抽象的
含四个损伤/ IL-1R结构域的衔接子蛋白MYD88，MAL，TRIF和电车很好地建立为微生物检测后TLR信令和基因诱导的基本介质。相比之下，第五，最具进化保守的Toll / IL-1R适配器，无菌α和加热/犰狳含有蛋白质（SARM）的功能仍然难以捉摸。最近的研究SARM.. - / - 小鼠突出了CNS在应激诱导的神经元细胞死亡和免疫应答中的SARM作用。但是，SARM是否在外周骨髓免疫细胞中对免疫反应中的作用不太清楚。因此，我们在SARM缺陷的鼠巨噬细胞中表征了TLR诱导的细胞因子反应，并发现了CCL5生产中的SARM的要求，而TNF，IL-1β，CCL2和CXCL10的基因诱导是SARM的。 TLR诱导的MAPK或涉及CCL5诱导，即NF-κB和IFN监管因素的转录因子不需要SARM，也不需要CCL5.mRNA稳定或拼接。然而，SARM对于募集转录因子和RNA聚合酶II至关重要CCL5.启动子。令人惊讶的是，CCL5诱导的SARM的要求不限于TLR途径，因为它在细胞溶质RNA和DNA反应中也显而易见。因此，该研究鉴定了巨噬细胞中CCL5表达中的SARM的新作用。
本文介绍 在这个问题上，p。4467
介绍
在通过模式识别受体（PRRS）检测侵入病原体后，巨噬细胞如巨噬细胞的先天免疫细胞是关键球员。 PRR与其微生物配体的参与引发了发信号级联，导致MAPK和转录因子的激活，例如NF-κB和IFN调节因子（IFN）（1）。这些转录因子随后易于核，结合促炎细胞因子（例如，TNF，IL-1β），趋化因子（例如，CCL5，CCL2，CXCL10）和I IFNS（IFN-α和IFN-β）的特异性启动子元素。 ）上调基因表达。
一个主要的PRR系列是膜结合的TLR，其通过含有不同的Toll / IL-1R（TIR）含有结构域的衔接子蛋白质，即MyD88，MyD88-Adapter样蛋白（MAL），含TIR结构域的含量相互作用适配器诱导IFN-β（TRIF）和TRIF相关的衔接子分子（电车）（2）。 TLR4位于等离子体膜上，在那里检测LPS。 TLR4利用所有四种适配器蛋白来信号传导，激活来自质子膜的MAL / MyD88依赖性途径，然后从底糖瘤中进行TLR4内化和电车/ TRIF信号传导。相反，微生物核酸感测TLR，即TLR3，TLR7和TLR9在内体上表达，其中分别感测病毒DSRNA，SSRNA或CPG DNA（1）。然后招募单个TIR适配器以介导下游信令，这是TLR3和TLR9的TLR3和MYD88的TRIF。除了TLRS之外，普遍地表达RNA和DNA传感器在许多不同细胞类型的胞嘧啶中发现以检测细胞内病毒（3）。这种细胞溶质PRR包括视黄酸诱导基因I的受体视黄酸 - 诱导基因I和黑素瘤分化相关基因5，其通过适配器线粒体抗病毒信号传导和诸如IFN诱导的细胞溶质DNA传感器感测病毒RNA和信号。蛋白质16和环状GMP-AMP合成酶，其通过IFN基因的内质网常蛋白刺激器（Sting）（STING）（3）。
含无菌α和加热/犰狳的蛋白质（SARM）具有C末端TIR结构域，因此预期在TLR途径中起作用（4）。值得注意的是，SARM在哺乳动物之间高度保守， 果蝇和蠕虫实际上是含细胞溶质TIR蛋白质的最进化的保守成员（5）。与其他四个TIR适配器蛋白不同，早期研究表明过表达的SARM没有导致NF-κB和IRF3活化（6, 7）。相反，通过与TRIF的直接交互（7）。但是，研究 SARM.. - / - 小鼠主要揭示了SARM的神经元功能。在Kim等人的初步研究中。 （8（9）。在这两种情况下，发现SARM通过细胞凋亡引发神经元细胞死亡，而SARM也被发现是由Wallerian变性所必需的，由此受损神经元通过非凋亡细胞死亡途径死亡（10, 11）。此外，发现SARM通过控制树突厌恶和产物来调节神经元形态（12）。从进化的角度来看，这些新发现的哺乳动物SARM功能与SARM的作用一致 Caenorhabditis elegans. 神经元发育和缺氧死亡中的矫反壁TIR-1（13, 14）。 TIR-1在蠕虫中MAPK级联的上游功能，并且还被证明通过控制抗菌肽诱导（6, 15）。还证明了SARM在CNS中具有哺乳动物免疫的作用，例如Szretter等。 （16）报告说 SARM.. - / - 感染神经疗法西尼罗病毒（WNV）的小鼠展示了病毒间隙的缺陷，并在脑干中减少了TNF生产。但是，SARM是否对小鼠的外周性先天免疫中有任何作用，该仍然不清楚。
鉴于巨噬细胞在外周先天免疫防御中的重要性，我们研究了小鼠SARM在骨髓衍生的巨噬细胞（BMDMS）中的细胞因子反应中的潜在作用。我们发现，响应于TLR4和TLR7刺激而最佳CCL5生产需要SARM，而TNF和其他一些促炎细胞因子和趋化因子的诱导是均无伤害的。因此，令人惊讶的是，在没有SARM的情况下通常在CCL5诱导，即NF-κB，IRF3和IRF1中致力于CCL5诱导，即NF-κB，IRF3和IRF1的关键转录因子，如MAPK，P38，JNK和ERK。相反，染色质免疫沉淀（芯片）分析 SARM.. - / - BMDMS揭示了SARM用于募集转录因子和RNA聚合酶II（POL II） CCL5. 推动者，转录诱导的一个关键步骤 CCL5. (17）。因此，对CCL5诱导的非TLR途径也取决于SARM。因此，SARM在小鼠BMDMS中的CCL5趋化因子诱导中具有重要作用。
材料和方法
小鼠和细胞培养
