抽象的
贩运恶性淋巴细胞是慢性淋巴细胞白血病（CLL）生物学的基础。正常淋巴细胞进入淋巴结的末骨迁移（TEM）需要趋化因子诱导的RAP1和α的激活Lβ2整合素。然而，在大多数CLL的情况下，RAP1是趋化因子刺激的难治度，导致α失败Lβ2除非α，否则激活和TEM4β1是共同制定的。在这项研究中，我们表明CXCL12不能在CLL细胞中诱导RAP1 GTP加载导致含RAP1的胚胎的破坏导致到血浆膜。此外，趋化因子诱导的RAP1易位/ GTP载荷的失败与类似于在基于DNA的AGS的正常B细胞中观察到的细胞IGD分布的特定模式相关。通过培养CLL细胞离体，可以同时反应逆应性，表明这两个特征通过体内微环境中存在的刺激而偶联并驱动。最后，我们表明RAP1易位/ GTP载荷的失败与磷脂酶D1的缺陷活化与其上游活化剂ARF1相关联。我们的研究结果表明，CLL淋巴细胞中的趋化因子没有反应，导致ARF1 /磷脂酶D1介导的RAP1的翻译成用于GTP负载的血浆膜，并且可以是DNA AG诱导的盲肠的特征。
介绍
慢性淋巴细胞白血病（CLL）对于其临床变异性表示值得注意。在各个患者之间差异很大的一个临床特征是恶性细胞浸润淋巴结组织的程度。组织侵袭程度在CLL中是重要的，因为它形成了Binet和RAI分期系统的基础，这是患者存活率的强大决定因素（1, 2）。较短的组织受累的患者的存活率可能反映恶性细胞暴露于组织微环境中的存活/增殖信号（3, 4）。理解调节CLL细胞进入组织中的机制是一个相当大的潜力作为发展新疗法的基础。
CLL.细胞的组织浸润需要细胞挥发性，跨性迁移（TEM）和随后在淋巴组织内的运动，所有这些都依赖于趋化因子的活化素（5–7）。以前据报道，由于整合蛋白α的缺陷激活，CXCl12（SDF-1） - 和CCL21（SLC）诱导的CLL细胞诱导的TEM减少Lβ2 (LFA-1) (8, 9）; CCL21和CXCL12分别迁移正常淋巴细胞进入淋巴结和骨髓（10–12）。在大多数CLL样本上发现整联素激活的这种缺陷。 αLβ2 CLL细胞中的活化与趋化因子CCL21和CXCL12的失效相关，以增加RAP1的激活，已知有多个整年蛋白的激活所需的小G蛋白，包括αLβ2 (13），并且在贩运正常B细胞中发挥着至关重要的作用（14）出（15）淋巴结和骨髓。此外，没有增加的RAP1激活占趋化因子的失败，诱导α的构象激活 Lβ2 required for TEM (9）。总之，趋化因子诱导的RAP1激活的失败似乎是CLL的独特特征，并且一种在疾病发病机制中可能重要的特征。因此，阐明了这种现象的基础可以为发展新的治疗干预措施提供依据。
RAP1的激活状态由鸟嘌呤核苷酸交换因子（GEF）控制，通过用GTP加载RAP1和GTP酶活化蛋白（间隙）来激活RAP1，其通过提高RAP1结合的GTP水解速率来反转RAP1活化（16）。我们之前已经表明CLL细胞表达了GTP加载的RAP1，其响应于AG刺激而没有进一步加载（9）。这种情况类似于在干燥器中观察到的情况（17）。我们还表明，趋化因子，BCR交联和激活三种不同RAP-GEF（Caldag-Gefi，C3G和EPAC）的EPAC激动剂，无论是刺激的RAP1 GTP加载还是完全未能刺激RAP1 GTP加载（9）。这表明CXCL12在CL1细胞中增加RAP1激活的失败反映了GEF的无法活化RAP1而不是CXCL12激活其全球环境基金的无法永久性。 RAP1对GEF激活的RAP1耐火性的可能解释是CLL细胞表现出极高的间隙活性，其独立于GEF活化程度独立于其GDP负载形式保持RAP1。或者，也可以想到，RAP1可能已经最大地GTP作为减少或不存在的间隙表达/活性而加载。沿着这些线，注意到由于不存在Rap-Gap Spa-1而导致具有构成RAP1激活的小鼠的比例的感兴趣的感兴趣的是，产生CLL样病症（18）。作为第三种解释，RAP1对全球环境基金激活的耐火性可能通过缺陷的内体再循环来产生。因此，已显示趋化因子诱导的RAP1在T细胞中的激活，要求磷脂酶D（PLD）1依赖性再循环含有RAP1至RAP1 GEF所在的血浆膜（19, 20）。根据该模型，RAP1基本上将从其活化剂全球环境基础上构成思考。在保持这种思想中，在正常的白癜全B细胞中改变了内体回收（21），其在许多方面类似于CLL细胞（22–24）。
从这些考虑开始，我们开始检查CLL细胞中趋化因子诱导的RAP1活化的失败是否与缺陷的间隙功能或含有RAP1至血浆膜的内体的再循环损伤是有缺陷的间隙功能或损伤作为血浆膜的缺点。我们的研究结果表明，RAP1激活的失败确实与内体再循环受损相关，这与一种与慢性暴露于基于DNA的AGS相关的毒性形式。
材料和方法
患者和捐助者
该研究涉及基于形态学和表面标记表达的43例典型CLL（CD5+ 和 CD23+ 暗淡链条限制Ig）。所有患者都有全球疾病衰退数量>50 × 109因此，单核细胞制剂总是含有≥90％的CLL细胞。进一步的患者细节在补充表I中给出。
正常的B细胞从健康的志愿者或从国家血液服务中获得的奶粉涂层纯化。
所有样品都获得了知情同意，并批准了利物浦研究和道德委员会，皇家利物浦和广阔的大学医院信托。
细胞制备和培养
在所述的所有实验中使用初级淋巴细胞（正常和CLL）。通过在淋巴高淋巴普（轴屏蔽，挪威）上的密度梯度离心，从外周血和脂肪涂层中分离细胞。通过使用B细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotech，Bisley，U.K），通过阴性选择纯化正常的B细胞（>98% CD19+）。培养淋巴细胞（5％CO2 在空气中，在含有1％BSA（Sigma，Poole，U.K）的RPMI 1640中的37℃下，2毫米 l-Glutamine，100u / ml青霉素和100μg/ ml链霉素（Invitrogen，Paisley，U.K.）。
Western Blotting.
