断剂预处理。随后,用磷酸ZAP-70染色细胞(TYR319/ syk(tyr352)ab(细胞信号传导技术),磷光-CD19(TYR531)AB(小区信令技术)或P-PI3K P85(TYR458/ p55(tyr199)AB(细胞信号传导技术),其次是二次AB Alexa Fluor 568-Cogugated F(AB')2 山羊ABS特异于兔IgG(Invitrogen)染色如前所述(19, 20, 24, 25)。通过ImageJ(NIH)软件进行了分析了图像(19, 20, 24, 25)。
PLB.S的制备
将PLBS含有生物素脂质,将生物素化的BCR和FcγRIIB配体通过链霉抗生物素蛋白连接到我们公开的方案之后(19, 20, 25, 27)并作为在线存储库材料提供。简而言之,通过超声处理1,2-Dioleyl-Sn-甘油-3-普酞啉和1,2-二脲-Sn-甘油-3-磷乙醇胺 - 帽 - 生物素(Avanti Polar Limids)制备生物素脂质体。 PBS的1摩尔比以2.5mm的脂质浓度。在Lab-Tek腔室(Nange Nunc)中形成PLBS,其中覆盖玻璃用纳米玻璃洗涤的盖玻片代替。将盖玻片加入0.1mm生物素脂质体在PBS中孵育15分钟。用10mL PBS洗涤后,将PLB与50nm链霉抗生物素蛋白一起温育15分钟,通过用10mL PBS洗涤除去过量的链霉蛋白。用20nm生物素化的山羊F(ab')孵育含链肽蛋白的pLbs 15分钟2 抗小鼠IgG或山羊F(AB')2 抗人IgM单独交联BCR。为了共同邻接BCR和FcγRIIB,我们用另外的20nM生物素化IgG抗小鼠FcγRII/Fcγ/FcγRII或生物素化IgG抗人FcγRII温育,而对照组与20nM生物素化的非特异性IgG一起温育。通过洗涤除去过量的Ag。接下来,将PLBS在PBS中封闭60分钟,在37℃下封闭60分钟并彻底洗涤以进一步使用。通过将10nM生物素 - 缀合的NIP8-BSA混合具有20nM的BSA特异性(对于IGG-IC)或F(AB')来制备通过将10nM生物素 - 缀合的NIP8-BSA混合制备的免疫复合物(IC)进行制备2 兔BSA特定(f [AB']2-我知道了)。 f(ab')2然后在含生物素的脂质双层上温育20分钟以进行结合。洗完后,F(AB')2 - 含有脂质双层的IgG-IC可以用于全内反射荧光(TiRF)成像。
共聚焦荧光显微镜分子成像
用Alexa Fluor 568-缀合的山羊Fab抗小鼠CD19(克隆1D3)和Alexa Flum 405-缀合的兔Fab抗小鼠IgG染色A20III1.6细胞,并针对FC5μ特异,然后洗涤两次,然后置于含有替代AGS的PLB膜上单独的Cross-Link BCR或在37°C,5%CO中共同地BCR和FCγRIIB将15分钟合并2,然后用4%多聚甲醛固定。通过共聚焦荧光显微镜(LSM710-3Channel; Zeiss)捕获染色分子的图像,其中100×油物镜。在我们以前的研究中报告的imagej(NIH)软件分析了图像(19, 20, 25, 27)。简而言之,对背景进行减去图像,然后用感兴趣的区域(ROI)标记。获得的MFI值是ROI的集成FI与同一ROI中的像素总面积的比率。
使用基于MATLAB的二维高斯分析算法来实现BCR,PSYK,PCD19和P-PI3K小组的数学定量FI信息
通过基于MATLAB的二维高斯分析算法在我们发布的协议之后进行BCR,PSYK,PCD19和P-PI3K小组的数学定量进行精确信息。通过该分析,可以通过最小二乘拟合的二维高斯函数的最小二乘来获取这些微冲击器的精确二维位置和集成的FIS。这种二维高斯函数用于量化二维FI配置文件中的每一个。因为在TiRFM图像中的一些微转移器的曲线没有完全圆形,因此我们允许高斯函数分析椭圆形状。提供本研究中使用的二维高斯功能(19):我们定义了椭圆形
.我们定义了每个单片机的二维宽度,如
.通过二维高斯数学拟合,我们能够获得包括位置(x的每个单片机的几个关键参数)(xc,Y.c),集成fi(i),背景fi(z 0),并且在强度分布的半最大峰值高度下全宽。
结果
FcγRIIB通过其TM结构域有效地阻断BCR和CD19微燃烧剂的突触分层化
首先,我们询问BCR和CD19微生物蛋白的分致化是否可以由BCR抑制菌毒粉FCγRIIB调节。为此,我们将BCR和CD19微生物蛋白的空间和时间分布成像通过TiRFM对PLBS上的人Ramos B细胞。使用改进的实验系统,类似于我们已发布的报告中的实验系统(20),我们同时养育了山羊抗人IgM F(AB')2 片段和小鼠抗FcγRIIBmAb以PLBS共同Liate BCR和FcγRIIB。单独交联BCR,我们使用山羊抗人IGM F(AB')2 片段和同种型匹配的小鼠mAb。通过PCI在我们发表的协议之后量化BCR和CD19微生物蛋白的分致化(24, 25, 27)。使用FcγRIIB的BCR共连接不影响BCR和CD19后5分钟与PLBS接合后的分致化(p = 0.4056; 图。1A 和 1B)。但是,BCR和CD19分层化在10分钟内显着破坏(p = 0.0012; 图1C. 和 1D)并在15分钟内继续如此(p < 0.0001; 图1E. 和 1F)。 BCR和CD19的积累也是由FCγRIIB下调的,并且与我们和其他先前的报告一致(20, 28, 29)。
