抽象的
结核分枝杆菌负责每年近200万人死亡。分枝杆菌BOVIS.Bacillus Calmette-Guérin，唯一用于结核病（TB）的疫苗（TB），诱导对TB的高度可变的保护，迫切需要更好的TB疫苗。候选疫苗AGS的先决条件是它们是免疫原性和表达的玉米菌菌在感染初级靶器官期间，即易感个体的肺部。寻找新的TB疫苗候选AGS，我们使用了基因组，无偏的AG发现方法来调查2170的体内表达玉米菌菌基因期间玉米菌菌在小鼠的肺部感染。研究了四种遗传相关但不同的小鼠菌株，代表了通过对Tb 1基因座的超出性Ispectibity控制的TB易感性的光谱。我们使用严格的选择方法来选择体内表达的玉米菌菌（IVE-TB）基因并分析了不同疾病表型的表达模式，如坏死和肉芽肿形成。为了研究这些蛋白质的疫苗潜力，我们分析了它们的免疫原性。一些玉米菌菌通过来自结核蛋白皮肤的免疫细胞识别蛋白质，从结核蛋白皮肤试验阳性，ESAT6 / CFP10反应性的个体识别，表明这些AGS在自然时呈现玉米菌菌感染。此外，结核病患者还表现出对IVE-TB AGS的反应，尽管低于结核菌素皮肤测试阳性，ESAT6 / CFP10反应性的个体。最后，IVE-TB AGS诱导强IFN-γ+/ tnf-α+CD8.+和tnf-α+/ IL-2+CD154.+/ CD4.+在长期潜伏期间的PBMC中的T细胞应答玉米菌菌 - 摄取的个体。总之，这些IVE-TB AGS在体内肺部感染期间表达，是免疫原性的，在长期潜伏期间诱导强T细胞应答玉米菌菌 - 育存的个体，因此可以代表新的TB疫苗的吸引力。
介绍
结核病（TB）仍然是死亡的主要原因，特别是在低收入和中等收入国家（1）。估计世界三分之一的人口估计是潜伏的 结核分枝杆菌，3-10％的其中3-10％将在寿命期间开发活跃的结核病。在艾滋病毒感染的个体中，这种比例每年增加到7-10％。多药抗性，广泛的耐药性的出现，最近也完全耐药 玉米菌菌 菌株进一步加剧Tb流行病。目前， 分枝杆菌BOVIS. Bacillus Calmette-guérin（BCG）是唯一针对TB的可用疫苗。虽然BCG疫苗接种可以防止严重的儿童TB（2），它诱导对肺结核病的高度可变和不一致的保护，成人中TB的传染性形式（3）。最近确定的活性BCG疫苗接种是在感染艾滋病毒感染儿童中播种BCG感染的发生（4），类似于IL-12 / IL-23 / IFN-γ轴中具有遗传缺陷的个体严重BCG感染（5, 6）。因此，需要新的TB疫苗，其比BCG更有效和更安全。
了解细胞内行为 玉米菌菌 在体内感染期间不仅是为了理解其感染生物学，而且对于鉴定可能的新型TB疫苗候选AG也是至关重要的。在体内感染阶段和与网站相关的差异 玉米菌菌 基因表达模式可以清楚地影响潜力的曲目 玉米菌菌 可用于在初级感染器官中免疫识别的AGS，肺部。 AGS在肺部表达 玉米菌菌 - 感染的敏感个人可以代表TB疫苗接种的有趣新候选者，因为他们会诱导能够识别出原地的反应 玉米菌菌 - 活化的细胞。
玉米菌菌 通过改变其代谢状态，具有显着的能力适应环境变化。一个主要的环境压力因素 玉米菌菌 被认为在宿主感染期间遇到缺乏氧气和营养素。体外缺氧诱导表达 玉米菌菌 dormancy regulon (7），由主稳压器DOSR控制（RV3133C.）。表达 玉米菌菌 DOSR调节件也由低剂量否，一氧化碳暴露和IFN-γ-活化巨噬细胞感染诱导（7, 8）。以前，我们报告了广泛的人类T细胞反应 玉米菌菌 DOSR调节件编码的AGS并显示对这些AGS的反应突出，在种族和地理上不同的人群中与潜伏的TB感染（LTBI）相关联（9–13）。其他工作表明，营养素限制可以诱导特定的表达 玉米菌菌 基因如 RV2660C. (14）。发现该基因编码“饥饿”Ag，在小鼠中临床前TB感染模型中具有有前途的长期疫苗效果（15）和非人的灵长类动物（16）。最近描述的持久的缺氧响应（EHR）基因代表替代的缺氧诱导的响应模型，其包括额外数量补充的大多数DOSR调节子编码基因（>200) of 玉米菌菌 应激反应基因（17）。该模型也有助于识别新的 玉米菌菌 Ags (18）。
上面讨论的模型的限制是识别差分调节的 玉米菌菌 基因依赖于体外模型，该模型应该重新承载相关的环境压力条件 玉米菌菌 遇到宿主感染。然而，首先，许多这些环境应力因子可能不知道，限制了这种假设驱动研究的价值。其次，在体外研究时，体内可能很容易错过的多种应力因子之间可能存在添加剂或协同效应。第三，也许更重要的是，宿主响应诱导的应力的某些关键特征不能容易地重新携带，包括肉芽肿形成和Tb坏死，两者都是Tb的基本特征。为了克服这些限制，若干实验室已经开始分析细胞内的基因表达谱 玉米菌菌，无论是在受感染的人或鼠巨噬细胞（8, 19），在不同小鼠菌株的受感染组织（BALB / C，SCID）（20）或人工肉芽肿小鼠模型（21）。但是，这些小鼠模型都没有开发出粒状坏死的Tb病变（22）。因此，我们已经研究过 玉米菌菌 小鼠基因组基因表达模式，携带不同基因型对Tb 1的不同基因型（sst1）基因座。这种遗传基因座位于染色体1上并控制进展 玉米菌菌 以肺特异性方式感染严重和坏死病变：C3Heb / Fej（C3h）小鼠携带易感 sst1 等位基因在整个肺部渗出和大规模坏死的早期发芽的强烈炎症反应，依赖于Tb肺炎，而C57BL / 6J（B6）小鼠携带抗性 sst1 等位基因在没有坏死的病变的情况下发展较小的间质肉芽肿，其控制细菌倍增。 c3h.b6-sst1 携带（B6衍生）抗性的Congenic小鼠 sst1 C3H背景上的轨迹显示出现增加的生存后 玉米菌菌 与易感C3H小鼠相比，感染，但不太突出，而不是抗性B6小鼠。最后， 玉米菌菌 - 摄禁B6.C3H-sst1 小鼠，携带易感c3h-sst1 B6背景上的基因座，开发鲁棒肉芽肿，这些肉芽肿从健康组织围绕，其中病变含有泡沫巨噬细胞并发展后期坏死，类似于人类成人的肺结核。相比之下，B6菌株不显示这种表型，确认了特定的作用 sst1 在控制细胞死亡（23）。