如前所述制备的细胞裂解物（9）通过SDS-PAGE分离并使用ABS与SPA-1，RAP1，RAP2（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA），ARF1和ARF6（ABCAM，Cambridge，U.K.）进行免疫印迹。通过将CLL细胞裂解物中的相关条纹中的相关条纹的化学发光与用用作标准标准的重组蛋白产生并在相同的印迹上运行来测量RAP1和RAP2蛋白的水平。
下拉测定。
如前所述测量ARF6-GTP加载（25）。简而言之，使用GST-Counded MT-2从裂解物中拉下ARF6（由尼古拉斯Vitale，Strasburg大学捐赠）与琼脂糖珠缀合。使用GGA3蛋白结合域涂层琼脂糖珠（Pierce Biotechnology，Rockford，IL）拉下ARF1-GTP。测量ARF1和ARF6的水平为RAP1。
苏bcellullar分级
根据Bivona等人的方法进行分馏。 （19）。收集级分（150μl），浓缩，浓缩，然后在Western印迹上运行;对等离子体膜的标记探测相同的膜（Na / K ATP酶;细胞信号传导技术，Danvers，MA）， trans-GOLGI网络（58-KDA GOLGI; ABCAM）和内体（EEA-1; ABCAM）和RAP1。
定量GTP和GDP-LEAD RAP1
根据BOSS和同事的方法计算RAP1-GDP和RAP1-GTP的水平（26）（美国专利号5,741,635）。简而言之，RAP1从CLL细胞裂解物免疫沉淀。然后通过偶联的酶反应在这些免疫沉淀物中测量GTP和GDP的绝对量。通过使用提交给上述反应的每个核苷酸（Sigma-Aldrich）的每个核苷酸的标准曲线来定量GTP和GDP的水平。
免疫荧光染色
Rap1.
内体分层化。
简而言之，将ClL细胞与抗IgM（Sigma-Aldrich）一起温育30分钟，用于IGD加灯-1;对于Rap1 Plus Lamp-1或EEA-1，通过如上用趋化因子处理细胞。然后固定细胞，用0.2％Triton X-100（Sigma-Aldrich）透露内部染色细胞。封闭后，用IGD（4μg/ ml; Santa Cruz生物技术）/ Rap1（如上）染色细胞，或没有灯-1 / EEA-1（1μg/ ml; Abcam），然后是山羊抗小鼠Alexa Fluor 488加山羊抗兔Alexa Fluor 633.细胞转移到聚 - l涂覆的 - 覆盖（Sigma-Aldrich）通过共聚焦显微镜检查并如上所述检查。使用制造商的软件，在通过细胞中心的单个z截面中测定分层化染色的量。
克隆RAP-GTP记者质粒
RAS / RAP-GTP结合域的RAS / RAP效应器RALGDS（RGR）用作活细胞中的图像RAP-GTP的亲和探针。三种RGR模块串联串联和融合，以增强的GFP（EGFP），以产生EGFP-RGRX3荧光报告构建体。通过PCR扩增RGR序列（人RALGDS的氨基酸1-97），并克隆到PRESET B（Invitrogen）中，使用编码XhoI和KPNI位点的正向和反向引物，得到PRSET B / RGR-1。 RGRX2和RGRX3构建涉及分别使用编码KPNI / ECORI位点和EcoRI / HindiII限制性位点的引物对进行两轮PCR扩增RGR。在PRSET B / RGR中依次克隆到RGR的3'末端PCR产物以产生PRSET B / RGRX2和PRESET B / RGRX3。设计用于RGRX2和RGRX3的引物，使得通过5-AA接头分离级联RGR结构域。以相同的方式产生K48D和其他单点突变RGRX1，X2和X3构建体，从相应的单个突变RGR开始。 RGR序列通过XHOI / HindIII限制克隆从PEGSER B转移到PEGFP-C2（CLONTECH），以产生RGRX1，X2，X3熔融羧基末端至EGFP。通过测序验证所有构建体的完整性。
转染
使用Amaxa电孔器和细胞系转染试剂盒（LONZA，Slough，U.K）转染CLL克隆。简而言之，1×107 将CLL细胞与RAP1-GTP报告探针EGFP-RGR（K48D）X3的质粒重新悬浮在核代特征溶液中（参见补充图1的补充剂制备和表征）。使用U13程序转染细胞并在使用前培养24小时。
为了分析活性RAP1的定位，将转染的CLL细胞用CXCL12处理1,5和10分钟（如上）处理。将细胞固定以停止进一步刺激，并在将细胞转移到载玻片上之前用TO-PRO-3染色核。通过共聚焦显微镜检查RAP1-GTP探针的分布。
内部CA的测量2+
通过用荧光染料氟-4 / am染色细胞测量细胞内钙动员，并通过流式细胞术实时分析依赖钙依赖性荧光信号（23）。
普的测量
使用商业AMPLEX红色PLD套件（Invitrogen）根据制造商的说明测量PLD。通过参考使用纯化的PLD（Sigma-Aldrich）产生的标准曲线来确定蛋白质水平。在暴露于CXCl12后，在初步实验中，在10和60s下测定酶活性。