一代 SARM.. - / - 之前描述了C57BL / 6背景的小鼠（8）。野生型（wt）和胫骨的股骨和胫骨 SARM.. - / - 根据马萨诸塞州医学院动物医学和机构动物护理和使用委员会提出的指导方针，从Massachusetts医学院大学获得小鼠。在完全DMEM（DMEM加谷氨酸，10％（v / v）Fcs，10μg/ ml环丙氟苯甲酰辛）中，将原发性BMDM与骨髓细胞分化为7天，补充有15-20％（v / v）L929上清液作为源m-csf。在第7天，细胞被胰蛋白酶化和接种在完全DMEM中进行实验。永生化WT和 SARM.. - / - 用J2重组逆转录病毒携带产生BMDMS V-MYC. 和 V-RAF / MIL 如前所述的癌症（18, 19）。在I.P之后，从小鼠4d中分离出硫代糖基因术巨噬细胞。注射无菌3％硫代糖醇（Remel，Lenexa，Ks）。 NIH3T3细胞和HEK293T细胞分别从Sigma-Aldrich和欧洲细胞培养物收集购买，并保持在完整的DMEM中。
受体激动剂和细胞转染
Ultrapure LPS 大肠杆菌，serotype eh100（>99.9％纯粹关于污染蛋白质和与激动性TLR活性的DNA的纯度）来自alexis生化，Clo75来自于invivogen，小鼠Rifn-α来自Miltenyi Biotec，多胞聚环酸（Poly（I：C））来自Sigma- aldrich。疫苗病毒（VACV）70-BP DSDNA寡核苷酸（DSVACV 70mer）由MWG Biotech合成，如前所述（20）通过将混合物加热至99℃并缓慢冷却至室温，通过将互补链进行退火。使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）用聚（I：C）或DSVACV 70mer转染细胞。
抗体
用于免疫印迹的主要ABS是抗β-肌动蛋白（AC-74）和来自Sigma-Aldrich的抗标志（M2），抗IкBα（来自邓迪大学，英国邓迪大学的R. Hay教授的礼物），抗磷酸 - jnk（thr183/ Tyr.185，44-682g）来自BioSource International，Anti-P38（No.9212），抗磷酸P38（Thr180/ Tyr.182， 不。 9211），抗JNK（NO.9252），抗磷酸-ERK1 / 2（THR202/ Tyr.204， 不。 4377）和抗磷酸盐（Tyr701， 不。 9171）来自小区信号传导技术。用于免疫印迹的二次ABS是IRDYE 680LT抗小鼠，IRDYE 800CW抗兔和IRDYE 680LT抗山羊（Li-Cor Biosciences）。共聚焦显微镜的初级ABS是来自Santa Cruz生物技术和抗IRF3（NO.51-3200）的抗P65（F-6，SC-8008）来自Invitrogen，而二次ABS是Alexa Fluor 647抗小鼠或Alexa Fluor 488抗兔（Invitrogen）。用于芯片的ABS是抗POL II（N-20，SC-899X），抗P65（C-20，SC-372X），防IRF1（M-20，SC-640x）和防IRF8（ C-19，SC-6058X）从Santa Cruz Biotechnology，抗IRF3（NO.51-3200）来自Invitrogen，和同种型对照兔IgG（Sigma-Aldrich）。中和IFNAR1 AB（MAR1-5A3，NO.16-5945）购自埃比科。
定量RT-PCR
对于mRNA表达分析，将细胞接种在4×105 24孔板中的细胞/ ml，并如下一天所示刺激。根据制造商的说明，使用高纯RNA分离试剂盒（罗氏）提取总RNA，并用随机六烷烃（MWG Biotech）用随机六烷烃（MWG Biotech）进行逆转录转录酶（Promega）。通过使用Sybr绿色定量PCR母混合物GOTAQ（PRomega）或Kapa Sybr Fast Uncass（Kapa Biosystems）和基因特异性引物对通过定量RT-PCR分析cDNA（表I.）。使用比较计算相对mRNA表达 CT 方法，将感兴趣的基因正常化为家务基因 β-肌动蛋白，并将其与未处理的样品进行比较，作为校准器。
埃莉莎
免疫印迹
细胞以4×10接种5 六孔板中的细胞/ ml并如下一天所示刺激。用冰冷的PBS洗涤细胞，在-80℃下冷冻过一次，然后刮到80μl裂解缓冲液（50mM Tris [pH 7.4]，150mM NaCl，30mM NaF，5mM EDTA，10％ [v / v]甘油，40mMβ-甘油磷酸，1％[v / v] Triton X-100，含有抑制剂1mm Na 3vo.4，1mM PMSF和1％[v / v]抑肽酶），并在冰上留在冰上45分钟。将清除裂解物与3×样品缓冲液混合（187.5mm Tris [pH 6.8]，6％[W / V] Sds，30％[V / V]甘油，0.3％[W / V]溴苯酚蓝，150 mm DTT）并在99℃下煮沸5分钟。将二十微升裂解物在10％SDS-PAGE上解析，转移到聚偏二氟化乙烯膜（Millipore），在PBS中封闭1小时，并用原发性AB（1：1000稀释）探测过夜阻塞解决方案）。第二天，使用奥德赛成像系统（Li-Cor Biosciences），将膜与二次ABS（1：8000稀释）一起温育（在阻断溶液中稀释）。
共聚焦显微镜
将细胞接种在3×105 玻璃盖玻片上的细胞/ mL在24孔板中，并如图所示刺激第二天。将细胞以4％（w / v）多聚甲醛固定在4％（w / v）多聚甲醛中，在PBS中透明15分钟，在0.5％（v / v）Triton X-100中透明15分钟。在PBS的5％（w / v）BSA / 0.05％（v / v）吐温中封闭盖子1小时，并用伯腹肌染色过夜（封闭溶液中1：200稀释）。第二天，盖玻片用二次ABS（封闭溶液中的1：500稀释）孵育3小时，并安装在含有1μg/ ml DAPI的MOWIOL 4-88（CALBIOCHEM）中。使用×60油浸泡物镜用奥林巴斯FV1000共聚焦显微镜获得图像。
记者基因测定