这 sst1 基因座携带22个基因，其中1个高度表达 玉米菌菌 - C3H.B6的肺部 - sst1 但不是过度感知的C3h老鼠。有趣的是，该基因的表达，称为细胞内病原体抗性1（Ipr1），减少 玉米菌菌 在易感巨噬细胞中的倍增，并诱导从坏死到凋亡细胞死亡的切换（ 24）。缺乏 Ipr1 在C3h易感中的表达 sst1 因此，基因座负责肺部特异性坏死的发展 玉米菌菌 infection (25）。最接近的人类同源物 Ipr1 是 SP110b。两者的表达 Ipr1 和 SP110b 由ifns调节，表明免疫中的作用（26–28）。在西非进行的遗传关联研究确定了三种多态性 SP110b 与TB遗传易感性相关的基因（29）。然而，在加纳，俄罗斯，南非和印度尼西亚进行了许多其他研究没有复制这一发现（30–33）。一种 SP110b 在牛中也鉴定了同源物，与易感性相关 分枝杆菌 SSP。 paratuberculosis. (34）。
我们在本研究中使用的这四种（Congenic）小鼠模型显示了一种TB易感性，其范围从高度易感（C3h）到抗性（B6）小鼠，并根据上的坏死病变的发育 sst1 轨迹和修饰遗迹背景，其中表示基因座。此鼠标模型复制了人类的关键特征 玉米菌菌 感染。在这项研究中，我们利用这种疾病谱和1）分析了所有的定量实时表达模式 玉米菌菌 预计基因预测是每个操纵子中的第一个基因，在肺部 玉米菌菌 - 诱导的小鼠，旨在识别 玉米菌菌 在体内感染期间在肺期间高度或差异地表达的基因（体内表达 结核分枝杆菌 [IVE-TB]基因）; 2）比较这些 玉米菌菌 易感之间的基因表达模式（b6.c3h-sst1 和c3h）和抗性（c3h.b6-sst1 和B6）小鼠菌株试图将表达模式与感染表型相关联; 3）选择了一系列最持续的表达 玉米菌菌 基因，作为重组蛋白产生这些，并分析其在结核菌蛋白皮肤测试中的免疫原性（TST）+ 健康的TB受影响的个体以及长期LTBI（LTLTBI）作为朝着新的TB疫苗候选AGS验证的第一步。
材料和方法
鼠标菌株
C3H和B6小鼠购自杰克逊实验室（Bar Harbour，Me）。 Congenic C3H.B6-sst1 和 B6.C3H-sst1 鼠标菌株承载抗性和易感等位基因 sst1 轨迹分别如前所述生成（24, 35）。简而言之，染色体1〜20cm段，包含 sst1 基因座，通过≥10个回复，在相反的背景应变中血气渗入。在哈佛大学医学院的公共卫生学院的特定病原体条件下培育并饲养了小鼠。
细菌菌株
玉米菌菌 如前所述使用悬浮液（36）。简而言之， 玉米菌菌 （埃尔德曼菌株; Trudeau Institute，Saranac Lake，NY）培养物生长为中间体阶段7H9媒体（BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ）（10％油酸/白蛋白/右旋糖/过滤酶[OADC; DIFCO]，0.05％吐温80 [Sigma-Aldrich]，和0.5％甘油[Sigma-Aldrich]）。洗涤细菌并储存在-80℃。在感染之前，细菌被解冻，超声处理，并在PBS中稀释至106 CFU/ml.
小鼠感染
用25-50 cfu的气溶胶感染小鼠 玉米菌菌 使用麦迪逊分类（威斯康星大学工程店，麦迪逊，Wi） n = 2 per time point (24）。牺牲了B6和C3H小鼠，既是6和9周的染色，而B6.C3H-sst1 和 C3H.B6-sst1 分别被处死9和6周期的小鼠。对于重新激活模型，B6和B6.C3H-sst1 小鼠感染I.v.通过5×10的尾静脉4 CFU. 玉米菌菌 每只鼠标如前所述（23）。挑战后十二周，通过饮用水（10mg / 100ml）给予小鼠的小鼠（10mg / 100ml）90 d。在INH处理戒断后处死8周的小鼠。
基因组 - 玉米菌菌 通过两步多重实时RT-PCR转录分析
量化 玉米菌菌 如前所述进行mRNA基因表达（15, 37, 38）。该方案基于第一链cDNA合成和CDNA的多重扩增，其次是使用光环480以384孔格式以384孔格式进行扩增CDNA的单独实时PCR（Taqman）定量。
全部的 玉米菌菌 通过珠子跳动中的丁醇和甲苯甲虫破坏（MP生物医学，SOLON，OH），通过均匀化从感染的小鼠肺组织中分离来自感染的小鼠肺组织的RNA。使用rneasy柱（qiagen，valencia，ca）分离出总RNA。沉淀RNA，用两个连续的脱柱RQ1 DNA酶消化（Promega，Madison，Wi）进行清洗，并重新悬浮在50μL无RNA酶水中（Applied Biosystems / Ambion，Austin，Tx）。
使用50ng总RNA进行cDNA合成，其在逆转录酶（RT）中分离+ 和 RT− 对DNA污染的控制反应。加入外壳随机底漆（0.5μL），1μL10mMDNTPS和不含核酸酶水，并在70℃下在热循环仪中温育3分钟。随后，4μL5×Maxima RT缓冲液，0.5μL核酸rNase抑制剂，0.5μLMaximaRT酶（用水替换为Rt） − 加入对照样品）（所有发酵酵母，Glen Burnie，MD）和不含核酸酶的水，并在50℃下孵育1小时，将95℃孵育2分钟以灭活，然后保持在4℃。
通过混合2179的混合物进一步扩增产生的CDNA。 玉米菌菌 基因特异性引物（23.8μL引物混合物：〜50nm，每个扩增反应），2μlcDNA，3μl10×优点2缓冲液（Clontech，山景，Ca），0.6μl1×优势2聚合酶混合物（Clontech，CA ）和0.6μl10mmdntps（Fermentas）至30μl的体积（ftp://smd-ftp.stanford.edu/tbdb/rtpcr/taqman_oligos.fa）（15）。 PCR引物/探针组的序列和设计可用于： http://genes.stanford.edu/technology.php 和 http://www.tbdb.org/rtpcrData.shtml。比较控制100pg（2×104 还包括基因拷贝数）基因组H37RV DNA。作为额外的控制，25 玉米菌菌 参考基因用于控制扩增混合物的变异。基因引物组使用底漆快递软件（PerkinElmer，Foster City，CA）设计，以涵盖每个预测的至少一个基因 玉米菌菌 操纵子。将每次反应在95℃下加热5分钟，然后在95℃下在95℃下循环30 s，60℃，60℃，68℃，1分钟。以前我们使用测定中使用的所有基因通过扩增测定的线性度具有验证的多重PCR前置放大的条件。在我们开始在本研究中的基因表达分析中开始使用它们之前，我们还从我们的收集中验证了来自我们的收集的所有Taqman测定。