FcγRIIB在BCR和FC的稍后时间点有效地阻断BCR和CD19微生箱的突触分层化γRIIB co-ligation. (A) Representative TIRFM images of BCR (red) and CD19 (green) within the IS of Ramos B cells that were activated for 5 min in the condition of BCR cross-linking alone versus BCR and Fcγ显示了RIIB共连接。给出了相对fi沿着白线。比例条,1.5μm. (B示出了BCR和CD19微集团MFI中突触分层(PCI)(PCI)或累积的数学量化。从3个独立实验中从至少27个细胞中取出数据,每个点代表一个细胞的值。条表示平均值±SD。学生 t 用a进行测试 p value included, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. (C–F[类似于(a)和(b)中,显示出从被激活10分钟(c和d)或15 min(e和f)的B细胞的BCR和CD19的突触分层和积聚。
我们还使用来自IGH B1-8 / B1-8IGκ的初级B细胞评估BCR和CD19微生物蛋白的分致化 - / - 转基因小鼠(称为B1-8初级B细胞)(30, 31)。 B1-8表达B1-8-IGM-BCR的B1-8初级B细胞特异性识别Hapten 4-羟基-3-硝基苯基(31)。我们将B1-8初级B细胞置于PLBS系列IC上,由它们的全部IgG格式(称为IgG-IC以共同Liate B1-8 BCR和FcγRIIB)或f(ab')2 片段格式(称为f [ab']2 - 单独交叉链接B1-8 BCR)。这些结果证实,在小鼠初级B细胞中,FCγRIIB明显抑制了BCR和CD19分致化(补充图1A)。
接下来,我们通过将一系列FcγRIIB突变体转染到缺乏内源性FcγRIIB(图2A)。这些突变体显示出适当的血浆膜定位和等同的细胞表面表达水平(补充图1B),与早期的研究一致(32)。 FcγRIIB-WT效果破坏了BCR和CD19微生物组的突触分层化(图。2B)。出乎意料的是,我们发现FCγRIIB-DL238,其缺乏整个细胞质结构域(图2A),也显示出同样有效的抑制能力作为FCγRIIB-WT(图2C.)。早期的生物化学研究报道说,预测位于质膜的内部瓣腺近侧的酪氨酸235(Y235)在BCR和FCγRIIB的共同连接时磷酸化(32)。因为Y235在FCγRIIB-DL238中完整,我们通过在WTFCγRIIB(FCγRIIB-Y235F)或截断突变体FCγRIIB-DL238(FCγRIIB中,在表达Y235至F235点突变中表达Y235至F235点突变的B细胞中的BCR和CD19分致化来测试该残余物的功能。 -DL238-Y235F; 图2A)。我们发现FCγRIIB-Y235F仍然保持其抑制作用(p = 0.0021; 图2D)和FcγRIIB-DL238-Y235F只有温和地损害了BCR和CD19的突触分层化(p = 0.0778; 图2E.)。这些结果表明,FCγRIIB的TM结构域但不是细胞质结构域可能是其抑制作用的原因。为了确认这种猜测,我们将I型TM-WT的I TM域与果蝇神经钙粘蛋白蛋白(FCγRIIB-FF-TM相似的I型TM域。 图2A)。在转染的A20II1.6b细胞中,FcγRIIB-FF-TM显示出良好的血浆膜位置和与FCγRIIB-WT相当的表面表达(补充图1B)。 BCR和CD19 TiRFM图像上的PCI分析表明FCγRIIB-FF-TM完全丧失了阻断BCR和CD19的突触分层化的能力(p = 0.1585; 图2f.),认可FcγRIIB的这种新的抑制功能取决于其TM结构域,但不是细胞质尾部。
FC的能力γRIIB to block the synaptic colocalization of BCR and CD19 microclusters depends on its TM domain. (A)小鼠FCγRIIB的WT和突变体的示意图。显示是TM和细胞质序列。 (B–F) Shown are mathematical quantification by PCI analyses for the synaptic colocalization of BCR and CD19 microclusters in A20II1.6 B cells expressing WT FcγRIIB (B), FcγRIIB-DL238 (C), FcγRIIB-Y235F (D), FcγRIIB-DL238-Y235F(E)或FCγ通过BCR交联与BCR和FC一起活化15分钟的RIIB-FF-TM(F)γRIIB共同连接。数据来自至少28个细胞超过3个独立实验,每个点表示一个细胞的值。条表示意味着± SD. A Student t 测试进行了测试 p value indicated, **p < 0.01, ***p < 0.001.