724-AA鼠SARM（SARM_724）被亚克力来自PGW1-SARM1（来自Y.P. Hsueh，Capica，Sinica，Taipei，Taiwan，Taiwan）的礼物，764-AA鼠SARM（SARM_764）亚克隆来自PUPO-MSARM1B（InvivoLON）。将两种同种型与附着在哺乳动物表达载体PEF-BOS中的C末端旗杆标签克隆。 -190至+57 CCL5. 将基因启动子区域（转录开始点指定+1）从初级WT BMDMS的基因组DNA克隆到PGL3-对照载体（PRomega）中，取代SV40启动子，并产生PGL3-CCL5. 启动子萤火虫荧光素酶报告基因构建体。小鼠（-1260）pgl3-TNF. 促进剂荧光素酶报告总因构建体是来自D.V的礼物。库普拉什（俄罗斯科学院，莫斯科，俄罗斯）。对于报告基因测定，将NiH3T3细胞接种在0.8×105 细胞/ ml在96孔板中，用150 ng sarm_724，SARM_764或PEF-BOS空载体对照，60ng pgl3-转染16小时CCL5. 或者 pGL3-TNF. 启动子记者，20 NG PGL3-Renilla. 荧光素酶使用基因转染试剂（Novagen）。转染后四十八小时，细胞在被动裂解缓冲液（Promega）中裂解并分析了荧光素酶活性。萤火虫荧光素酶活性被标准化为 Renilla. 荧光素酶活性控制转染效率。
逆转录病毒转导
SARM._724从PGW1-SARM1亚克隆，并且SARM_764从PUPO-MSARM1B亚克隆，附着在逆转录病毒表达载体PMSCV-NEO中的C末端FLAG标签。在HEK293T细胞中产生逆转录病毒颗粒：将细胞接种在2×105 在10厘米的盘子中，用3μgPMSCV-SARM_724，PMSCV-SARM_764或PMSCV空载体对照，与1μgVSV-g和1μgGag-pol质粒一起转染第二天，使用15μlGAG-G-POL质粒转染。制造商的说明。然后介于以后更换8小时。转染后，将逆转录病毒上清液在转染后收获48和72小时，通过0.45-μm过滤器过滤。 NiH3T3细胞以1×10接种 5 在10厘米的培养中细胞/ ml，并在第二天用病毒上清液混合1：1与新鲜培养基和6μg/ ml含脲（Sigma-Aldrich）进行转导。以后重复转导，在含有1mg / ml G418（BD Biosciences）的培养基中选择另外48小时的细胞10d。对于永生化BMDMS的转导，细胞在3×10处接种5 在六孔板中的细胞/ ml，并在2000×以2000×含有8μg/ ml含有8μg/ ml的含有8μg/ ml的病毒上清液的第二天纺丝 g 在20°C时为1小时。以后重复旋纱，并如对于NIH3T3细胞所述培养细胞。通过免疫印迹确认外源蛋白的表达。
芯片
该协议适用于Nelson等人。 （21）。细胞（1.5×107）将15厘米的菜肴播种成15厘米，如在收获之前第二天所示刺激。将甲醛加入到培养基中以终浓度为1％（v / v），以在室温下将细胞固定10分钟，然后用125mM甘氨酸（1M储备溶液）淬灭反应5分钟。用冰冷的PBS洗涤细胞单层，并刮到10mL PBS中。在1mL碎片缓冲液中裂解（50mM Tris-HCl [pH 7.5]，150mM NaCl，5mM EDTA，0.5％[V / V] Nonidet P-40，0.5％[V / V] Nonidet P-40，将细胞粒料再次用1mL PBS洗涤1mL PBS。 [v / v] Triton X-100，含有1 mm Na的抑制剂 3vo.4，1mm PMSF和1％[v / v]抑肽酶]。立即离心裂解物，用1mL芯片缓冲液洗涤核粒料。将沉淀重悬于1mL芯片缓冲液中并使用带有微辐射的布兰森超声器250超声处理。对于BMDMS，发现每个循环之间的凝冰八个18×1-S脉冲（电源输出3,90％占空比），发现在每个循环之间凝固1分钟，从200到1000bp的范围产生最佳DNA片段尺寸。通过离心清除剪切染色质。对于每种免疫沉淀，剪切染色质当前相当于2×106 将细胞与芯片缓冲液制成高达300μL，并在4℃下在旋转时在4℃或同种型对照（IgG）下在4℃下孵育过夜。第二天，用100μg鲑鱼精子DNA（Invitrogen）和0.5mg BSA / 1ml珠子（芯片缓冲液中50％浆液）阻断45分钟的蛋白A或蛋白A / G-Sepharose珠粒（Sigma-Aldrich）45分钟然后在芯片缓冲液中洗涤一次。在旋转的同时将封闭的珠子（40μl; 50％浆料）与清除的染色质免疫合并在4℃下孵育1小时。然后在100μlChelex之前用芯片缓冲液（无抑制剂）用碎屑（无抑制剂）洗涤珠子（10％[W / V]浆液2O;将Bio-rad）加入珠子中。将样品涡旋并在99℃下煮沸10分钟。冷却后，加入1μl蛋白酶K（20μg/ ml; QIAGEN）并在55℃下振荡孵育40分钟。再次煮沸样品，离心，并收集70μL上清液（含有DNA）。在不同的方案中，250μL1％（W / V）SDS / 0.1M NaHCO3 加入洗涤后的珠粒颗粒代替CHELEX中，并在摇动时在65℃下搅拌复合物2小时。收集洗脱液并在65℃下在65℃下孵育过夜以反转交联。第二天，加入等体积的TE缓冲液和1μLRNase（100mg / mL; QIAGEN）并在37℃下孵育1小时。然后，将样品与3μL蛋白酶K一起在55℃下孵育2小时，然后沸腾。用奇柱SV凝胶和PCR清理系统（PRomega）纯化DNA片段，并在40μLH中洗脱2将O.使用Sybr Green Kapa Universend and Primer对对基因启动子的近端区域（表I.）。
统计分析
通过棱镜（GraphPad软件）分析所有数据，并使用双尾未配对学生确定统计显着性 t test.