使用Taqman引物/探针组（Biosearch Technologies）进行单个基因转录量化。定量实时PCR混合物含有0.07μL前置放大的cDNA，2μlAkmman底漆/探针混合物，5μl2×Lighcycler 480探针主混合物，2.93μl探针校长Mast PCR级水（Roche）至10μl的最终体积。将反应在95℃下加热5分钟，然后在95℃下进行40次循环30 s和60℃。为30秒的冷却步长为一个循环运行。基于从校准曲线设计的对数转换/线性回归方程，将循环阈值转换为相对基因拷贝数（RGCN）。数据集可用： http://www.tbdb.org/pubdata/tbdb/publications/Raw-Data-Harvard-Mice.xls.
不同小鼠和小鼠菌株之间的一些生物异质性校正，例如细菌载荷的差异是不可能的，因为这些是遗传结核病易感性的广泛差异所固有的。
IVE-TB.基因选择程序
首先，选择在一个数据集中表示的基因（>1000 rgcn）但不是在其他数据集（+/-）中，从而选择 玉米菌菌 由于遗传宿主敏感性和/或感染表型变异而差异表达的基因。
第二种方法是选择在所选择的比较（+ / +）中的两种不同鼠标菌株中在两种数据组中高度表达的基因，选择 玉米菌菌 表达与宿主的遗传构成无关的基因。对于该选择，RGCN数据从最高值排序，并从两个数据集的前100个最高表达基因中选择重叠基因。任意选择该数量的100个基因以限制进一步分析的候选者的数量。
第三种和最后一种方法包括在数据集2中表达的基因（>1000 rgcn）但不在数据集1（ - / +）中，如相同的基本原理作为方法1.因此，接近1和3包括差异表达的基因。没有数字限制限制（因为与第二种方法相比，鉴定了较少的基因[+ / +]）（图。 1, 2）。
IVE-TB.基因选择程序概述。 （A） 这 玉米菌菌 每个小鼠模型的RGCN配置文件彼此独立地进行比较。 （B）三种基因选择程序用于选择每个比较的基因：在数据集1中表达的基因（>1000 rgcn）但没有数据集2（+ /−）;在两种数据集中高度表达的基因（两种模型中的最高型表达基因并选择重叠基因）（+ / +）;并且在数据集1中表达的基因，但在数据集2中表示（>1000 RGCN）（ - / +）（另见 材料和方法）。
选择IVE-TB基因。数量 玉米菌菌 在每种方法中对两种不同的小鼠菌株进行两种不同的小鼠菌株获得的基因 Fig. 1 are shown in (A） - （G）。
重组蛋白
重组蛋白由选定的制备 玉米菌菌 如前所述的基因（39）。简要地， 玉米菌菌 通过PCR从基因组H37RV DNA扩增基因，并通过网关技术（Invitrogen，Carlsbad，Ca）克隆在N末端的组细菌表达载体中含有组氨酸标签。载体过表达 大肠杆菌 BL21（DE3）并纯化。通过凝胶电泳和蛋白质印迹分析重组蛋白的大小和纯度，用抗HIS AB（Invitrogen）和抗 - 大肠杆菌 Polyclonal AB（陈列血清研究所的礼物，哥本哈根，丹麦）。由于其大尺寸（C，中间[M]和N Termini）制备RV2380C，RV2435C和RV2737C蛋白作为两种或三个重组蛋白片段。内毒素含量为<50 iu / mg使用a测试 雷米 Amebocyte裂解物测定（Cambrex，East Rutherford，NJ）。在淋巴细胞刺激测定中测试所有重组蛋白，以使用PBMC的体外纯化的蛋白质衍生物排除Ag非特异性T细胞刺激和细胞毒性 玉米菌菌 - 健康健康的荷兰捐赠者（Sanquin Blood Bank，Leiden，荷兰）（12, 40–42）。纯化的蛋白质衍生物 玉米菌菌 从血清学院购买。
玉米菌菌 lysate
玉米菌菌 H37RV生物在37℃下在培养烧瓶中生长到晚期日志相，并收集在V底管中。用PBS洗涤沉淀并用PBS洗涤两次，在80℃下热量造成30分钟。随后将细胞悬浮液收集在含有0.1mm玻璃珠的生物管中。使用迷你型工厂（BioPec产品）破坏细菌。使用BCA测定（Thermo Scientific Pierce）测量裂解物的浓度。
研究科目
选择了一百三十三个捐助者，答复了 玉米菌菌 - 通过TST的纯化蛋白质衍生物（弱阳性，5-11mm [n = 26];阳性，≥12mm [n = 90];还没决定 [n = 17]，范围为6至32mm [平均，16mm]，并记录到TB指数案例（n = 63）和/或已经前往高流行国家（n = 76). TST+ 个人进入后续研究，在招聘中，进行了Quantiferon-TB金管测试（QFT-git）（Cellestis，Carnegie，Vic，澳大利亚）。当有≥0.3IU/ mL时，测试被认为是阳性的。通过静脉穿刺收集血样。 玉米菌菌 - 作为健康对照（HC）供体（n = 11). PBMC from TST+ 供体和治疗的TB患者（n = 7）用于淋巴细胞刺激测定。 PBMC来自LTLTBI（41, 42）（n = 6）用于多色流式细胞术测定。在静脉穿刺之前获得了知情同意。研究议定书（P07.048和P027/99）由林根大学医疗中心的机构审查委员会和挪威医疗和健康研究道德区域委员会批准。
全血清
血液在AIM-V中（Invitrogen，Breda，Netherlands）中稀释1:10，在48孔板（Nunc，Roskilde，Denmark）中孵育，并用或不具有重组蛋白（10μg/ ml），PHA（ 2μg/ ml），或 玉米菌菌 裂解物（5μg/ ml），在37°C，5％CO2。收获6d上清液并在-20℃下储存以便在后期使用。
淋巴细胞刺激测试
PBMC（1.5×105/孔）在96孔圆底板（Nunc）中培养三份，并在37°在37°孵育10％合并的人血清（Invitrogen）的IMDM（Life Technologies / Invitrogen）中孵育或没有蛋白质（10μg/ ml） c在5％co2。在6天之后，收获上清液，合并，并在-20°C中储存，以便在IFN-γELISA中使用。
IFN-γelisas
用标准的ELISA技术（U-Cytech，Utrecht，荷兰）测量上清液中的IFN-γ浓度。 ELISA样品重复测试，并根据制造商的指导进行试验。测定的检测极限以20 pg / ml为全血症（WBA）和100pg / ml的淋巴细胞刺激试验设定为任意。