FcγRIIB可以在相同的BCR(或CD19)微集体的突触募集效率下抑制BCR和CD19分致化
PCI.是一种可靠的工具,可以量化两个分子的编码,并已被美国和其他人广泛使用,以量化TiRFM图像(17, 19, 24, 25, 27)。然而,原则上原则上是一种基于强度的方法,其可以产生由于分析ROI中的一个分子的平均fi(MFI)而导致的降低的PCI值。因此,当招募等当量的BCR或CD19分子时,将FCγRIIB-WT和FCγRIIB-FF-TM的抑制函数与BCR和FCγRIIB的共同连接条件进行了比较了(补充图1C)。仍然,与FCγRIIB-WT相比,FCγRIIB-FF-TM损失了阻断BCR和CD19微生箱的突触分层化的能力(补充图1D)。为了绕过FcγRIIB的细胞质尾的抑制作用,我们制成了另外的突变体FcγRIIB-FF-TM-DL238,其中截断突变体FcγRIIB-DL238的TM结构域(参见 图2A)用果蝇神经钙蛋白蛋白的TM域交换(补充图2A)。 FcγRIIB-DL238或FCγRIIB-FF-TM-DL238在A20II1.6小鼠B细胞表面表达到可比水平(补充图2b)和等效水平的BCR,或CD19募集到两种细胞类型(补充图2D)。正如预期的那样,FCγRIIB-DL238维持,FCγRIIB-FF-TM-DL238失去了阻断BCR和CD19微燃烧剂突触分层化的能力(补充图2. 2e)。这些分析证实,FCγRIIB的TM结构域具有抑制BCR和CD19微蛋白的突触分层化的能力。然而,我们不能排除BCR和CD19小冲突的降低降低的可能性也受到BCR和CD19的损伤损失的贡献。
函数丧失FCγRIIB I232T mutant in SLE patients is incapable of blocking the synaptic colocalization of BCR and CD19 microclusters
早期流行病学研究证明了在SLE患者中的TM域中的TM域中的功能丧失多态性,其中FCγRIIB-I232T不能扰动和富含鞘脂和胆固醇的富含血液脂质筏微米的BCR和FCγRIIB结扎(20–22)。因为这种突变在于TM结构域内,我们接下来通过在A20II1.6b细胞中表达FcγRIIB-I232T来调节BCR和CD19微生物蛋白的突触分致化。正如预期的那样,FcγRIIB-WT效果抑制了BCR和CD19的分致化,而FCγRIIB-I232T突变体没有(图3A-C)。在缺乏内源性FcγRIIB的人ST486b细胞中获得了类似的结果(图。3D-F.)。我们确认FCγRIIB-WT和FCγRIIB-I232T显示出良好的血浆膜位置和由TiRFM成像的细胞上的相当表面表达(补充图3A)。
函数丧失FCγRIIB I232T mutant in SLE patients cannot block the synaptic colocalization of BCR and CD19 microclusters. (A 和 D) Representative TIRFM images of BCR (red) and CD19 (green) within the IS of A20II1.6 B cells (A) or ST486 B cells (D) expressing either human FcγRIIB-WT或功能损失突变体FCγ显示RIIB-I232T。通过BCR交联单独或BCR和FC活化细胞15分钟γRIIB共同连接。显示了相对fi沿着白线。比例条,1.5μm. (B, C, E, 和 F) Shown are mathematical quantifications by PCI analyses for the synaptic colocalization of BCR and CD19 microclusters under BCR cross-linking alone or co-ligating BCR and FcγRIIB in its FcγRIIB-WT(B和E)或FCγRIIB-I232T(C和F)格式。数据来自3个独立实验的至少21个细胞,每个点表示1个细胞的值。条表示意味着± SD. A Student t 测试进行了测试 p value indicated, ***p < 0.001.