结果
巨噬细胞最佳TLR诱导的CCL5表达需要SARM
为了研究SARM在鼠巨噬细胞中的潜在功能，我们生成了来自WT的BMDMS SARM.. - / - 老鼠。通过基因组的PCR分析证实细胞的基因型 SARM.. locus (补充图1A）。如前所述，SARM蛋白表达难以评估目前可用ABS的外周细胞（数据未显示）（8, 16）。但是，分析 SARM.. mRNA在WT BMDMS中揭示了SARM的明确表达（补充图1B）。已经报道了两种小鼠SARM同种型，其长度为724和764 AA（这里分别称为SARM_724和SARM_764），后者是拼接变体，其具有在第二无菌α基序和TIR结构域之间的延伸区域。进一步的PCR分析确定BMDMS主要表达SARM_724，而SARM_764几乎无法检测到（ 补充图1C），其与小鼠T细胞中SARM的表达谱一致（22）。
为了确定SARM是否在巨噬细胞中的TLR介导的细胞因子诱导中具有作用，检查了TLR4和TLR7依赖性响应，因为TLR4信号传导部分TRIF依赖性，而TLR7仅依赖于MYD88。用TLR4激动剂LPS或TLR7激动剂CL075和细胞因子mRNA诱导对BMDMS进行处理超过24小时。惊人， CCL5. 与LPS和CL075的WT细胞相比，MRNA诱导在SARM缺陷BMDMS中显着受损（图。1A, 1B），和CCL5蛋白质生产一样（图1C., 1D）。同时，SARM缺乏症不影响TNF mRNA或蛋白质的诱导响应TLR刺激（图1E-H），也不会影响TLR刺激的诱导 Il1b, Ccl2， 或者 Cxcl10 mRNA (补充图2）。重要的是，SARM的要求不限于骨髓衍生的巨噬细胞，因为CL075诱导的CCL5在与WT细胞相比的SARM缺陷型腹膜巨噬细胞中也显着受到损害（图。1I.）。
SARM.是最佳的TLR诱导的CCL5表达所必需的，但是对于TNF可以分配。主要wt和 SARM.. - / - 用100ng / ml LPS刺激BMDMS（A, C, E, G）或5μg/ ml CLO75（B, D, F, H）对于指示的次数，或中等为控制。 CCL5. （a，b）和 TNF. （E，F）通过定量RT-PCR测定mRNA，标准化为内务机会 β-肌动蛋白，并且相对于未经处理的WT控制呈现。通过ELISA测定用于CCl5（C，D）或TNF（G，H）蛋白的上清液。 （I）腹膜巨噬细胞由WT和 SARM.. - / - 小鼠和10个刺激μg / ml cl075 24 h。通过ELISA测定上清液用于CCL5。数据是手段± SD of triplicate samples and are representative of at least three independent experiments. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p <0.001与wt相比（学生 t test).
为了确认SARM在CCL5归纳中的作用，我们重构 SARM.. - / - 使用逆转录病毒转导的SARM_724或SARM_764的BMDMS。 SARM.. - / - BMDMS与SARM_724重建完全恢复的TLR7诱导的CCL5生产，并响应TLR4（）也会增强CCL5至几乎WT水平。图2A, 2B）。 SARM_764表达的细胞也响应于TLR刺激而恢复了一些生产CCL5的能力（图2A, 2B），但在比SARM_724-Recreadtuted细胞相比，与SARM_764蛋白的较低表达相关的程度，与SARM_724（图2C.）。接下来，我们在WT BMDMS中过表达SARM的同种型，与空载体控制相比，TLR4和TLR7诱导的CCL5水平显着升高（图2D-F.）。以类似的方式，我们在稳定过度表达SARM中检查了NIH3T3细胞中的TLR4诱导的CCL5蛋白。与BMDMS的结果一致，这种不同的鼠细胞类型也显示出显着增强的TLR4诱导的CCL5表达，当根本表达了SARM同种型时（图2G, 2H）。在一起，这些数据清楚地显示了在外围小鼠细胞中TLR诱导的CCL5表达中的SARM的作用。
SARM.救援CCL5生产的逆转录病毒表达 SARM.. - / - BMDMS和增强在WT细胞中的CCL5表达。永生化WT和 SARM.. - / - BMDMs (A–C），永恒的WT BMDMS（D–F）或niH3T3细胞（G, H) were stably transfected with SARM_724-Flag (S724), SARM_764-Flag (S764), or pMSCV empty vector (EV) control using a retroviral system. Cells were stimulated for 24 h with 1 ng/ml LPS (A), 100 ng/ml LPS (D, G), 5 μ通过ELISA测定G / ML CLO75（B，E）或培养基作为对照（模拟）和上清液，用于CCL5蛋白。数据是手段±三份样品的SD，具有至少三种独立实验的代表。 （C，F和H）细胞裂解物经受SDS-PAGE和使用特定AB的SARM免疫印迹，或者β-actin as a loading control. The molecular mass markers are indicated to the left of the gel (in kDa). *p < 0.05, **p < 0.01, ***p <0.001与SARM2 / 2 EV（A，B）或WT EV相比（D，E，G）（学生 t test).