抑制PLD1。
用CXCL12处理之前，将CLL克隆与PLD1（200nm; Vu0155069; Tocris Bioscience，Bristol，U.K.）孵育2小时，并根据上述测定PLD活性。
结果
Rap2在低水平表达，并不在CLL细胞中加载GTP
在我们以前的研究中，我们报告说，响应于一系列刺激（），大多数CLL样本都无法增加RAP1的GTP加载（9）。我们还表明，在没有RAP1的情况下，激活CLL样品无法激活αLβ2，TEM的先决条件，除非α4β1 也表达了。但是，我们没有调查Rap2 GTP酶作为α的潜在介体的作用Lβ2 RAP1-无响应α中的激活和TEM4β1+ CLL细胞。为此，似乎很重要，因为RAP2参与了正常淋巴细胞的迁移（27）通过趋化因子刺激激活，并且具有与RAP1的功能重叠（28, 29）。检查16个CLL样品显示RAP2水平远低于RAP1的水平（4.5±0.7对172±17 ng / 5×106 细胞）（补充图2. 2A）。此外，与正常的B细胞相比，RAP2主要处于其无活性的GDP结合形式，并且响应于趋化因子刺激而没有成为GTP加载的（补充图2B）。这些调查结果强烈反对RAP2作为α的调解员的作用Lβ2 RAP1-无响应α中的激活和TEM4β1+ CLL. cells.
CXCL12的失败增加RAP1 GTP加载不能通过改变的间隙表达或活性来解释
我们接下来解决了为什么趋化因素刺激在大多数CLL样本中增加RAP1-GTP加载（以下称为趋化因子）。在我们之前的报告中，我们表明CXCL12的无法激活RAP1反映了RAP1的耐火性通过GEF激活（9）。我们首先探讨了这种耐火性可能因RAP1而导致的可能性导致的可能导致GTP由于减少或增加的差距活动。为了解决这个问题，在趋化因子响应和 - 不响应CLL样品中研究了RAP1间隙的表达。我们专注于Rap1-Gap和Spa-1，因为它们在造血细胞中的Rap1-差距是Rap1-raps（30）。然而，趋化因子诱导的RAP1 GTP加载和水疗中心或RAP1-GAP的水平之间没有观察到相关性（补充图2C，补充表I）
为了进一步研究趋化因子与功能间隙缺陷相关的可能性，RAP1-GTP和RAP1-GDP的水平在趋化因子响应和 - 不响应CLL样品中测量（补充图2D）。与之前的观察结果保持（9），在所有未刺激的CLL样品中检测到RAP1-GTP。在所有未刺激的CLL样品中也容易检测到RAP1-GDP。在单个情况下，RAP1-GTP / RAP1-GDP在未刺激的CLL样品中的比例在趋化因子响应性和非响应基团中相似（补充图2E）。在一起，这些观察结果表明趋化因子诱导的RAP1-GTP载荷的失败不会因间隙的改变或功能性异常而导致。
CXCL12在趋化因子响应中诱导RAP1易位，但不趋化因子 - 不响应CLL样品
我们接下来让我们注意的是，趋化因子没有反应可能是由内体回收的缺陷引起的，从而拒绝进入位于质膜中的GEFS的RAP1。在其他细胞类型中，已显示RAP1-GDP在内体隔室中存在，GTP负载依赖于具有质膜的内体相关RAP1的易位和融合（19, 31）。因此，我们推测CLL细胞对GTP载荷的响应于CXCL12的RAP1的故障可能反映出现这种易位的失败。
为了研究这种可能性，使用共聚焦显微镜检查RAP1的亚细胞定位的变化响应趋化因子刺激。在没有刺激的情况下，Rap1位于趋化因子响应和 - 不响应CLL样品中的细胞内隔室中（图1A-C）。在能够GTP加载RAP1的CLL样品中，CXCL12迅速（在1分钟内，5分钟内最大效果）诱导RAP1的易位到血浆膜（86.4±3.4％的细胞; p = 0.003）。然而，在趋化因子 - 无反应细胞中，CXCL12刺激对RAP1的位置没有影响，该位置留在细胞内隔室中（图1A-C）。这些结果表明，趋化因子对趋化因子没有反应，与RAP1易位与血浆膜的失败相关。
图1。
RAP1的亚细胞定位。 （A）表示通过免疫荧光染色确定的RAP1（绿色）定位的代表性图像。核是蓝色染色的。在未处理的细胞中，在整个细胞质中清楚地看到Rap1。在趋化因子刺激之后，大多数RAP1在响应性案例中从细胞质移动到质膜，而在非响应情况下，RAP1的分布在CXCL12刺激之前和之后相似。 （ B）从（a）显示RAP1分布的代表细胞的线谱。可以清楚地看出，CXCL12使RAP1在趋化因子响应（R）中的细胞周边的窄峰值中被重新分布到，但不在非响应（NR）细胞中。 （C) Quantification of chemokine-induced Rap1 redistribution to the plasma membrane. For each treatment ≥通过两个调查人员独立计算50个细胞，他们被蒙蔽了有关案件的其他信息。