FcγRIIB-I232T无法阻断BCR和CD19的突触分层化可能是与FCγRIIB-WT进行比较FCγRIIB-I232T损伤的结果。要检查这一点,我们同时检查了使用先进的三色TIRFM延时成像方法(以下)对BCR,FCγRIIB和CD19进入人体ST486B细胞的CD19的招募(图4A, 4B, 补充图3b,3c, 和 补充视频1-7)。在发布的协议之后分析了FCγRIIB-WT或FCγRIIB-I232T积累的动力学(20, 24, 25, 33)。我们发现,与单独的BCR交联相比,两种分子同样募集到B细胞处于共扎带条件下(图4A, 4B, 补充图3b,3c, 和 补充视频5.)。我们还进行了PCI分析,以通过FCγRIIB-WT或FCγRIIB-I232T量化BCR的分致化。我们发现,在共连接后,BCR与FCγRIIB-WT或FCγRIIB-I232T类似地分解(补充图3D 和 补充视频2和4),表明BCR和FCγRIIB共连接过程中具有类似的物理交联效果。这两个独立的分析证明,FCγRIIB-I232T的缺陷不是由于FCγRIIB-I232T的募集受损到B细胞,与FCγRIIB-WT在其共同连接到BCR时比较。
BCR,FC的动态与异质招募γRIIB, and CD19 into the B cell IS in three-color-TIRFM time-lapse imaging. (A 和 B) Representative time-lapse images at the indicated time points showing the dynamic and heterogeneous recruitment of CD19 (red), BCR (green), and FcγRIIB(蓝色)进入B细胞是人体ST486b细胞稳定表达FCγRIIB-WT (A) or Fcγ提出了RIIB-I232T(B)。尺度条,3μm. (C 和 D) PCI analyses at indicated time points for the synaptic colocalization of BCR and CD19 microclusters in B cells as introduced in (A) and (B) are shown. Bars indicate mean ±来自2个独立实验的至少11个细胞的SD。
最后,在时间流逝中,通过PCI分析量化BCR和CD19的分层化动力学,发现BCR和CD19微蛋白的结合效率明显增加,无论FCγRIIB是否参与如何(图4C., 4D, 和 补充视频6和7)。然而,从3-5分钟开始,FCγRIIB-WT但不是FcγRIIB-I232T突变体损害了BCR和CD19微生物蛋白的突触分致化(图4C. 和 4D)。这些结果与人拉莫斯B细胞的终点评估一致(Fig. 1)和原发性人B细胞(Fig. 5 和 补充图4)在本报告后面进一步详细讨论,再次展示FCγRIIB依赖于其TM结构域,以有效地阻断BCR和CD19微生物蛋白的突触分层化。
来自SLE患者的主要B细胞轴承FCγRIIB-I232T纯合突变体显示缺陷阻断IGM-BCR和CD19微蛋白的突触分致化。所示是PCI分析BCR和CD19微生物蛋白来自FC的健康对照人原发性B细胞的BCR和CD19微生物蛋白酶的分析γRIIB (A)FcγRIIB-I232T的杂合(B)或来自SLE患者患者原发性B细胞WT用于FCγRIIB(C),FcγRIIB-I232T的杂合酶(D)或FcγRIIB-I232T的纯合(E)被激活10(上面面板),20(中间板或30分钟(下面的面板)通过BCR交联单独或共连接。在3个独立实验中从至少30个细胞中取出数据,每个点表示1个细胞的值。给出了三种患者样品中的一个的代表性结果。条表示平均值±SD。一个学生 t 测试进行了测试 p value indicated, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.
BCR和CD19的分层化的降低主要是脂质筏区的特异性
使用人失异突变体FcγRIIB-I232T的实验表明,FCγRIIB与脂质筏的关联在调节BCR和CD19微生物蛋白的分致化方面发挥着重要作用。我们很想知道BCR和CD19在富含脂质筏或脂质 - 筏区内显示的中间层化。我们使用脂质筏标记Lyn-M16-CFP探测质膜上的脂质筏,并在BCR交联单独或BCR和FCγRIIB共连接的情况下检查BCR(或CD19)微燃烧剂的分布。与脂质 - 筏区内(弱Lyn-M16-CFP FIMPICOIN)相比,我们观察到富含脂质 - 富有的地区(强烈的Lyn-M16-CFP Fimeroin)中的BCR和CD19分层化效率更高 补充图3e),建议BCR和CD19主要在脂质筏区中叠加(补充图3f和3g)。更重要的是,单独BCR交联条件或BCR和FCγRIIB共连接中BCR和CD19的突触分层的比较表明,观察到的BCR和CD19的分解化的降低主要是特异于脂质筏 - 丰富的地区(补充图3h和3i)。然后,我们询问FCγRIIB-I232T的缺陷是否可以通过用脂质 - 筏族蛋白的TM域代替TM域来反转,如LAT。为了测试这个假设,我们制造了FcγRIIB-LAT-TM-DL250的构建,其中人FCγRIIB的TM结构域被拉特的TM结构域取代,并且截断了FcγRIIB的细胞质结构域(补充图2f)。我们检查了FCγRIIB-LAT-TM-DL250在TIRFM成像实验中抑制BCR和CD19的突触分层化的影响。很明显,FCγRIIB-LAT-TM-DL250没有显示出这样的抑制功能( 补充图2g),表明组成型脂质筏 - 梯度TM不能抑制BCR和CD19微蛋白的分致化。
BCR和CD19微蛋白的受损突触突触分层化下调了向膜近端信号组的信号分子募集