流动细胞术分析
PBMC（1-2×106/管）被解冻并休息过夜，随后在共拖性ABS抗CD28和抗CD49D（Sanquin和BD Biosciences）存在下，在蛋白质（10μg/ ml）中刺激16小时。在前4-6小时后加入Brefeldin A（3μg/ ml; sigma-Aldrich）。用活/死固定紫色死细胞染色（生动; Invitrogen）染色细胞以根据制造商的指示区分现场和死单。通过以下表面标记物在4℃下染色1小时：抗CD3 PE-CY5（BD生物学），抗CD4德克萨斯红（CALTAG）和抗CD8 V500（BD BIOSCIENCE）。此外，包括抗CD14太平洋蓝和抗CD19太平洋（两种Invitrogen）以选择CD14− 和 CD19− 活细胞。用抗IFN-γAlexa700（BD Pharmingen），抗TNF-αPE-CY7（BD Biosciences），抗IL-2 PE（BD Pharmingen）和CD154嗜活蛋白-Alexa 780（eBioscience）进行细胞内染色。使用ADG修复 &烫发套件（An Der Grub Bio Research，维也纳，奥地利）。在BD LSRFortessa（BD Biosciences）上获得数据，并使用Flowjo 7.6.5版（树星，ashland或）分析。单CD14.−/CD19−/CD3+ 门控细胞分析CD4+ 和 CD8+ 细胞因子反应。最终的AG特定CD4+ 和 CD8+ T细胞子集群体所有包含至少200个事件。出于比较目的，对每个供体中的每个响应减去中等背景值。
统计分析
使用GraphPad Prism进行统计分析（5.1版）。曼恩惠特尼 U 测试用于分析1）ESAT6 / CFP10混合（E / C）的累积IFN-γ响应之间的差异+，E / c−和HC个体和2）在E / C中测量的PHA诱导的IFN-γ反应之间的差异+ 和 E/C− 捐助者。一种 p 值≤0.05被认为是显着的。
结果
耐腐蚀和/或易受敏感小鼠肺部IVE-TB基因的鉴定
开始识别新颖的候选人 玉米菌菌 AGS在一个无偏见和 玉米菌菌 基因组时尚，我们分析了2170的基因表达模式 玉米菌菌 基因，其中大部分代表每个预测的第一基因 玉米菌菌 操纵子，四种不同的肺部 玉米菌菌 - 感染的小鼠菌株（B6，C3H，C3H.B6-sst1，b6.c3h-sst1）显示一系列TB易感性（表I.）。使用定量PCR测定RGCN（15）。这允许对每个样本的转录物水平绝对量化，因为数据针对标准参考基因数拷贝标准化（如 材料和方法）。
在该IVE-TB基因选择屏幕中，我们使用以下标准来选择候选基因以进行进一步分析。首先，我们使用最强烈的上调 玉米菌菌 所有四种分析的小鼠模型中的基因。该组基因包括独立于宿主敏感背景表达的基因。其次，我们使用过 玉米菌菌 在B6，C3H，B6.C3H中特别上调基因sst1，或c3h.b6-sst1。这些基因的表达受宿主遗传背景的影响，因此包括其表达与特定TB疾病特性相关的基因，例如肉芽肿形成和坏死。所有四种小鼠模型的获得的RGCN彼此独立地与可视化相比 如图。 1A。所有四种小鼠模型都用低剂量气溶胶感染 玉米菌菌 接种物。另外，B6.C3h的子集 - sst1 使用先前描述的TB复发模型感染，以研究基因表达的特征 玉米菌菌 reactivation (23）。
每个人 玉米菌菌 基因的表达数据（例如，B6与C3H，B6与B6.C3H-sst1）如图所示，经过三种不同的选择方法 如图。 1B. 并详细描述 材料和方法。每个比较的基因选择结果都是可视化的 Fig. 2 和补充表I.结果所示 Fig. 2 然后用于选择其表达与特定疾病特征相关的IVE-TB基因如图所示 Fig. 3。其中包括1） 玉米菌菌 基因高度表达，独立于宿主遗传背景（在所有四种小鼠模型中表达;这些 玉米菌菌 基因包括在内 ESXA. 编码ESAT6和其他ESX基因）; 2） 玉米菌菌 基因与坏死结合（C3H和B6.C3H-表达）表达sst1，但不在b6或c3h.b6-sst1); 3) 玉米菌菌 与严重的坏死感染或易感性相关的基因（以C3h表达，但不是B6，C3H.B6 - sst1，或b6.c3h-sst1); 4) 玉米菌菌 与致密的肉芽肿发育结合的基因（仅在B6.C3H中表达sst1 但不在c3h，b6或c3h.b6中sst1); 5) 玉米菌菌 与弥漫性肉芽肿发育结合的基因（以C3h表达但不在B6.C3-sst1，b6或c3h.b6-sst1); 6) 玉米菌菌 与抗性结合的基因（在每比较每种耐药小鼠菌株中表达）; 7） 玉米菌菌 与低炎症结合的基因（在B6中表达，但不在C3H.B6中sst1）; 8）炎症（在C3H.B6中表达 - sst1，但不是在B6）; 9）复发（在I.v中表达。 玉米菌菌 - 感染，INH处理的B6.C3H-sst1，但不是低剂量气溶胶感染的b6.c3h-sst1）。得到的IVE-TB基因的概述在补充表II中呈现。
选择与特定TB疾病特征相关的IVE-TB基因。显示分析的流程图，以识别与TB疾病表型相关的IVE-TB基因。图中的字母是指指示的特定选择 Fig. 2. 玉米菌菌 介绍了宿主遗传背景上高度表达的基因 图2A （b）， 2B （e）， 2C （H）， 2D （k）， 2E （n），和 2F （q）。 玉米菌菌 介绍了与坏死相关的基因 图2A （C）， 2B （F）， 2D （j）和/或 2F （p）。 玉米菌菌 介绍了与严重坏死感染或易感性相关的基因 图2A （C）， 2D （j）和/或 2C （一世）。 玉米菌菌 介绍了与致密肉芽肿相关的基因 图2C. （G）， 2B （f）和/或 2F （p）。 玉米菌菌 介绍了与弥漫性肉芽肿相关的基因 图2C. （i），还有 图2A （c）和 2D （j）。 玉米菌菌 与抗性相关的高度表达的基因在以下一个或多个选择中呈现： 图2A （一种）， 2B （d）， 2D （l）， 2E （m）（虽然与易感敏感无关 sst1 轨迹）， 2F （r）和/或 2G （s）。 玉米菌菌 介绍了与低炎症相关的基因表达 图2E. （m）。 玉米菌菌 介绍了与炎症相关的高度表达的基因 图2E. （o）。 玉米菌菌 与所提供的复发相关基因相关联的基因高度表达 如图。 2G (u).