平均值± SEM are shown. Note that no ringed cells were seen in patient 4. Significantly more ringed cells were seen following chemokine treatment in the responsive CLL samples (p = 0.003). (D）用与活化的RAP1结合的EGFP标记（绿色）报告探针转染CLL细胞。核染成红色。在未处理的细胞中，在整个细胞质中看到探针。在趋化因子刺激之后，探针在响应性案例中重新分配到血浆膜。相比之下，Rap1仍然存在于非反应病例中的细胞质中。 （E）来自（D）的细胞的线谱。 （F) Quantification of redistribution of Rap1-EGPF reporter probe to the plasma membrane. Note that the probe was redistributed to the plasma membrane of cells in only the responsive cases. Scale bars in (A) and (D), 10 μm（原始放大倍数×40).
通过CXCL12易转移到血浆膜的RAP1是加载的GTP
接下来我们试图确认血浆膜处的RAP1处于活性，GTP加载的形式。为此，我们使用基于RAS / RAP效应RGR的RAS关联领域的RAP1-GTP的三价荧光报道探针（32, 33）。探针的表征在补充图1中描述。重要的是，在所有实验中使用的三价EGFP-RGR（K48D）X3探针在RAP-GTP和RAS-GTP之间判别，不包括在CLL细胞中检测活性RAS（参见补充信息）。将EGFP-RGR（K48D）X3转染到CLL细胞中，使用共聚焦显微镜检查其分布（图1D-F.）。在未刺激的CLL细胞中，转染探针在整个细胞内隔室中均匀分布。然而，当用CXCL12处理趋化因子响应性CLL细胞时，探针快速（在1分钟内，5分钟内的最大效果）重新分布到质膜（60±14％的细胞; p = 0.01097）。相反，在趋化因子 - 无反应CLL样品中没有看到EGFP-RGR（K48D）X3的再分布。这些结果证实，在趋化因子刺激之后，在响应性CLL细胞中转移到血浆膜的RAP1处于其活性形式，并支持RAP1转向趋化因子的概念，以便通过趋化因子激活。
CXCL12从趋化因子响应物中取出RAP1，而不是趋化因子 - 无响应的CLL样品
在T细胞中，RAP1的易位和激活涉及通过内体舱贩运（19）。为了测试CLL细胞中是否也是这种情况，我们首先使用细胞分级和蛋白质印迹来研究RAP1的亚细胞定位。这些实验表明，未刺激的CLL细胞的RAP1（n = 3）位于血浆膜，高尔基和内体组分中（图2A）。为了确认RAP1存在于外体中，进行共聚焦显微镜实验以检查RAP1的分解化和早期（EEA-1）和晚期（灯-1）内体的标记。结果显示在 图。2B 和 2C。在未刺激的CLL细胞中，RAP1用灯-1和EEA-1（未示出）分致大致。在用CXCL12处理后，RAP1不再与趋化因子响应CLL细胞中的内体标志物一起分开。然而，在趋化因子 - 无响应CLL细胞中，RAP1仍然在灯-1 / EEA-1隔室中。将这些实验应用于正常的B细胞产生的结果与趋化因子响应性CLL细胞中获得的结果非常相似（在未处理的细胞中，在未处理的细胞中的平均Rap1 /灯-1分层化为28±4％，并在用CxCl12处理后12.0±2％; P = 0.028）。与所提供的数据一起使用 Fig. 1，这些结果强烈表明CXCL12刺激在趋化因子 - 无响应CLL细胞中诱导RAP1激活的灭亡导致RAP1易位的破坏导致趋化因子诱导的趋化因子诱导的GTP载荷发生的血浆膜。
图2。
趋化因子刺激对RAP1与内体的分解化的影响。 （A）Western印迹显示RAP1在不同CLL细胞级分中的分布。探测RAP1的单个尼龙膜，血浆膜标记物（Na / K ATP酶; 6-8）， 一种 trans-GOLGI网络标记（58-KDA GOLGI; 车道5-8）和内体的标记物（EEA-1; 车道7-9）。虽然RAP1乐队最突出 lane 7 （Golgi和血浆膜），它也清晰可见 lane 9 （仅限Edosomes）。结果代表了八个单独的实验。 （B）具有用CXCl12处理或未处理或未用CXCL12处理或未处理的非反应性和响应CLL样品的双染色的代表性的分层分子图。 RAP1被弄脏了红色（x-axis）和灯泡 - 1绿色（y-轴）。趋化因子刺激对RAP1水平没有影响，但导致大多数RAP1从灯泡移出-1+ 反应性但不响应CLL细胞的内体盒。这 插入 图像显示一个代表性的单元，其中双染色像素显示为蓝色;这些数字代表RAP1与LAMP-1（原始放大倍率×40）分开的RAP1的百分比。 （C) Quantification of Rap1 colocalization with LAMP-1 by confocal microscopy from colocalization dot plots as in (B). The graph shows the average amount of Rap1 (±SEM通过灯泡 - 1横跨五个不同的领域。