最近的高分辨率和高速活细胞成像实验揭示了细胞内信号分子对IS和BCR微生物蛋白的动态募集的性质,反过来,转化BCR信号并最终激活B细胞(3, 16)。在这项研究中,我们研究了FCγRIIB如何通过TiRFM将两种这种早期信号分子,Syk和Pi3K的突触募集转化为BCR信号组。在共扎带条件下,我们发现FcγRIIB-WT有效地损害了BCR和PSYK微生物蛋白的突触分层化(图6A-C)和招募psyk分子进入的是(图6E.)。然而,FCγRIIB-I232T突变体未能显示这种抑制功能(图6A, 6B, 6D, 和 6F)。因为CD19的Y482和/或Y513在CD19的磷酸化以募集PI3K至膜近端BCR信号组(9, 18, 34),我们接下来研究了FcγRIIB对磷酸化CD19的突触CD19至BCR中的影响。 FCγRIIB-WT效果地阻断了PCD19中的PCD19和PCD19和BCR微生箱的分层,而FCγRIIB-I232T失去了这些能力(Fig. 7)。最后,使用抗p-pi3k p85(tyr458/ p55(tyr199)ab(35),我们表明,通过FcγRIIB-wt抑制了磷酸化的PI3K P85亚基(在本报告中称为P-PI3K的P-PI3K)及其与BCR的分层化,但不是FCγRIIB-I232T(Fig. 8)。这些结果表明,BCR和CD19微生物蛋白的受损突触分层化有助于抑制信号分子到膜近端信号组的抑制。
BCR和CD19微燃烧剂受损的突触突触分层下调下调psyk至BCR微生物蛋白。 (A 和 B) Representative TIRFM images of BCR (red) and pSyk (green) within the IS of human ST486 B cells expressing either FcγRIIB-WT or FcγRiib-I232T。给出了BCR(红色)和PSYK(绿色)的相对滤波器(B)。秤栏,1.5μm. (C–F(如(a)和(b)中所引入的人类ST486b细胞的BCR和PSYK小组的突触分层(C和D)或积累(E和F)的数学定量。数据来自至少26个细胞超过3个独立实验,每个点表示1个细胞值。条表示平均值±SD。一个学生 t 测试进行了测试 p value indicated, ***p < 0.001.
BCR和CD19微燃烧剂的突触突触分层化下调了PCD19至BCR微生物蛋白的募集。 (A 和 B) Shown are representative TIRFM images of BCR (red) and pCD19 (green) microclusters within the IS of human ST486 B cells expressing either FcγRIIB-WT or FcγRiib-I232T。 BCR(红色)和PCD19(绿色)跨白线跨越的相对型材在(B)中给出。比例条,1.5μm. (C–F(如(a)和(b)中引入的那样,BCR和PCD19微生物蛋白的突触分层(C和D)或累积(e和f)的数学定量。在31个独立实验中从至少31个细胞中取出数据,每个点代表1个细胞的值。条表示平均值±SD。一个学生 t 测试进行了测试 p value indicated, ***p < 0.001.
BCR和CD19微燃烧剂的突触突触分层化下调了P-PI3K至BCR微生物蛋白的募集。 (A 和 B) Shown are representative TIRFM images of BCR (red) and p-PI3K (green) within the IS of human ST486 B cells expressing either FcγRIIB-WT or FcγRiib-I232T。给出了BCR(红色)和P-PI3K(绿色)穿过白线的相对型材(B)。比例条,1.5μm. (C–F(如(a)和(b)中所呈现的人sT486b细胞的BCR和P-PI3K小组的突触分层(C和D)或累积(E和F)的数学定量。在3个独立实验中从至少25个细胞中取出数据,每个点代表1个细胞的值。条表示平均值±SD。一个学生 t 测试进行了测试 p value indicated, ***p < 0.001.
FCγRIIB-I232T不会在共同连接到BCR时抑制PCD19,PSYK和P-PI3K小组的集成功能
最近的研究表明,BCR小光刻功能作为B细胞激活信号级联的信号平台(3, 16, 36)。要了解FCγRIIB如何调节下游BCR效应分子,我们在IS通过Tirfm内成像数千个BCR和BCR信号分子微转移剂,包括PSYK,PCD19和P-PI3K,并根据集成的结构计算这些微集团的变化通过Matlab算法驱动的二维高斯配合协议,如我们发布的研究报告(19, 20, 25, 27)。因此,与通过单独的BCR交联的B细胞相比,FcγRIIB-WT在共连接条件下将BCR微生物蛋白的FI在B细胞中抑制了84.3%。图9A 和 9B),与我们发表的研究一致,该研究量化了WT小鼠FCγRIIB上的BCR微燃烧室的功能(20)。相比之下,FcγRIIB-I232T仅显示部分抑制效果,减少了50.3%(图9A 和 9B)。显然,BCR微生物蛋白的生长特征不仅通过TM,还经过FCγRIIB的细胞质结构域来进行下调,与我们的早期报告中的荧光共振能量转移数据一致(20)。当我们量化PCD19时(图9C. 和 9D),psyk(图10A 和 10B)和p-pi3k(图10C. 和 10D)与FCγRIIB-WT相比,微燃烧室完全丧失了抑制这些微团簇的集成功能的生长的能力。这些结果表明,通过FCγRIIB的TM域的TM域处于严格的调节,将BCR微生物杆菌与信号传递到活性状态的转换。
在共同连接到BCR时,FCγRIIB-I232T不能抑制PCD19微燃烧室的集成功能。 (A 和 C)针对每个指示的条件(单独的BCR交联或用WT或突变FcγRIIB共连接)是用于两个代表性BCR(A)或PCD19(C)微生物的TiRFM图像(最佳),它们合适的假型二维(中间)和2.5维(底部)高斯图像(底部)。秤条,1.5μm。 (B 和 D[所示是表达FCγRIIB-WT的ST486人B细胞内的指定数量的BCR(B)或PCD19(D)小组的集成文件的统计比较。顶面板)或fcγRIIB-I232T(底部面板)。条表示从2个独立实验中的至少20个细胞收集的平均值±SEM。一个学生 t 测试进行了测试 p value indicated, ***p < 0.001.