SARM.可以随时用于激活CCL5表达中的转录因子
为了进入SARM介导的CCL5调节机制，我们首先定义了在BMDMS中上调CCL5表达的信号传导途径。 TLR刺激导致MAPK和几种转录因子的激活，包括NF-κB和IRF3，其共同诱导初级反应基因的表达（PRGS）。 PRGS本身调节了进一步的反应，有些参与诱导次级反应基因（SRG）。这一点的特定例子是TLR诱导的I IFN，其随后通过IFN-α/β受体（IFNAR）信号来上调许多IFN刺激的基因（ISG）（23）。为了确定TLR诱导的CCL5是否是BMDMS中的PRG和/或SRG，在通过TLR4刺激引发CCL5产生之前，用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）预处理WT BMDM。正如预期的那样，ISG Ifit2，已知通过IS IFS响应于TLR4刺激分泌的I IFS来上调（24），在CHX处理细胞中显示出降低的mRNA表达（补充图3B）。相比之下，诱导 CCL5. mRNA在CHX存在下没有损害（补充图3A），建议直接转录诱导 CCL5. 作为TLR4刺激后的PRG。此外，阻断型I IFN介导的与IFNAR阻断AB的反应不影响TLR4的CCL5诱导（补充图3C），而这确实抑制了ISG的诱导 Ifit2 和 Irf7 (25），因为它禁止I型IFN信令（补充图3D-F）。因此，与已发布的数据交易（26）， CCL5. 是TLR刺激的BMDMS中的PRG。
因此，预计SARM直接调节TLR信号通路以促进CCl5表达，因此我们测试了CCl5诱导所需的转录因子是否需要SARM。为了定义与BMDMS中的TLR4介导的CCL5诱导相关的转录因子，我们评估了它们的结合 CCL5. 推动者使用芯片分析。在以前涉及不同细胞类型的CCL5诱导的转录因子中，通过不同的刺激（27–30），我们观察到NF-κBP65亚基，IRF3和IRF1，而不是IRF8的瞬态招募 CCL5. BMDMS的启动子响应LPS（图3A）。在1小时LPS刺激后，P65和IRF3升高到启动子，而IRF1启动子占据LPS后3小时最大化（图3A）。因为响应于TLR刺激，IRF1诱导IRF1，因为I型IFN诱导（31），对于TLR4诱导的CCL5不太可能是必不可少的，因为 CCL5. mRNA诱导是I型IFN独立的（补充图3C）。因此，我们检查了NF-κB或IRF3的活化是否在没有SARM的情况下受到损害。首先通过监测NF-κB，IκB的胞质抑制剂的LPS诱导的降解来间接评估NF-κB的活化，发现未发现不受SARM（图3B.）。此外，共聚焦显微镜表明，在缺乏SARM的细胞中，LPS诱导的P65转移到核的正常情况（图3C.）。这也是IRF3易位到核的情况（图3C.）。我们还对SARM响应于I IFN的IDN（图。3D），而Irf8没有招募到 CCL5. 响应LPS刺激的启动子未被TLR4或IFNAR信号传导诱导（图。3D 和 data not shown).
SARM.可分配用于激活招聘的转录因子 CCL5. 启动子。 (A）用100ng / ml LPS刺激未加工的WT BMDM，用于指定的时间或培养基作为对照。将剪切的染色质裂解物用ABS对NF-кBp65，IRF3，IRF1和IRF8，或同种型对照（IgG;未示出）进行芯片。通过针对特异性的底漆对通过定量RT-PCR分析沉淀的DNA和输入DNA CCL5. 启动子。结果被标准化为输入和呈现为每种转录因子的富集 CCL5. 启动子相对于未经处理的对照。数据是PCR技术三份酸盐的±SD，并且代表至少两个独立实验。 （B 和 D）主要wt和 SARM.. - / - 用100ng / ml LPS（b）或1000 u / ml IFN刺激BMDMS-α（d）用于指示的时间，或中等为控制。对细胞裂解物进行SDS-PAGE并用特定ABS免疫印迹到iкB（b）或IRF1和IRF8（D;箭头表示特定频段）。β-actin served as loading control. The molecular mass markers are shown to the left of the gel (in kDa). (C）主要wt和 SARM.. - / - 在玻璃盖玻片上生长的BMDMS刺激了1小时，用100ng / ml LPS或培养基作为对照（模拟），然后用特定于NF的ABS固定并染色кb p65（红色）或IRF3（绿色）。使用DNA嵌入染料DAPI（蓝色）可视化核。尺度条，10μm. The data (B)–（d）代表至少三个独立实验。
鉴于TLR4的NF-κB也不是IRF3的IRF3依赖性，并且鉴于P38 MAPK途径上游的蠕虫SARM（TIR-1）的作用 C。 Elegans. (6），我们另外评估了LPS引起的三个主要麦地图，P38，JNK和ERK的激活，这可能有助于 CCL5. promoter activity (28）。但是，我们观察到类似程度的MAPK磷酸化 SARM.. - / - BMDMS与相应的WT相比（补充图4），建议哺乳动物SARM不调节BMDMS中的MAPK途径。在一起，数据表明，在TLR4刺激的CCl5表达中涉及的主要转录因子的激活不需要SARM，也不涉及激活Mapks P38，JNK和ERK。
SARM.调节转录因子和POL II的募集到CCL5启动子
SARM.未参与BMDMS中NF-κB和IRF3的激活的发现与缺乏对诱导其他NF-κB和IRF3依赖性TLR诱导基因的SARM的要求一致（图1E-H, 补充图2）并提出了CCL5调节中的SARM更直接的基因特异性作用。因此，我们接下来检查了CCL5表达式调控中SARM的潜在作用。与诱导相比 TNF. mRNA，这是迅速和瞬态的， CCL5. mRNA诱导更延迟，逐渐增加在更长的时间内（32）（图。1A, 1B, 1E, 1F）。不同的mRNA感应动力学主要是由于 TNF. 由于3'未经翻译的地区，MRNA不稳定，而且 CCL5. mRNA缺乏这些因素，并被发现特别稳定（32）。测试SARM是否在维护中有任何作用 CCL5. 免疫刺激后mRNA稳定性，LPS诱导的稳定性 CCL5. mRNA在wt和 SARM.. - / - 转录后的BMDMS被放射素D蛋白D封闭。预期， TNF. 辐射霉素D治疗后mRNA在快速衰减，而没有观察到衰减 CCL5. mRNA over 60 min (图4A, 4B）。重要的是，没有SARM没有挑起任何不稳定性 CCL5. mRNA，表明SARM在mRNA稳定水平下没有发挥其CCL5调节作用。