趋化因子 - 无响应的CLL细胞显示出与DNA AGS诱导的毒性相关的IGD分布的明显模式
我们下次试图调查RAP1在趋化因子 - 无响应CLL细胞中的内吞再循环失败的机制。许多考虑因素导致我们假设它可能与蜂窝数据有关。首先，抗原性T细胞的抗原刺激未能增加RAP1 GTP载荷（17, 34）。其次，Aergy已与终核核区中回收内吞囊泡的封存有关（35）和抑制磷脂活化（36）。第三，在小鼠B细胞中，Aerergy已与CXCl12的细胞响应的减少相关联（37）。第四，据报道，CLL淋巴细胞分享B Cell Anergy的小鼠模型中描述的一些特征（22, 38）。因此，我们推测，负责Rap1-GTP负载失败的改变的内吞再循环可能与CLL细胞的干燥状态有关。为了研究该假设，使用正常（非CONERIC）B细胞进行嗜析因素响应性和 - 不响应CLL细胞进行嗜毒菌的特征以进行比较。
Aergy是一种复杂的过程，不完全理解。在慢性抗原刺激后的小鼠中描述了两种替代类型的毒性。小鼠B细胞针刺到蛋白质Ag母蛋白蛋白蛋白显示增强的Ag诱导的BCR内吞作用。 BCR积累在大的细胞内池中，从中迅速回收到质膜（ 39）。相反，通过DNA的AGS为小鼠B细胞的特征在于BCR失败进入灯-1+ AG参与后的晚期内体（35）。这两种型号的无论是在细胞内IGD的情况下表征。
因此，我们通过检查CLL细胞进行IGD的CLL细胞与灯泡-1的分致化进行研究+ endosomes (图3A-C）。如预期的，在正常的B细胞中，大多数IGD位于细胞表面上，与灯泡1有很少有关+ 内体舱。但是，在IgM交联时，IGD内化到灯泡-1中+ 隔间。相反，在趋化因子响应和趋化因子 - 无反应CLL细胞中，IgD主要位于内部而不是细胞表面，并且不受表面IgM的交联的影响。因此，趋化因子响应和 - 不响应CLL细胞均显示出指示Anergy的IGD分布的模式。有趣的是，在趋化因子响应性CLL细胞中含有灯-1的内部IGD，但不在趋化因子 - 不响应CLL细胞中。因此，可以推导出趋化因子 - 无响应的CLL细胞显示类似于通过DNA的AGS与慢性刺激相关的IGD分布的模式，而趋化因子响应性CLL细胞显示与基于DNA的AGS无关的IGD分布模式。
图3。
抗IgM对CLL细胞的影响;非响应细胞显示有声波的特征。 （A) Representative confocal microscopy images of normal B cells and CLL cells showing surface IgD in nonpermeabilized cells (green) and total IgD (green) and LAMP-1 (red) in permeabilized cells. In the case of normal B cells, IgD was present on the cell surface and internally; the internal IgD was not associated with LAMP-1 in the absence of stimulation but colocalized with LAMP-1 following BCR cross-linking. In the CLL cells, most of the IgD appeared to be internal irrespective of chemokine responsiveness or BCR cross-linking. In chemokine-responsive CLL cells the IgD was colocalized with LAMP-1 whereas in chemokine-unresponsive CLL cells no such colocalization was observed. Scale bar, 5 μm（原始放大倍数×40). (B）表示IGD的含有IGD的分层，在未处理的CLL细胞中具有灯-1 图。2B。 （C使用共聚焦显微镜软件（如（b）中，在未处理的CLL细胞中用灯-1进行IGD分层化的量化。该图显示了六个趋化因子响应情况下用五种不同领域的灯泡-1在六个不同领域中分开的IGD（±SEM）的平均量。 （D）条图显示了细胞内Ca的增加2+ IgM交联诱导。与正常的B细胞相比，所有12个CLL样本都显着降低了CA2+ 动员指示无论。