在共连接到BCR时,FCγRIIB-I232T不能抑制PSYK和P-PI3K微生箱的集成功能。 (A 和 C)针对每个指示的条件(单独的BCR交联或用WT或突变FcγRIIB共连接)是用于两个代表性psyk(a)或p-pi3k(c)微转移的Tirfm图像(最佳),它们合适的假型二维(中间)和2.5维(底部)高斯图像(底部)。秤条,1.5μm。 (B 和 D所示,用于表达FCγRIIB-WT的ST486人B细胞的ST486人B细胞内的PSYK(B)或P-PI3K(D)微团簇的集成FI的统计比较。 顶面板)或fcγRIIB-I232T(底部面板通过BCR交联或共连接激活。条表示从2个独立实验中的至少20个细胞收集的指定数微团簇的平均值±SEM。一个学生 t 测试进行了测试 p value indicated, *p < 0.05.
来自SLE患者的初级B细胞患有FcγRIIB-I232T纯合突变体的杂交突变性缺陷,在封闭B细胞活化事件
接下来,我们研究了来自SLE患者和健康对照对象的原发性B细胞中FcγRIIB的抑制作用。来自外周血的B细胞从6个健康对照组和37例诊断的SLE患者获得,并在报告的议定书中进行FCγRIIB的基因分型(22)。只有三个SLI患者对FCγRIIB-I232T突变均匀,与a一致<亚洲群体流行病学研究中纯合酶的10%发生率(5, 37–41)。对于Live-Cell Tirf成像实验,B细胞从三种捐助者获得性别和年龄,从以下类别中选择:SLE患者FcγRIIB-I232T的杂合或纯合,用于FcγRIIB的SLE患者,健康供体为FcγRIIB-I232T杂合子,和健康供体WtfcγRIIB。九个SLE患者注册了基于TIRF的体外细胞生物学研究,其具有类似的临床狼疮综合征的严重程度。
在我们的成像分析中,我们发现来自健康个体的B细胞WtfcγRIIB(图5A)FcγRIIB-I232T的杂合(图5B.)阻断IGM-BCR和CD19微蛋白的突触分层化。有趣的,来自SLE患者的B细胞WT用于FCγRIIB(图5C.)FcγRIIB-I232T的杂合(图5D)也与AG激活类似地响应。然而,对来自SLE患者纯合的B细胞的B细胞令人惊讶地,观察到阻断IGM-BCR和CD19微蛋白的突触分层化的严重缺陷(图5E.)。因为在人外周血中的IgM-BCR或IgG-BCR可以是阳性B细胞的阳性(35),我们还通过CD19微平板并联分析IgG-BCRS的突触分层化,发现了类似的结果(补充图4A-C)。
此外,我们发现来自SLE患者的B细胞WT用于FCγRIIB(图11A, 11D, 和 11G)FcγRIIB-I232T的杂合(图11B., 11E, 和 11H)有效地破坏了在微冲泡中BCR和P-PI3K的突触分层化。然而,来自SLE患者的B细胞纯合的FCγRIIB-I232T完全丧失了阻断BCR和P-PI3K分层化的能力,从而损害P-PI3K募集到的能力(图11C., 11F, 和 11I),建议超激活的PI3K信令。我们得出结论,对于TM域FcγRIIB-I232T突变体纯合的SLE患者的B细胞在阻断早期激活事件中显示出缺陷,重新强调该领域在维持免疫保护和免疫病变的平衡方面的重要性。
来自SLE患者的初级B细胞纯合的TM域FCγRIIB-I232T mutant show defects in blocking the synaptic colocalization of BCR and p-PI3K microclusters. (A–C) Shown are representative TIRFM images for BCR (red) and p-PI3K (green) microclusters within the IS of human primary B cells from an SLE patient WT for FcγRiib(a),对FC的杂合γRIIB-I232T(B),或FC纯合γ通过BCR交联或BCR和FC,通过BCR激活20分钟的RIIB-I232T(c)γRIIB共同连接。秤栏,1.5μm. (D–I) Shown are mathematical quantifications for the synaptic distribution (D–f)或积累(g–i)来自SLE患者原发性B细胞的BCR和P-PI3K微生物蛋白(a)中引入–(C)。数据来自至少21个细胞超过3个独立实验,每个圆点表示1个细胞的值。给出了三种患者样品中的一个的代表性结果。条表示意味着± SD. A Student t 测试进行了测试 p value indicated, **p < 0.01.