新鉴定的IVE-TB AGS的免疫原性
进一步选择IVE-TB基因。
上述IVE-TB基因选择的目的是识别潜在有趣的新疫苗候选AG。因此，我们接下来决定了它们的免疫原性。为此，一些 玉米菌菌 进一步选择的基因，其存在于多个组中，或者在IVE-TB选择中的基因的顶部数量中（表二）。一些 玉米菌菌 在以前的研究中也鉴定了使用我们无偏见的基因组的方法鉴定的基因作为环境应激诱导的蛋白质（7, 14, 17）。
随后的文献搜索显示，已经先前识别出几乎所有进一步选择的IVE-TB蛋白（16个中的14个） 玉米菌菌 蛋白质组学研究，证实了蛋白质的表达 玉米菌菌 我们研究中发现的基因（44–57）（表III）。实际上，我们观察到这一点 玉米菌菌 - 培养的C3H小鼠认识到大部分所选择的IVE-TB AGS，通过脾细胞通过Ag特异性IFN-γ产生（补充图1）测量。此外，我们通过不同的蛋白质爆炸搜查分析了这些IVE-TB蛋白的保护 玉米菌菌 菌株以及其他分枝杆菌物种。这表明IVE-TB蛋白序列在所有测试中都受到强烈保守的 玉米菌菌, M. bovis， 和 分枝杆菌非洲分枝杆菌 菌株。其他分枝杆菌菌株也观察到强烈的保护（表IV.）。
通过TST识别IVE-TB蛋白+ donors.
为了评估16个选定的IVE-TB蛋白的免疫原性，产生并分析IVE-TB基因的重组蛋白，在133 TST中诱导IFN-γ反应+ 个人。大约三分之一的TST+ 个人回应 玉米菌菌 - 特异性E / C蛋白（32％，61-9980 pg / ml）。 ESAT6和CFP10 玉米菌菌特异性蛋白质经常用作免疫诊断年度以识别 玉米菌菌 exposure (12）。我们的三分之一的人口也应对这些诊断AGS（ESAT6，CFP10与TB7.7 [P4]肽补充）使用商业QFT-Git。 QFT-Git中的反应非常好，对WBA中测量的E / C蛋白的反应非常好（84％）。本集团划分为WBA E / C.+ 和 WBA E/C− 捐助者表明，74％的E / C+ 捐助者回应了 玉米菌菌 裂解物（87-3112pg / ml）和40％至Ag85b Ag（97-735pg / ml）（图4A）。重要的是，高度识别新发现的 玉米菌菌 在该群体中观察到蛋白质，反应范围为10-60％的供体。要识别认可的AGS，我们首先检查了哪些被认可的E / C的≥25％+ 捐助者。从所有20个蛋白质和蛋白质片段（衍生自16选定的AGS），13次均可达到≥25％（n 捐赠者≥3的10和≥11）。在刺激后仅诱导13吨IFN-γ（60-600pg / ml）的中间水平，而用RV1363C（102-1053pg / ml），RV1956（100-1861）刺激后产生高水平的IFN-γ。（100-1861 Pg / ml），RV2034（77-1256pg / ml），RV2324（63-2130pg / ml），RV2380C-C（80-1159pg / ml），RV3353C（70-899pg / ml）和RV3420C（ 88-660 pg / ml），代表七个最佳识别的蛋白质。
IFN-γ对E / C中的IVE-TB AGS响应+ (A），E / c− (B）和HC捐助者（C）。共43 e / c+ donors (A), 90 E/C−供体（b）和11 hc捐助者（c）分析其IFN-γ WBA responses to Ags and controls; the Ags were 玉米菌菌 RV1284，RV1956，RV2034，RV2324，RV3353C和RV3420C。十e / c+ donors (A), 36 E/C− 还分析了供体（B）和9个HC供体（C）的回应 玉米菌菌 AGS RV0079，RV1363C，RV2225，RV2380C，RV2435C，RV2465C，RV273C，RV2828C，RV2982C和RV3515C IFN-γ。每个AG的响应者的比例在 最佳 of the graph. For comparative purposes, medium background values were subtracted for each response in each donor. Horizontal bars represent the median IFN-γ回复。虚线表示正常性的截止值，任意计算为3× medium value.
TST.+ E/C− 捐助者还有47％的回应 玉米菌菌 裂解物和20％至AG85B（图4B.）。此外，分析了HC的IVE-TB响应（图4C.）。最重要的是，在TST中检测到没有针对IVE-TB蛋白的反应的有限反应+ E/C− 和HC组，展示明显的识别特异性，可能是与之相关的 玉米菌菌 exposure.