确认用于这些实验的CLL样品是明星的，分析了所有12例的动员细胞内Ca的能力2+ 在表面IgM交联之后（图。3D）。细胞内Ca没有增加2+ 在12个样品中观察到（2个趋化因子响应和3个趋化因子 - 无响应案件）中观察到。此外，除了在正常B细胞中，水平仅增加3-20％，而两组的常规B细胞中的47％。这种缺失或显着的细胞内Ca衰减2+ BCR交联诱导的动员支持的想法，即CLL的所有12例都是阴体（40）。
Exvivo培养型趋化因子无响应CLL细胞恢复趋化因子响应性和逆转Anergy
接下来我们试图确定与DNA AGS相关的类型的趋化因子无响应和毒物在一起的功能联系在一起。我们之前已经表明，通过将离体培养48小时，可以将趋化因子反应性恢复到趋化因子 - 无响应的CLL细胞。特别地，虽然趋化因子受体表达未改变，但CLL细胞响应趋化因子刺激而恢复其进行TEM的能力（9）。因此，我们试图建立趋化因子恢复性是否伴随着逆转的阴茎功能。正如预期的那样，趋化因子无响应的CLL样品孵育（n = 3）48 H恢复CXCL12诱导的RAP1 GTP加载（图4A），从细胞内隔室易位Rap1到细胞膜（图4B.）和αl - 依赖TEM（图4C.）。接下来，通过染色表面和总IGD检查相同的CLL样品，用于通过染色和总IgD染色的接触性特征。在48小时内培养后，CLL细胞类似于正常的B细胞，因为大多数IGD位于细胞表面上。此外，与抗IgM的BCR交联导致大部分IGD内化到灯泡-1中+ 内吞室（图4D），表明逆转过敏表型。此外，exvivo孵育CLL细胞48小时恢复了他们动员细胞内Ca的能力2+ 以下BCR交联（图4E. ）。在一起，这些发现表明，与DNA AGS相关的趋化因子无响应和无论是相关的，并依赖于体内刺激。
图4。
exvivo孵化对RAP1，TEM和Anergy的影响。 （A）将趋化因子 - 无响应的CLL细胞孵育48小时并分析CXCL12诱导RAP1-GTP载荷的能力。从同一情况获得的相应值 t = 0显示为比较。 （B）将趋化因子 - 无响应的CLL细胞孵育48小时，渗透化并检查RAP1的细胞分布，使用共聚焦显微镜检查。图表显示了具有染色图案的细胞百分比，该染色图案表达的染色图案。 （C）将趋化因子 - 不响应的CLL细胞孵育48小时，并分析它们在存在或不存在封闭AB的情况下进行TEM的能力L。显示的数据表格的一部分（ 9）。 （D) Chemokine-unresponsive CLL cells were incubated ex vivo for 48 h and analyzed by confocal microscopy for the cellular distribution and colocalization of IgD (green) and LAMP-1 (red). Scale bar, 10 μm（原始放大倍数×40). (E）将CLL细胞孵育48小时，并通过用于细胞内Ca的流式细胞术分析2+ BCR交联后的水平。
普和ARF1的激活在趋化因子 - 无响应CLL样品中有缺陷
我们下次试图建立趋化因子无响应CLL样品中RAP1有缺陷的腐败易位的机制。我们最初专注于我们的注意力。有两种PLD（1和2）的同种型;两者都被发现在血浆膜和内体（41, 42）。因为内吞囊泡的易位到等离子体膜层取决于PLD1（20, 43），并且由于失败激活PLD1是Anergy的一个特征（36），我们将CXCL12诱导的PLD活化与趋化因子响应和趋化因子 - 无响应CLL样品进行比较（图5A）。与正常淋巴细胞（CLL细胞，80±34 u / ml;正常淋巴细胞，44±14 U / mL）相比，在大多数CLL样品中升高了活性PLD水平。在趋化因子响应性CLL样品中，PLD活性可变，但始终如一地，在接触CXCL12后增加。相反，在趋化因子 - 无响应的CLL样品中，在暴露于CXCL12之后没有观察到PLD活性的增加;实际上，在大多数这些样品中趋化因子刺激后，活性脂肪酶的水平降低。
图5。
CXCL12对PLD，ARF6和ARF1激活的影响。 （A）CXCL12在趋化因子响应（R）和 - 不响应（NR）样品中诱导的PLD活性的百分比变化（n = 10 of each). (B特定PLD1抑制剂在响应例中对总PLD活性的影响。 PLD1抑制导致组成型PLD活性降低，并阻断CXCL12在测试中的三种情况下CXCL12诱导的PLD活性的增加。 （ CCXCL12对ARF6活性的影响。将CLL细胞在CXCL12的存在或不存在下培养，并使用下拉测定测定ARF6 GTP负载。 CXCL12引起的ARF6 GTP加载的变化不一致，与趋化因子响应性不相关。 （DCXCL12对ARF1活性的影响。将CLL细胞在CXCL12的存在或不存在下培养并测定用于ARF1 GTP负载。 CXCL12治疗增加了趋化因子响应CLL样品中的ARF1-GTP加载（n = 6）但不是在非偏移样本中。显示相同克隆中的RAP1-GTP加载以进行比较;这些数字是指PLD活性增加的百分比增加。 （E）培养趋化因子非响应细胞48小时，并分析CXCL12对ARF1-GTP加载和PLD活化的影响，如（D）中那样。培养后，趋化因子激活ARF-1和PLD的能力。