SARM.调节启动子的CCL5表达，并没有发布。 （A 和 B）主要wt和 SARM.. - / - BMDMS预测3小时，用100ng / mL LPS，然后用5个处理μg/ml actinomycin D (Act. D) for the indicated times or DMSO as control. CCL5. （a）和 TNF. （b）通过定量RT-PCR测定mRNA，标准化为管家基因 β-肌动蛋白，并且与每个WT或每个WT或每个WT相比呈现剩余百分比 SARM.. - / - control. (C–F）主要wt和 SARM.. - / - 用100ng / ml LPS（C，E）或5刺激BMDMSμg/ml CLO75 (D, F）对于指示的次数，或中等为控制。 CCL5. 通过定量RT-PCR测定前mRNA（C，D）或成熟mRNA（E，F），标准化为管家基因 β-肌动蛋白，并且相对于未经处理的WT控制呈现。 （G 和 H）将NiH3T3细胞与150ng SARM_724-FLAP（S724），S724），SAM_764标志（S764）或PEF-BOS空向量（EV）控制转染48小时，以及PGL3-CCL5. 启动子荧光素酶报告基因（G）或PGL3-TNF. 启动子荧光素酶报告基因（H）和对照PGL3-Renilla. 荧光素酶基因。然后测量荧光素酶活性，标准化为 Renilla.，并相对于EV控制呈现。所有数据都是三次样本的±SD，并且代表至少两个独立实验。 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p <0.001与wt相比（c–F) or EV (G, H) (Student t test).
最近的一项研究表明基因的延迟表达，例如 CCL5.，由延长的剪接时间而不是转录启动中的滞后（33）。因此，我们询问是否会在监管中存在缺陷 CCL5. 在没有SARM的情况下拼接RNA拼接。如果是这样， CCL5. 预计前体mRNA（前mRNA）将积累 SARM.. - / - BMDM与WT细胞相比。因此，我们设计了特定的底漆对以区分未亮相 CCL5. 来自剪接转录物的RNA（内含子）并进行时间过程，以在TLR4和TLR7激活后监测两种形式的表达动力学。我们观察到高峰表达 CCL5. 在LPS和6小时后，预先mRNA 3小时刺激后，此后逐渐减少（ 图4C., 4D）。未减少的成绩单恰逢剪接稳定增加 CCL5. 刺激后持续24小时的mRNA（图4E., 4F）。然而， CCL5. 前mRNA没有积聚在缺陷细胞中，而是与成熟mRNA相似，与WT细胞相比，在没有SARM的情况下显着降低（图4C., 4D）。这排除了在转录诱导或之前的RNA剪接和建议的SARM调节CCL5的SARM的作用 CCL5. promoter.
因此，我们接下来检查了SARM异位表达激活的潜力 CCL5. 在控制的控制下直接使用荧光素酶报告基因的启动子 CCL5. 小鼠NIH3T3细胞的启动子。明显触发小鼠SARM的表达 CCL5. 启动子诱导同时没有积极影响 TNF. promoter induction (图4G., 4H），支持SARM刺激转录启动的作用 CCL5. 启动子。进一步探索SARM在诱导内生的作用 CCL5. 启动子，我们在WT和芯片分析 SARM.. - / - BMDMS为招聘Pol II。这是一个关键实验，如在CCL5的情况下，刺激诱导的POL II招募到启动子是转录诱导的标志（17）。分析表明，缺乏缺陷的细胞在招募POL II的能力中显着受损 CCL5. 启动子响应TLR4和TLR7信令（图5A, 5B）。为了确定这种观察的特殊性，我们还在审查POL II占用 TNF. 启动子。与CCL5相比，已知TNF POL II已经存在于此 TNF. 促进剂在没有细胞刺激的情况下（17），这在我们的芯片研究中也显而易见，其中Pol II在易于检测的 TNF. 在未刺激细胞中的启动子，并且在3小时内没有显着增加，TLR4或TLR7刺激（图5C., 5D）。与CCL5启动子相反，TNF启动子的POL II丰度在WT和SARM缺陷的BMDMS之间相当（图5C., 5D）。这与TNF诱导与SARM无关的事实一致（图1E., 1F）。
SARM.是最佳的POL II招聘和转录因子组合所必需的 CCL5. 启动子。 (A–D）主要wt和 SARM.. - / - 用100ng / ml LPS（A，C）或5刺激BMDMSμg/ml CLO75 (B, D）对于指示的次数，或中等为控制。 Sheared chromatin lysates were subjected to ChIP with an Ab specific to RNA Pol II or an isotype-control Ab (IgG). Precipitated DNA and input DNA were analyzed by quantitative RT-PCR using primer pairs specific for the CCL5. 或者 TNF. 启动子。结果是指向输入的标准化，并作为折叠富集POL II的折叠 CCL5. 启动子（A，B）或 TNF. 启动子（C，D）相对于未处理的WT对照。 （E–K）主要wt和 SARM.. - / - 用100ng / ml LPS刺激1小时的BMDMS（e–G, J), 5 μG / ml CLO75（H，I，K），或媒介为控制（模拟）。将剪切的染色质裂解物用特定于NF的ABS进行芯片进行芯片кB P65（E，H，J，K），IRF3（F），IRF1（G，I）或IgG控制。分析样品（a）中的样品–(D) and are presented as fold enrichment of each specific transcription factor at the CCL5. 启动子（E-I）或 TNF. 启动子（J，K）相对于模拟处理的WT细胞。所有数据都是PCR技术三份酸盐的±SD，并且代表至少三个独立实验。 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p <0.001与wt相比（学生 t test).