进一步验证IVE-TB AGS由E / C专门认可+ 供体，计算到每种单独测试的20个测试的AGS的累积IFN-γ响应（如前所述）（9）。 E / C之间的高度显着差异+ 和 E/C− 观察到人口（p <0.0001）。正如预期的那样，在E / C之间也观察到显着差异+ 和 HC donors (p = 0.049) (Fig. 5），确认AG识别与E / C测试积极性之间的关联。有趣的是，七个最佳识别的蛋白质，RV3420C是E / C之间最具歧视性的蛋白质+ (≥25%) and E/C− group (≤1%) (p <0.0001），HC捐助者无法识别（p = 0.016），表明可能的角色 玉米菌菌 - 特异性Biomarker Ag除了Esat6，CFP10和TB7.7之外。
累积IFN-γ responses induced by IVE-TB Ags, calculated per individual in the E/C+，E / c−和HC组。累积IFN-γ responses to all 20 IVE-TB protein and protein fragments in E/C+ (n = 43), E/C− (n = 90）和HC捐赠者（n = 11). Squares indicate cumulative IFN-γ所有20个IVE-TB AGS的响应和圆圈表示累积IFN-γRV1284，RV1956，RV2034，RV2324，RV3353C和RV3420C AGS的响应。水平杆代表中位数累积IFN-γ responses.
从TB患者中PBMC识别IVE-TB蛋白。
我们接下来调查了TB患者是否也可以承认这些AGS。来自WBA E / C的PBMC+ TST+ donors (图6A）和结核病患者（如图。 6B.因此，用20个蛋白质和蛋白质片段刺激，测量IFN-γ产生。从WBA E / C的PBMC培养物中观察到IVE-TB AGS的高IFN-γ响应（123-3391pg / ml）+ TST+ 人口，确认在上面的WBA测定中获得的结果。在捐助者≥50％的捐助者和八年级的38％的捐助者中，九名九份的九个人确认。在该测定中仅识别出一种蛋白质片段（RV2380C-M）。相比之下，来自TB患者的PBMC中，七种测试的IVE-TB AGS没有诱导可检测的IFN-γ产生，而大多数IVE-TB AGS与WBA E / C相比，大多数IVE-TB AGS仅诱导了IFN-γ的低水平+ TST+ 个体（107-1825 pg / ml）。只有两个AGS在TB患者中诱导高水平的IFN-γ。此外，只有一个AG被TB患者的50％识别出来，而AGS的其余部分被相对较少的TB患者（14-43％）认可。因此，IVE-TB AGS似乎在TB患者中的免疫原性比TST较少+ individuals.
PBMC IFN-γ对TB患者和WBA E / C中的IVE-TB AGS的反应+ TST+ 捐助者。 WBA E / C的PBMC+ TST+ donors (n = 8) (A）和结核病患者（n = 7) (B）用IVE-TB AGS刺激和治疗条件6天。测量IFN-γ的水平，对每个供体中的每个响应减去中等背景值以进行比较目的。每个AG的响应者的比例在 最佳 of the graph. Horizontal bars represent the median IFN-γ回复。虚线表示阳性的截止值，任意设定为100pg / ml。
T细胞对长期潜在的IVE-TB AGS的反应 玉米菌菌 - 摄取的个体。
因为IVE-TB AGS被TST强烈识别+ 我们随后使用PBMC从已接触到的捐赠者的捐助者更详细地分析了对七个最佳认可的AG的免疫反应。 玉米菌菌 几十年前，尽管缺乏任何预防性治疗，但指定了LTLTBI（41, 42）。额外重要性，几个小瓶的PBMC的可用性也允许更详细的细胞子集分析。
有趣的是，TNF-α-和IL-2产生的CD4的高频+ 用IVE-TB AGS刺激后观察到T细胞，而仅在IFN-γ的中间频率产生IFN-γ的CD4+ 检测到T细胞（图7A）。相比之下，IFN-γ的高频和TNF-α+CD8.+ T细胞存在于这些捐赠者中，而较少的IL-2+ 与CD4相比检测到T细胞+ T细胞。除IFN-γ，TNF-α和IL-2之外，还为AG诱导的CD4+ T细胞活化标记CD154（58）被表达出来。
IVE-TB.的多色流量细胞术分析–specific T cell responses in long-term latent 玉米菌菌 - 摄取的个体。来自长期LTLTBI的PBMC（n = 6）刺激16小时，七个最佳认可的年牌（如确定） Fig. 4。 IFN-γ-，TNF-α-，IL-2-和CD154的频率的频率+ 和 CD8+ 确定T细胞（A）。 Subsequently, “multifunctional”通过分析IFN的组合来确定反应γ, TNF-α, IL-2, and CD154 responses for CD4+ T细胞和IFN-γ，TNF-α和IL-2对CD8的反应+ T细胞。显示两个代表性IVE-TB AGS的结果（RV2034和RV3420C）（B）。出于比较目的，对每个供体中的每个响应减去中等背景值。水平杆代表细胞因子的CD4的中值频率+ or CD8+ T cells.
更详细地分析CD4之间的多功能TH1响应+ 和 CD8+ T细胞显示CD154+CD4+ T细胞大多是TNF-α+/ IL-2+和tnf-α+ (如图。 7B.）。此外，IFN-γ的中间频率+/ tnf-α+/ IL-2+CD154.+CD4+ 检测到T细胞。最后，CD154+ 检测群体，不会产生IFN-γ，TNF-α和IL-2细胞因子。有趣的是，对于每种IVE-TB AG或E / C对照AG，观察到相同的模式。此外，观察到AG识别的接口变化。值得注意的是，很少有TNF-α+/ IL-2+CD8.+ 与TNF-α相比检测到T细胞+/ IL-2+ CD4+ T细胞。 IFN-γ+/ tnf-α+CD8.+ T细胞是最突出的人口，其次是TNF-α+CD8.+ T细胞。此外，中间IFN-γ+/ tnf-α+/ IL-2+ 和 IFN-γ+CD8.+ 观察到T细胞。再次，如CD4所述+ T细胞，在CD8内的每个AG观察到相同的模式+ T细胞种群以及AG识别的联系变异。
计算综合中值荧光强度（IMFI），以确定不同多个细胞因子产生的CD154产生的细胞因子的定量贡献+/ CD4.+ 和 CD8+ T cells (Fig. 8）。 IFN-γ.+/ tnf-α+/ IL-2+CD154.+/ CD4.+ T细胞具有最高的IMFI，其逐渐下降，用于双重生产和单一IFN-γ+CD154.+/ CD4.+ T细胞。 IFN-γ+/ tnf-α+CD8.+ T细胞对IFN-γ产生的贡献最多，直接接着是IFN-γ+/ tnf-α+/ IL-2+CD8.+ T细胞。 IFN-γ+/ tnf-α+CD8.+ T细胞也是TNF-α的主要贡献者，而IFN-γ+/ tnf-α+/ IL-2+CD8.+ T细胞显示出更高的IL-2 IMFI。 TNF-α和IL-2 IMFI也是TNF-α最高的+/ IL-2+CD154.+/ CD4.+ T细胞，其次是IFN-γ+/ tnf-α+/ IL-2+CD154.+/ CD4.+ T细胞。因此tnf-α+/ IL-2+ CD4 and IFN-γ+/ tnf-α+CD8. T cells contribute strongly to the production of Th1 cytokines, followed by the triple-positive T cells. Single cytokine–producing cells only showed a relatively minor contribution.