确定涉及的PLD的同种型我们使用PLD1的特定抑制剂。在与PLD1抑制剂温育后，未处理的CLL细胞中PLD在未处理的CLL细胞中的活性降低了〜50％，表明组成型PLD1活性;在PLD1抑制剂存在下的残留PLD活性可以合理地归因于PLD2。 PLD1抑制剂防止了在测试的四个趋化因子响应CLL样品中三种中看到的CXCL12诱导的PLD活性增加（图5B.）。这些发现表明，趋化因子诱导的RAP1的转位为CLL细胞的质膜是至少在大多数情况下，由PLD1介导并且因此趋化因子无反应能力归因于PLD1激活的故障。
普可以通过许多刺激物激活，包括ARF和RHO家族GTP酶，蛋白激酶C或磷脂酰肌醇4,5-双磷酸酯（43–46因此，这些信号传导途径中的任何一个中的任何故障可能负责CLL中的缺陷PLD1激活。我们专注于ARF1和ARF6 GTP酶，因为他们被称为膜贩运的关键监管机构（43, 44），曾经涉及Anergy（47），并且都涉及PLD的激活（43, 44）。 CLL样本在它们响应于CXCL12刺激的GTP负载ARF6的能力不同。但是，这与趋化因子响应性没有相关联（图5C.）。相比之下，CXCL12诱导的ARF1的GTP加载局限于趋化因子响应性CLL细胞（图5D）。这些发现表明ARF1在CLL细胞中趋化因子诱导的PLD1活化中起枢转作用，并且PLD1和RAP1易位在趋化因子 - 不响应CLL样品中的血浆膜的失效可归因于缺陷ARF1活化。
因为趋化因子刺激以激活RAP1的不可能通过前体内孵育反转（图4A, 4B），我们试图建立趋化因素诱导的ARF1 / PLD活化是真的。为了解决这个问题，将Cl1细胞培养48小时，并检查用CxCl12处理后ARF1和PLD的活化。 ARF1和PLD对趋化因子刺激的响应性确实是通过48小时的前体内孵育（图5E.）。这些观察结果支持了趋化因子 - 无响应CLL细胞中的ARF1 / PLD1 / RAP1途径被体内微环境中的因素抑制，这与链接到基于DNA的AGS的盲肠的形式相关。
讨论
本研究的目的是探讨CLL细胞中有缺陷RAP1 GTP加载的机制，期望这可能会揭示对疾病发病机制的新见解，并阐明用于药物治疗的新分子靶标。然而，我们首先试图澄清RAP2在CLL细胞运动中的作用，因为它与RAP1共享许多功能。无论RAP1-GTP加载如何，RAP2在CLL细胞的低水平时表达，并没有加载GTP。这一发现需要与正常淋巴细胞的动力进行调整，使RAP1或RAP2的GTP加载能够激活αL integrin (29, 48）。显然，RAP1 / RAP2依赖性运动不能在无法GTP的CLL细胞中进行RAP1或RAP2，因此这种细胞的动力必须涉及RAP1 / RAP2独立机制。我们以前的演示CLL细胞可以激活αL 直接通过α订婚4 整联素为这种RAP1RAP / 2独立运动提供了合理的解释（9）。
关于RAP1，我们表明CXCL12增加RAP1-GTP载荷的衰竭与异常间隙表达或功能无关，而是RAP1从内体转移到血浆膜的失败，其中为GTP加载的质膜。进一步表明，趋化因子诱导的RAP1易位/ GTP负载的失败与类似于在小鼠B细胞中观察到的小鼠基于DNA的AGS（IGD主要内部，未被表面IgM交联而改变的细胞IGD分布的不同模式连接到类似的细胞IGD分布的不同模式。而不是用灯泡结合 + 内体）。相比之下，趋化因子响应性CLL细胞（39）显示了不同形式的aergy（内部IGD与Lamp-1分开+ 内体）。通过我们的示范提供了与趋化因子无响应和无论进行趋化因子无响应的证据，以至于趋化因子 - 无响应CLL细胞48小时的孵育48小时，不仅恢复了CXCL12诱导的RAP1-GTP加载和功能，而且还将IGD重新分布到细胞表面并恢复了其能力内化IgM交联后。最后，我们通过表明它与PLD1及其上游活化剂ARF1有缺陷活化有关的趋化因子诱导的RAP1易位/ GTP载荷的失败的机制阐明了所阐明的机制。
我们的研究在CLL中对无论进行了三项重要观察。首先，它证实了先前研究的结果表明，Anergy是CLL淋巴细胞的经常观察到的特征（22–24, 38, 49）。其次，它提供了证据表明CLL的个体病例显示与特异性抗原刺激相关的盲肠的不同模式。第三，它将这些陷阱（以及暗示，不同类型的抗原刺激类型）联系起来，CLL细胞对趋化因子刺激的能力相连。这些观察结果与我们对CLL生物学的理解显着增添了显着的增加，并为治理白血管的机制提供了新的洞察力，该机制是如何在不同的身体隔间之间分配的，为什么患者之间变化。