招聘Pol II CCL5. 已知启动子被严格控制和高度依赖于转录因子结合和染色质重塑（34, 35）。因此，尽管发现转录因子激活不受SARM消融的影响（Fig. 3），我们对芯片分析进行了调查是否需要SARM对转录因子的结合 CCL5. 启动子。有趣的是，TLR4和TLR7介导的转录因子招募 CCL5. 启动子显着损害 SARM.. - / - BMDMS与相应的WT细胞相比（图5E-I）。因此，最佳地招募P65，IRF3和IRF1到 CCL5. 响应于TLR7的TLR4刺激和P65和IRF1对促进剂的启动子，所有人都依赖于SARM（图5E-I）。 ISF3未对TLR7进行募集，因为IRF3通常不会被该途径激活（1）。与这种情况相比 CCL5. 启动子，P65招募到 TNF. LPS或Cl075刺激后的启动子在没有SARM的情况下正常（图5J., 5K）。总的来说，芯片数据显示了SARM管制 CCL5. 通过调解转录因子的适当组装来转录 CCL5. 启动子和随后招募Pol II，从而形成转录机制的形成 CCL5. promoter.
对于非TLR途径，也需要最佳CCL5诱导所需的SARM
鉴于SARM对CCL5诱导的启动子调节作用，我们想知道SARM在CCL5诱导中是否在CCL5诱导中具有内在的刺激作用，因此检查了非TLR细胞溶质PRR引发的CCL5表达。用于刺激合成的DSRNA Poly（I：C）刺激细胞溶质RNA传感器黑素瘤分化相关基因5（3），而VACV 70-BP DSDNA寡核苷酸（DSVACV 70mer）被转染到细胞中以刺激涉及IFN-诱导蛋白16同源物P204和环状GMP-AMP合酶等传感器（20, 36）。然后比较响应转染的核酸的CCL5和TNF诱导 SARM.. - / - 和wt bmdms。有趣的是，这揭示了在细胞溶质受体刺激下游最佳CCL5 mRNA和蛋白表达所需的SARM（ 图6A-D），而它可分配TNF诱导（图6E-H），与TLR诱导的CCL5和TNF获得的数据交配。
也需要SARM以获得非TLR途径的最佳CCL5表达。主要wt和 SARM.. - / - 用2转染BMDMSμg/ml poly(I:C) (A, C, E, G）或1μg/ ml dsvacv 70mer（B, D, F, H）对于指示的次数，或中等为控制。 CCL5. （a，b）和 TNF. （E，F）通过定量RT-PCR测定mRNA，标准化为内务机会 β-肌动蛋白，并且相对于未经处理的WT控制呈现。通过ELISA测定用于CCl5（C，D）或TNF（G，H）蛋白的上清液。数据是三重样本的±SD，并且代表至少三个独立实验。 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p <0.001与wt相比（学生 t test).
累积地，数据揭示了TLR和非TLR途径在巨噬细胞中诱导CCL5表达的诱导中的一种新作用，并且对于随后的RNA POL II招募，需要促进转录因子和随后的RNA POL II招募所需的SARM CCL5. promoter.
讨论
最近，与其他TIR适配器，MYD88，MAL，TRIF和电车相比，SARM可能会对角色进行相当不同的角色，它从TLR开始下游信令。几组已经证明，小鼠SARM主要在大脑的神经元中表达，并且它在调节神经元形态，应激诱发的神经细胞死亡和轴突变性方面具有作用8–12）。 SARM在神经系统中的作用与其进化的对手TIR-1相协调一致 C。 Elegans. (13, 14）。但是，外围中的SARM函数的数据较少。
在这项研究中，我们已经确定了PRRS调节CCL5表达中CCL5表达中的巨噬细胞的关键作用。发现SARM的调节功能对于CCL5来说是完全选择性的，因为所测试的其他细胞因子和趋化因子，即TNF，IL-1β，CCL2和CXCL10不受SARM消融的影响。 Kim等人的先前研究。 （8）显示TLR诱导的细胞因子反应是正常的 SARM.. - / - BMDMS;然而，该研究仅检查了TNF和CCL2而不是CCL5，因此与我们在本研究中的数据一致。由于其与其他组织和免疫细胞相比，由于其大脑中的丰富表达而言，已经提出了CNS-Importics的CNS函数。8）但除了目前的研究外，另一个纸张在外周细胞中表现出SARM的作用。该报告证明，在感染后，SARM介导的T细胞死于免疫活化和膨胀的T细胞以恢复宿舍（22）。
SARM.在CNS中细胞因子和趋化因子诱导调节中的角色也出现。因此，感染 SARM.. - / - 具有神经升性WNV的小鼠表明了脑干中病毒诱导的TNF生产的SARM（16）。此外，Hou等人。 （37）证明，缺陷小鼠响应于囊泡口炎病毒（VSV）感染，CNS中的上调细胞因子在上调细胞因子上显示出显着缺陷。然而，依赖于SARM的细胞因子似乎在CNS中与本研究中外周巨噬细胞的数据相比在CNS中有多更宽，并且包括IL-6，TNF，CCL2，CCL5和I型IFNS。 CNS中CNS中细胞因子基因诱导的细胞因子基因诱导的更广泛要求可能是CNS居民细胞中的较高的SARM表达。
因此，已发现SARM在CNS和外周巨噬细胞中调节CCL5，这可能对疾病发病机制特别影响。例如，CCL5及其受体CCR5对于对CNS的白细胞募集以及随后对小鼠的WNV感染进行了特别重要的（38, 39），而具有纯合CCR5突变的人（CCR5Δ32）对症状WNV感染的风险增加（40）。惊人， SARM.. - / - 显示小鼠更容易受到WNV（16）。显然SARM需要免疫细胞浸润到大脑中，因为在WNV之后（16）或VSV感染（37）与正常小鼠相比，缺乏SARM的小鼠脑中的巨噬细胞数量减少，而血栓验/单核细胞浸润的损伤神经被抑制 SARM.. - / - mice (10）。