IVE-TB.的IMFI–specific CD154+CD4+ 和 CD8+ 长期潜伏的T细胞亚群 玉米菌菌–受感染的个体。 IFFI值为IFN-γ, TNF-α, and/or IL-2 were calculated via multiplication of CD154+CD4+ 和 CD8+ T细胞子集频率由其MFI。分析了六个LTLTBI供体。出于比较目的，对每个供体中的每个反应减去培养基背景IMFI值。浅灰色盒子代表CD154+CD4+ T细胞应答和深灰色盒CD8+ T细胞应答。框内的线代表中位数。盒子的较低边界表示第25百分位和上边界75百分位。晶须扩展到最低值和最高值。
总之，七种鉴定的IVE-TB AGS是强烈免疫原性的，触发E / C中的特异性和高细胞免疫应答+ TST+ 个人和长期LTLTBI个人，但不在E / C中− TST+ 个体，健康的分枝杆菌幼稚个体和TB患者。在LTLTBI组中测量的强IVE-TB反应被鉴定为IFN-γ+/ tnf-α+CD8.+ T cells and TNF-α+/ IL-2+ CD4+ T细胞是产生细胞因子最突出的贡献者，其次是三阳性T细胞。
讨论
使用定量基因组 玉米菌菌 转录分析，我们已经确定了一系列 玉米菌菌 在体内表达的基因 玉米菌菌 在抗抗性和敏感小鼠的肺部感染，我们术语IVE-TB。先前发现的大多数基因已被发现在此中表达 玉米菌菌 蛋白质组，由此编码Bona Fide 玉米菌菌 蛋白质。这是通过其免疫原性谱的进一步支持，因为许多这些蛋白质引发了人WBA和淋巴细胞刺激测定中的IFN-γ产生 玉米菌菌 ESAT6 / CFP10响应患者，但不在ESAT6 / CFP10中− TST+ 个人，HC捐助者或TB患者。这在案例中特别相关 RV2435C. 和 RV3353C.作为他们的蛋白质产品尚未识别;然而，IFN-γ反应在E / C中证明+ TST+ 个人，间接地表现出这些 玉米菌菌 在分枝杆菌感染过程中呈现给人免疫系统的蛋白质。
我们鉴定的许多我们鉴定的IVE-TB基因已经与适应性响应的关系描述 玉米菌菌 环境压力条件，尤其是那些 玉米菌菌 可能在宿主感染期间遇到。我们确定了一个 玉米菌菌 DOSR调节件编码基因（Rv0079）（7）以及六个基因，即EHR调节件（Rv1284, Rv1956, Rv2034, Rv2324, Rv2465， 和 Rv3515）（17）。其中三种也被描述为饥饿/营养应激基因（Rv1284, Rv1956， 和 Rv2034）（14）。 IVE-TB基因在体内肺部感染期间响应宿主诱导的应力条件的这种功能提高了我们的研究结果的生物合理性，并为我们的方法提供了有效性。
进一步的兴趣，九个 玉米菌菌 本研究中鉴定的基因尚未在关系中描述 玉米菌菌 宿主感染，尽管它们的一些功能与体外宿主诱导的应力条件（补充表III）有关的组合。这些基因中的几种在金属运输，血晶转录调节或代表金属酶中具有作用。此外，确定基因在脂质代谢中起作用。这与在营养限制条件下，在使用脂肪酸作为替代碳源代替碳水化合物的记录转移。完全，我们所识别的许多IVE-TB基因似乎与适应有关 玉米菌菌 对主持人遇到的环境压力条件。额外重要性，我们在我们体内模型中鉴定这些基因的鉴定支持以前在体外模型中获得的先前发现，通过表明它们在肺部期间诱导它们 玉米菌菌 体内感染。但是，在警告说明上，我们的数据不允许我们歧视观察到的差异 玉米菌菌 基因表达模式是宿主敏感性的变化的原因或后果（背景和/或 sst1 locus).