讨论
B细胞活化由BCR活化和抑制受体严格控制,所述抑制剂受体通常在细胞表面上共相交。在本报告中,我们鉴定了依赖于其TM结构域的FcγRIIB的先前无表特征抑制功能以阻断BCR和CD19微燃烧室的突触分层化。出乎意料地,这种抑制功能不需要在细胞质结构域中存在的良好表征抑制ITIM基序( 8, 15, 42–44)。我们建议TM域为FCγRIIB提供额外的抑制作用,以确保其独特的地位,作为唯一的抑制性IgG FCR下调免疫应答(45)。实际上,本报告中的数据支持FCγRIIB的概念,即通过两种相互综合的机制对B细胞激活的有效抑制因子:1)损害BCR和CD19分子的突触募集,2)稳定BCR和CD19的突触分层稳定小组。柬埔寨和同事(32, 46)是第一个报告FCγRIIB在抑制B细胞活化中的TM结构域的重要性,表明CD19的FCγRIIB介导的去磷酸化依赖于TM结构域,但不是FCγRIIB的细胞质尾部。虽然分子机制仍然尚不清楚,我们推测我们的结果,表明FcγRIIB的TM结构域可以抑制CD19至B细胞的募集,可以有助于解释他们的观察。 FCγRIIBTM结构域的重要性也是通过揭示FCγRIIB-I232T突变体与SLE疾病的强阳性关联的丰富的流行病学研究支持(7)。在日语,中文和泰语人群中首先鉴定了I232T多态性及其对人SLE的赋容易感性( 5, 37–41),然后后来在非洲(47)和白色人群(6, 48)。
FcγRIIB的TM域如何易于与细胞质ITIM主题无关的抑制作用?虽然我们不了解确切的机制,但我们推测TM域用脂质筏调节FCγRIIB的关联。我们和其他人报告了这种协会(20–22)。许多细胞生物学研究已经清楚地示出了脂质筏和TM域的动态相互作用在B细胞的激活中的动态相互作用(49)。实际上,具有BCR,CD19或FcγRIIB的脂质筏的各自的相互作用模式是完全不同的。 BCR与脂质筏的关联是瞬态和动态的(50, 51),脂肪筏的FcγRIIB-WT相当以快速和持续的方式(20)。更重要的是,BCR和脂肪筏的相互作用在FCγRIIB和CD19的双调节下。发现BCR交联单独诱导BCRS的易位进入脂质筏微米粉末;然而,在与FcγRIIB的共同连接时,FCγRIIB不稳定的BCR和脂质筏相互作用(29)。其他几项研究还揭示了CD19,当与BCR共同结扎时,增加了转向脂质筏的BCR的量,延长其居住,这可能考虑增强的B细胞活化(52, 53)。基于这些数据,我们推测筏脂质围绕FcγRIIB分子的TM结构域的持续冷凝可非常有效地阻断随后与BCR或CD19微生物蛋白酶的脂质筏微多型结合。我们的猜测是通过早期研究部分支持的,所述早期研究表明FCγRIIB-I232T突变体不能与BCR共同连接时与脂质筏微米瘤相关联(20–22)。
然后,下面的问题是:脂质筏族蛋白的TM域可以像LAT一样,替代FCγRIIB的TM域的功能?我们测试了这一假设,发现携带拉特TM的FcγRIIB-LAT-TM-DL250的嵌合构建不显示这种抑制功能。这些结果表明,唯一的组成型脂质 - 筏 - 梯田不能抑制BCR和CD19微蛋白的分致化。对于该结果可能有两个解释:首先,FCγRIIB的TM结构域的序列在施加其抑制作用以损害BCR和CD19分层化方面也很重要。其次,Sohn等人有一个早期的报告。 (29“表明FcγRIIB不位于静态B细胞中的脂质筏区中,但在BCR和FCγRIIB共连接时易于脂质筏。因此,FcγRIIB与脂质筏的共连接诱导的TM结构域的相互作用可能在抑制BCR和CD19的分致化方面发挥重要作用。无论如何,这些数据表明复杂的监管网络由FCγRIIB和CD19的功能用于平衡BCR和脂质筏的相互作用。显然,这种复杂的网络对于在AG识别期间保持对B细胞的适当响应是重要的,并且通过这样做,确保完美的稳态,平衡免疫保护和免疫病理学。
从我们的结果中出现了三个重要点,使用先进的三色延时TIRF成像来解释FCγRIIBTM域的抑制作用。首先,FcγRIIB-WT或FcγRIIB-I232T突变体显示出与BCR和FCγRIIB的共同结合的相当募集,表示FCγRIIB-I232T无法抑制的不能因其受损的突触招募而无法抑制;此外,PCI分析显示,BCRS在BCR和FCγRIIB后的FCγRIIB-WT或FCγRIIB-I232T与FCγRIIB-I232T同样地评估,表明两种情况下的相似的物理交联效果,第二种情况下,FCγRIIB-I232T仍然可以部分损害生长特征BCR微生物组织,但完全失去了抑制PCD19,PSYK和P-PI3K微生物蛋白生长的能力。这些结果表明,BCRS的突触募集受到FCγRIIB的TM和细胞质尾结构域的调节,而信号分子的募集更可能被FCγRIIB的TM结构域控制。