我们观察到不同类型的CLL展示不同类型的Anergy是在CLL中与已知的BCR多样性保持并与不同的CLL克隆对不同AG的作用相比（49, 50）。关于CLL和IGHV突变的无论之间关系的文献是矛盾的;有些建议有一个链接（23），而其他人则表明没有（22, 24）。我们的研究未能识别趋化因子响应性和IGHV基因使用，IGHV突变状态或H链同种型之间的任何关联。
CDR3刻板印象提供了一种更复杂的方法来了解与刺激AG的关系中的BCR结构。因此，与最近公开的CDR3刻板印象数据集相比，我们的队列中的CDR3序列涉及1967 Ighv序列和110个鉴定的CDR3刻板印象（51）。事实上，我们没有找到趋化因子响应性和CDR3长度或CDR3刻板印象之间的任何关联（数据未显示）。然而，重要的是，请注意，我们对CDR3刻板印象的了解非常不完整。例如，最近的研究涉及7596％的Ighv序列已经确定了952个CDR3刻板印象（52）。对应于这些新的CDR刻板印象的序列尚未公布，因此我们无法将它们与群组中的人联系起来。因此，我们无法检测到本研究中趋化因子反应性和CDR3刻板印象之间的关联并不一定意味着这种关联不存在。
也许我们研究中最有趣的观察是检测到个体CLL病例的毒性类型与其趋化因子响应性的关联。我们的数据表明，具有不同于小鼠B细胞中DNA AGS诱导的特征的CLL样本能够激活αLβ2 整合素并接受TEM以响应CXCL12的刺激。相比之下，具有类似于DNA的AGS诱导的CLL的CLL的病例无法响应趋化因子刺激，除非它们共存α4β1 整合素，可以激活αLβ2 整合素和诱导TEM独立于RAP1（9）。因此，引导CLL细胞激活α的能力是有趣的Lβ2 整合素并经过TEM进入淋巴结部分由α组成4β1 表达，部分是恶性克隆反应的AG的性质。具体而言，如果对非DNA AGS反应，或者如果它们对DNA的AGS反应但表达α反应，则CLL克隆应该能够充分配备进入淋巴结。4β1。相比之下，对DNA的AGS反应的CLL克隆并不表达α4β1 进入淋巴结应该难以进入淋巴结。
将类似的原理应用于来自淋巴结的恶性淋巴细胞的出口也是有趣的。普遍认为，出口取决于RAP1激活但不整合表达（15, 53）。因此，对非DNA AGS作出反应的那些CLL克隆应该能够自由地从淋巴结出来，而那些对DNA的AGS反应的CLL克隆应该被困在淋巴结中，而不管α4β1 表达由于它们无法激活RAP1。
组合这些假设给出以下预测：1）由非DNA AGS的CLL克隆应该能够自由进入和出口淋巴结，导致血液和淋巴结之间以平衡方式分布的白血病负担; 2）CLL克隆对DNA的AGS有敏化，缺乏α4β1 表达难以进入和退出淋巴结，再次导致疾病的平衡解剖分布; 3）CLL克隆对DNA的AGS具有明确的，并且表达α4β1 应该能够进入但未出现淋巴结，导致淋巴结病相对于血液受累的水平导致不成比例的淋巴结病。这些考虑因素虽然投机性，提供了合理的假设，以解释CLL中观察到的淋巴结病的显着变化。
总之，我们的研究阐明了CLL中趋化因素的趋化因子的机制，并且在此过程中揭示了趋化因子响应性与截然不同的免疫毒理学之间的关联，这表明CLL细胞的贩运性能可能受到本质的影响AG负责克隆选择。由于CLL细胞的贩运是白血病负担的解剖分布，因为后者影响治疗反应和生存，我们的研究结果具有不可避免的临床意义，并且可以为预防CLL细胞进入的新治疗干预措施提供基础，或者刺激其出口来自，保护性淋巴结微环境。
披露
作者没有财务利益冲突。
致谢
我们感谢John Cawley和Joseph Slupsky为科学指导和Keuran Pounder，Laura Fullford，以及Mark Wilk的技术援助。
脚注
D.S.P.进行了研究，分析数据，并设置了所示实验的许多技术 图。 2A, 4A， 和 5; r.p.贡献了重要的研究资料，在I.R.的监督下制定并表现出RAP1-GTP记者探针，谁也写了 材料和方法 和 结果 关于这些探针的部分，谁向剩余的稿件提供了建议; K.L.进行BCR表征并与发表的CDR刻板印象的序列进行比较; A.R.P.提供了科学投入和监督准备的稿件; K.J.T.在本文中设计了研究，写了本文的大部分，并进行了并分析了上面未详述的数据。
来自白血病和淋巴瘤研究的补助金（U.K.）（k.j.t.和d.s.p.）和诺华斯蒂旺普·福尔·普罗斯（I.）的授予这项工作得到支持。
本文的在线版本中包含补充材料。
本文中使用的缩写：
- CLL.
- 慢性淋巴细胞白血病
- egfp.
- 增强GFP.
- 差距
- GTPase-活化蛋白
- g
- 鸟嘌呤核苷酸交换因子
- 普
- 磷脂酶D.
- RGR.
- ralgds相关
- TEM
- Transendothelial迁移。
- 已收到 2012年12月27日。
- 公认 2013年5月24日。
- 版权© 2013 by The 美国免疫学家协会, Inc.