如前所述， 玉米菌菌 在过去进行了基因表达分析，主要是在各种不同条件下种植的体外培养的细菌。随后的工作评估 玉米菌菌 感染宿主细胞后的基因表达谱（8, 19, 43），最近的一些研究已经分析 玉米菌菌 基因表达模式也在体内（20, 59）。 Ward等人。 （59）表明，在此处几乎没有重叠 玉米菌菌 报告的基因在不同的研究报告中表达 玉米菌菌 细胞内感染，可能由于方法差异而导致。尽管如此，两项研究沃德等人。描述 （8, 60）表示类似的功能类别 玉米菌菌 在细胞内感染期间表达基因。符合此概念，在将数据与先前的报告进行比较时，少数重叠的个体 玉米菌菌 基因，但我们尽量识别使用先前描述的功能类别的基因。这些差异可能是由于选择标准的差异，在诸如感染途径的实验设置中，以及我们之前使用的特定小鼠模型则尚未分析。
尽管存在这些差异，但我们的几个选择的IVE-TB基因具有重叠 玉米菌菌 如图所示，在其他研究中鉴定的基因 表二。这 玉米菌菌 谁 Rv2225 在Karakousis等人的人工肉芽肿模型中也显着表达了其表达肉芽肿。 （21）。这加强了与宿主肉芽肿形成的关联。我们在体内肺结核肉芽肿相关 玉米菌菌 - 抑制基因与ramakrishnan和同事（61, 62） 为了 m Marinum.，这可能是由于研究的分枝杆菌物种之间的差异。此外，我们之前还描述了我们识别出高度表达的几种IVE-TB基因，包括 Rv0467 (ICL.），它们在乙醛酸途径中编码酶，这对于 玉米菌菌 持久性 玉米菌菌 (63, 64）， 和 RV0991C.，这是在体内表达的基因组岛中所谓的一部分（20）。
新的 玉米菌菌 我们在本研究中发现的AGS可能代表疫苗接种的有趣目标，因为它们在此期间表达 玉米菌菌 在（遗传易感）肺中感染，我们考虑适当的AG选择的关键参数。此外，成功的疫苗AGS应在多个之间保存 玉米菌菌 菌株。检查的所有蛋白质序列在测试中被保守 玉米菌菌 菌株。此外，对于几乎所有IVE-TB基因，多个蛋白质组研究已经记载了它们作为蛋白质的表达 玉米菌菌 (表III）。分析的IVE-TB蛋白的子集显示为通过WBA，淋巴细胞刺激测定和多色流式细胞术中的TH1反应判断的强烈免疫原性。实际上，在E / C内鉴定了最高IFN-γ响应+ 我们的TST人口+ 队列，而没有看到丝裂菌诱导的反应的差异。没有看到任何反应 玉米菌菌 非反对者健康个体，表明IAVE-TB AGS的T细胞识别确实是AG特定的并且与...相关 玉米菌菌 基于TST和QFT-GIT转换的曝光。有趣的是，TB患者表现出对IVE-TB AGS的识别相对较低，这表明他们并没有对这些AGS产生强大的TH1抗威力。
重要的是，在LTLBI中可以检测到IVE-TB特异性响应，该答案已经暴露于 玉米菌菌 多年前，尽管没有预防性治疗，但从未开发过TB症状。具有针对IVE-TB AGS活动的最突出的T细胞子集包括IFN-γ+/ tnf-α+CD8.+ T cells and TNF-α+/ IL-2+CD154.+CD4+ T细胞。 Thus, CD8+ T细胞是IFN-γ生产的主要贡献者。有趣的是，也是AG特定激活的CD154人群+CD4+ 观察到T细胞，其不产生IFN-γ，TNF-α或IL-2。这些细胞可以施加替代函数，其可包括IL-17的产生，免疫调节或其他功能，这需要进一步研究。最后，我们之前报道了多功能CD4+ 和 CD8+ T细胞对复苏促进因子和DOSR蛋白的反应，并显示IFN-γ+/ tnf-α+CD8.+ T细胞也是对这些AGS的响应中最突出的子集，这表明特定差异T细胞亚群的发展可能与所涉及的特定蛋白质AG的性质无关。
CD8+ 在识别通过MHC I类分子呈现的表位时激活T细胞，表明通过规范胞质途径或通过替代（例如，交叉灌注）途径存在和处理AGS（65）。 CD4+ 和 CD8+ T细胞很重要 玉米菌菌 control, and CD4+ 和 CD8+ 例如，T细胞缺陷小鼠增加了易感性 玉米菌菌 (66）。 CD4+ 最近显示T细胞在IFN-γ的间接激活中发挥重要（IFN-γ-无关）的作用+CD8.+ T cells (67）。在任何情况下，我们在LTLBI个人中获得的数据显示 玉米菌菌 Ag-specific CD4+ 和 CD8+ 识别IVE-TB年代的T细胞必须长期居住。
以前分析了一些IVE-TB AG的免疫原性。在TST中分析了DOSR RV0079蛋白的免疫原性+ （地方性）个体以及（治愈）TB患者（9, 12, 68）。在这些研究中，RV0079蛋白质被少数个人认可，同意我们在本研究中的结果。先前分析了EHR和饥饿AGS的免疫原性和RV1284和RV1956 m Bovis. - 牛排牛（17, 69）。 RV1284是五个最佳认可的AGS之一，而RV1956也得到高度认可。与观察到的响应相反 m Bovis.在我们的研究中，曝光牛，RV1284是适度认识的，而RV1956则更好地认识到。
总之，通过结合 玉米菌菌 我们已经确定了与惊人的宿主敏感性背景的受感染小鼠肺部的基因组转录分析。 玉米菌菌 在肺部感染期间在抗性或易感动物中特异性表达的基因。这些基因揭示了签名 玉米菌菌 根据遗传宿主背景和宿主敏感性，体内压力反应。从这些基因中，我们选择了16种蛋白质，其中在E / C中被证明是高度免疫原性的+ TST+ 供体和LTLTBI，因此代表有趣的TB疫苗候选者和可能的TB Biomarker AGS（70）。
披露
T.H.M.O.是一个辛格的 玉米菌菌 延迟AG专利，由莱顿大学医疗中心拥有。其他作者没有财务利益冲突。
致谢
我们感谢Louis Wilson的生产 玉米菌菌 裂解物，以及参加本研究的所有献血者。
脚注
这项工作得到了欧洲委员会项目FP7纽特比瓦克和FP7 VACTRAIN（文本代表作者的意见，并不一定代表委员会的立场，这对由此类信息制成的使用不承担责任） D-101-1，欧洲和发展中国家的临床试验合作项目AE-TBC。资金机构在研究设计，数据收集和分析中没有作用，决定发布或编写手稿。
本文的在线版本中包含补充材料。
本文中使用的缩写：
- B6
- C57BL / 6J.
- BCG.
- 分枝杆菌BOVIS. Bacillus calmette-guérin
- C3H
- C3HEB / FEJ.
- E / C.
- ESAT6 / CFP10混合动力车
- ehr.
- 忍受缺氧反应
- HC.
- 健康控制（捐赠者没有暴露于 结核分枝杆菌)
- IMFI.
- 综合中值荧光强度
- 伊
- Isoniazid.
- Ipr1
- 细胞内病原体抗性1
- IVE-TB.
- 在体内表达的 结核分枝杆菌
- LTBI.
- 潜在结核病感染
- LTLBI.
- 长期潜在结核感染
- QFT-GIT.
- Quantiferon-Tb金管测试
- RGCN.
- 相对基因拷贝数
- RT.
- 逆转录酶
- sst1
- 对结核病的超出性1
- TB.
- 结核
- TST.
- 结核菌素皮肤测试
- WBA.
- 全血清。
- 已收到 2012年6月14日。
- 公认 2012年12月10日。
- 版权© 2013 by The 美国免疫学家协会, Inc.