需要详细研究依赖于SARM依赖的CCL5生产是否有助于病毒和抗抑郁的细胞浸润。
在这项研究中，我们专注于理解机械地在BMDMS中调节CCL5表达式的理解。关键观察是SARM功能不限于TLR途径，如含细胞溶质TIR结构域的蛋白质，并且赋予人类SARM在调节TRIF信号时的作用（7）。相反，SARM还调节CCL5在细胞溶质视黄酸诱导基因I形受体和DNA传感器下游的诱导，其通过分别通过非TIR结构域的适配器蛋白质线粒体抗病毒信号传导和刺痛（1）。然而，本研究中SARM的TLR独立功能实际上是与其正轨TIR-1中的事实一致 C。 Elegans. 触发独立于唯一的免疫应答 C。 Elegans. TLR Ortholog，Tol-1（15）。兴趣，最近出现了其他哺乳动物TIR适配器的TLR独立角色，因为MyD88和TRIF显然用作DEXD / H箱螺旋酶蛋白下游的信号调整器，其含有细胞溶解酶和DNA感测（ 41, 42）。
为了定义SARM如何调节CCL5诱导，首先证实了PRRS在BMDMS中诱导CCL5的机制。这表明PRR诱导的CCL5是PRG直接上调，响应于TLR刺激而独立于任何二次诱导的因子或I I型IFN信号传导。因此，预计SARM可以直接调节PRR途径，但是在没有SARM的不存在的情况下通常涉及CCL5诱导的主要转录因子通常在没有SARM，NF-κB，IRF3和IRF1的情况下激活。此外，Mapks，P38，JNK和ERK的激活是正常的 SARM.. - / - BMDMS。除了转录规范外， CCL5. 最近MRNA表达被证明是通过调节的RNA剪接来控制（33）。但是，我们可以清楚地排除在后签字事件中的SARM的作用 CCL5. RNA剪接，以及mRNA稳定性。相反，发现SARM增强 CCL5. 启动子活动，表明其在转录层面运行的监管功能。这是对内源启动子确认的，其中SARM是最佳的POL II招募 CCL5. 促进剂，但是Pol II可分配与 TNF. 启动子。值得注意的是，POL II的积累 CCL5. 推动者被视为速率限制步骤 CCL5. 转录并取决于先前的转录因子结合和染色质重塑以打开其他紧密闭合的启动子（17, 34, 35）。详细的芯片分析显示，NF-κBp65，IRF3和IRF1的招募 CCL5. 在没有SARM的情况下，启动子显着损害。减少转录因子招募对促进者可能会解释受损的POL II招募 CCL5. 在没有SARM的情况下，因为IRF3特别涉及刺激染色质的重塑 CCL5. promoter (35）。
因此，我们在巨噬细胞的研究提供了令人信服的证据，即SARM通过控制正确招募转录因子和随后POL II来促进CCL5表达。 CCL5. 启动子。未来的实验将寻求阐明SARM使用的确切机制来实现这一目标。鉴于这种SARM功能的TLR无关的性质，除了TIR结构域之外的SARM中的其他蛋白质基序可能会参与调解 CCL5. 启动子诱导。例如，无菌α基序结构域，其已知介导各种蛋白质 - 蛋白质相互作用（43），可以招募转录调节器 CCL5. 启动子。此外，SARM可以招募DEXD / H箱蛋白 CCL5. 启动子，因为这种螺旋酶可以与TIR适配器相互作用（41, 42）也知道调节基因启动子（44）。此外，定义SARM是否靠近近距离是有趣的 CCL5. 启动子，或者是否在更上游的角色中起作用。为了支持后一种模型是据报道，据报道SARM在细胞溶质中表达并大部分位于线粒体（8, 45）。但是，我们和他人（46）还在核中检测到SARM，尽管我们没有证据迄今为止刺激SARM的预算（数据未显示）。除了阐明确切的机制 CCL5. 通过SARM在巨噬细胞中的转录调节，它也有兴趣地确定CNS中是否依赖于SARM依赖性细胞因子诱导（37）也是由于调节转录因子和POL II的募集到选定的基因启动子。
总体而言，该研究鉴定了小鼠SARM在巨噬细胞中选择性地促进PRR诱导的CCL5表达的新功能。因此，数据有助于将SARM建立为细胞因子反应的阳性调节因子，与前一鼠在体内研究中。重要的是，本研究突出了另一种哺乳动物TIR适配器蛋白的TLR独立作用。
披露
作者没有财务利益冲突。
致谢
我们感谢Dmitry Kuprash的礼物 TNF. 启动子荧光素酶报告基因。
脚注
这项工作得到了科学基金会爱尔兰赠款11 / PI / 1056（至A.G.B.）和国家卫生研究院AI067497（至K.a.f.）和T32 AI095213。
本文的在线版包含 补充材料.
本文中使用的缩写：
- BMDM
- 骨髓衍生的巨噬细胞
- 芯片
- 染色质免疫沉淀
- CHX.
- 环己酰亚胺
- IRF.
- IFN监管因素
- ISG.
- IFN刺激的基因
- mal
- MyD88-as适得蛋白质
- Pol II.
- RNA聚合酶II
- poly（i：c）
- 聚苯吡啶甲酸
- 前mRNA
- 前体mRNA
- PRG.
- 主要响应基因
- PRR.
- 模式识别受体
- SARM.
- 无菌α和热/犰狳含芳族蛋白质
- SRG.
- 次要响应基因
- 刺
- IFN基因的刺激器
- 蒂尔
- Toll / IL-1R
- 电车
- 含TIR结构域的适配器诱导IFN-β相关的衔接子分子
- trif
- 含有TIR域的适配器诱导IFN-β
- vac
- 痘苗病毒
- Wnv.
- 西尼罗河病毒
- WT.
- 野生型。
- 已收到 2013年11月6日。
- 公认 2014年3月12日。
- 版权所有©2014由美国免疫学家，Inc。