第三,PCI对人体ST486b细胞中BCR和CD19的动态模式的动态模式证明了在B细胞活化的5分钟内增加了这些分子的分致化。在共连接条件下从5分钟开始,FcγRIIB-WT但不是FcγRIIB-I232T突变体损害了分层化。这些结果表明FCγRIIB需要一定的响应时间来抑制BCR和CD19微燃烧剂通过其TM结构域的突触分层化。该点也由人Ramos B细胞(10分钟响应时间)和原代人B细胞(10分钟响应时间)的结果支持。我们没有明确的机制来精确解释为什么FCγRIIB需要这种响应时间来抑制BCR和CD19微蛋白的突触分致化。我们假设FcγRIIB只能在BCR和FCγRIIB共连接后积累足够量的FcγRIIB分子累积时抑制BCR和CD19微生物蛋白的分子化的能力。我们的假设部分由前两点部分支持,如前所述。我们的假设也得到了两种额外的独立分析:第一,在BCR和FCγRIIB共连接后5-8分钟在5-8分钟内突触的FcγRIIB突触积累;其次,Pearson在共连接后5分钟的BCR和FcγRIIb的相关系数在5分钟内达到了5分钟,这表明存在响应时间以积累BCR微生物蛋白附近的足够量的FcγRIIB分子。因为FCγRIIB-WT和FCγRIIB-I232T显示在这两种分析中没有差异,所以我们提出这种抑制作用还需要FCγRIIB与脂质筏相关的能力。因此,我们的模型仅在足够量的FcγRIIB-wt时,但不是函数突变体FcγRIIB-I232T,累积在易于阻断BCR和CD19微生箱的分致稳定性CD19和/或BCR与脂质筏。我们目前的努力通过使用基于数学计算的分子模拟和超级分辨率成像方法来检查这些假设。
在本报告中,我们还表明,在B细胞的周边,更常见的BCR和CD19微生箱是与Batista及其同事的公布工作一致的(17)。他们的研究表明,BCR和CD19微生物蛋白随着B细胞扩散而高度上均可,使得当B细胞达到其最大扩散阶段时,>45%的AG相关的BCR微生物蛋白与CD19微蛋白分开。但是,作为Ag相关的BCR微生物蛋白合同到中央超分子激活簇(CSMAC),即,B细胞的中心区域是BCR和CD19微生物蛋白的分致化降低。然而,在本报告中,我们观察到BCR和CD19微生物蛋白的分致化在5分钟内增加,然后快速平稳。在接下来的10分钟内,仅发生非常温和的分层化效率降低。这种差异可以通过缺乏BCR微生物蛋白的明显收缩阶段在我们的实验系统中的人B细胞中的明显收缩阶段。事实上,Davey等人的TIRF成像研究。 (35)表明,与小鼠B细胞相比,人体B细胞在最大扩散后仅显示微妙的收缩响应,因此在遇到AGS之后,不会形成甚至10分钟的均匀组织的CSMAC。类似地,我们在拉莫斯和ST486人B细胞系和30分钟后观察到15分钟后的连续散布响应和人的原发性B细胞。因此,人B细胞对含Ag的PLBS的扩散动态可以解释为什么BCR和CD19微生物蛋白的分致化增加,然后在我们的实验中随着时间的推移增加。从这个角度来看,本报告中的观察结果与巴斯塔和同事的数据不一致( 17)BCR和CD19微生物蛋白在B细胞扩散阶段期间高度上均可。总之,FCγRIIBTM结构域在BCR信号中的抑制作用可以在功能上解释SLE患者B细胞的严重的超反应性特征(4–6, 21)。
披露
作者没有财务利益冲突。
致谢
我们感谢Susan K. Pierce博士(NIH),Klaus Rajewsky博士(Max-delbrück-的分子医学中心),以及Mark Shlomchik(耶鲁大学)博士慷慨地提供实验材料。我们感谢Susan K. Pierce博士,NIH,以及清华大学博士博士,为此手稿的批判性阅读。万里刘谨慎感谢苏珊K.Pierce在博士后研究中灌输指导。
脚注
这项工作得到了中国科技部(GRANTS 2014CB542500和2014AA020527),中国国家科学基金(GRANTS 81361120384和31270913),北京自然科学基金会(授予5132016),博士学位中国教育部课程基金会(GRANTS 20130002110059和20120002120007),清华大学倡议科研计划(授予20131089279)和中国医学协会(授予12040670367)。
本文的在线版包含 补充材料.
本文中使用的缩写:
- CSMAC.
- 中央超分子激活簇
- FI.
- 荧光强度
- 我知道了
- 免疫复合体
- 是
- 免疫突触
- MFI.
- 平均荧光强度
- NIH
- 国立卫生研究院
- PCI.
- Pearson的相关指数
- PLB.
- 平面脂双层
- ROI.
- 兴趣区域
- sle
- 系统性红斑狼疮
- Tirf.
- 全内反射荧光
- Tirfm.
- tirf显微镜
- TM值
- 跨膜
- WT.
- 野生型。
- 已收到 2014年1月15日。
- 公认 2014年4月1日。