抽象的
脱羟基甲氧氧基喹术素（Dhmeq）是低m.W。强烈抑制NF-κB的化合物。以前的报道显示Dhmeq直接与NF-κB亚基的特异性半胱氨酸残基结合，从而抑制它们的核易位和DNA结合。在这项工作中，我们描述了Dhmeq抑制了NF-κB的细胞因子触发激活的新机制。我们发现，肾小管细胞持续暴露于DHMEQ阻断的TNF-α-和IL-1β诱导的TGF-β-活化激酶1（TAK1）磷酸化，是IκB激酶上游NF-κB活化的关键事件。该抑制因反应性氧物质（ROS）介导，因为以下：1）DHMEQ引起的产生RO; 2）ROS发生器预处理抑制细胞因子诱导的TAK1磷酸化和NF-κB活化; 3）ROS的清除验证了DHMEQ对TAK1和NF-κB的抑制作用。我们还发现Dhmeq通过产生ROS引起展开的蛋白质反应（UPR）。通过化学和遗传伴侣缓解UPR，部分减弱了DHMEQ对NF-κB的抑制作用。 UκBα降解下游的UPR介导的NF-κB的抑制作用及P65的磷酸化。随后的实验表明以下：1）DHMEQ通过UPR引起C /EBPβ的选择性诱导; 2）C /EBPβ的过表达抑制了NF-κB的活化; 3）C /EBPβ的敲低衰减DHMEQ的抑制作用; 4）DHMEQ诱导的C /EBPβ的表达不影响IκBα的TNF-α-触发的降解P65的磷酸化。这些结果表明，除了其对NF-κB的NF-κB核转移的已知作用外，DHMEQ在IκB激酶-IκB水平的上游和下游的通过产生ROS会干扰细胞因子诱导的NF-κB信号传导。
介绍
Rel / NF-κB转录因子家族是有助于调节炎症，免疫应答和细胞存活的关键球员。它由五种不同的Rel / NF-κB蛋白质的同源或异二二聚体组成，包括P50，P52，P65（Rela），Relb和C-Rel（ 1）。在未刺激的细胞中，通过与调节蛋白的相互作用，称为IκB，在细胞质中螯合NF-κB。然而，当细胞暴露于刺激时，迅速激活IκB激酶（IKK）复合物，导致磷酸化和蛋白酶体介导的IκBα的降解。然后释放的NF-κB然后易于核，其中结合κB增强子元素并诱导炎症靶基因的转录（2）。众所周知，NF-κB在炎症，动脉粥样硬化和癌症的位置激活，并控制局部NF-κB活性是对各种炎症和恶性疾病的有希望的治疗策略（3 ）。
NF-κB被炎性细胞因子快速激活，例如IL-1β和TNF-α。尽管TGF-β-活激素的信号传导事件由IL-1β和TNF-α信号分享，但是上游分子事件不同。在募集TNF-α与TNFR，TNFR相关因子（TRAF）2和受体相互作用蛋白1（RIP1）的结合后，募集到TNFR1。该复合体在RIP1上产生K63泛素链（4）。相反，响应于IL-1β，Traf6被募集到IL-1R，导致其与K63连接的多统素链的自动素化（5, 6）。在TNF-α和IL-1β信号传导中，K63连接的络合剂链募集复合物，由TAK1结合蛋白（TAB）1，TAB2 / 3和TAK1组成，导致TAK1的磷酸化（7）。磷酸化的Tak1激活由IKKγ（也称为Nemo），IKKα和Ikkβ组成的经典IKK复合物（8, 9 ）。
脱羟基甲氧氧基喹术蛋白（Dhmeq）是NF-κB的新型有效抑制剂，最初是作为抗生素环氧喹癌素C的类似物（10）。先前的报告表明，DHMEQ直接与NF-κB亚基的特异性半胱氨酸残基结合并抑制了它们的核易位和DNA结合（11）。 DHMEQ比其他已知抑制剂（例如，蛋白酶体抑制剂）更具选择性地靶向NF-κB，因此具有治疗用途的优点。实际上，之前的研究表明，DHMEQ改善了各种模型的炎症，包括类风湿性关节炎，自身免疫性乌脑炎，微管脑炎和肾小球肾炎（12–15）。值得注意的是，DHMEQ也对顽固性恶性疾病有效，例如激素不敏感的前列腺癌和恶性乳腺癌（16, 17）。然而，目前，它还没有很好地理解为什么Dhmeq对治疗这种难以应变性疾病如此有效。其他未知机制也可能利于DHMEQ的治疗效果。
Lampiasi.等人。 （18）报道，DHMEQ对人肝癌细胞的抗肿瘤作用是通过产生反应性氧（ROS）的介导的。也就是说，DHMEQ诱导的ROS产生引起的生长抑制，胱天蛋白激活和随后的癌细胞凋亡。虽然已知ROS在早期阶段激活NF-κB（19），持续产生的ROS可能会产生负面影响NF-κB信号。实际上，几项研究提供了证据表明ROS不是激活剂，而是NF-κB的抑制剂，如摩根和刘最近审查的（20）。 Wu等人。 （21）报道，在人晶状体上皮细胞中，持续氧化应激抑制TNF-α-触发的NF-κB活化。 Loukili等。 （22[还表明，预处理氧化应激可防止炎症细胞因子诱导的NF-κB活化。基于这些发现，DHMEQ至少部分地通过后期的ROS产生了NF-κB的激活。然而，迄今为止，DHMEQ诱导的ROS生成与其对NF-κB的影响尚未得到阐明。
In this study, we investigate a role of ROS in the suppressive effect of DHMEQ on NF-κB. Our current results revealed ROS-dependent mechanisms underlying the pharmacological action of DHMEQ. In addition to its known effect on nuclear translocation and DNA binding of p65, DHMEQ interferes with cytokine-triggered NF-κB在ikk的上游和下游的信号传导 level. The former mechanism targets TAK1/TAB complex, and the latter involves 展开的蛋白质反应 (UPR)-mediated induction of C/EBPβ.
材料和方法
试剂
如前所述合成DHMEQ（10, 23N - 乙酰 - l-Cysteine（NAC）和Thapsigargin是从Sigma-Aldrich日本（东京，日本）和4-苯基丁酸（4-PBA）来自Calbiochem（San Diego，CA）。
细胞
大鼠肾小管上皮细胞系NRK-52E是从美国型培养收集（Manassas，VA）中获得的，通常用于实验。 HEK293人类胚胎肾细胞由S. Takeda（Yamanashi大学，日本Yamanashi大学）提供。野生型和P65 - / - 小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）由H. Nakano（Juntendo大学医学院，东京，日本）提供（24）。将这些细胞维持在DMEM / HAM的F-12（Life Technologies-BRL，Gaithersburg，MD）中，其补充有5％（对于NRK-52E）或10％（对于MEF和HEB和HEK293）FBS。实验在1％FBS存在下进行。
建立稳定的转染剂
使用电穿孔，用PCINEO-ORP150稳定地转染NRK-52E细胞（由S. Ogawa，Kanazawa大学，Kanazawa，日本提供）（25）建立了编码150-KDA氧调节蛋白（ORP150）和NRK / ORP150细胞（26）。通过用PCDNA3.1（Invitrogen，Carlsbad，CA）转染确定模拟转染的NRK / NEO细胞。通过使用PRNA-U6.1-SiC /EBPβ的NRK-52E细胞稳定地转染NRK / SiC /EBPβ细胞，其引入小干扰RNA（siRNA）靶向大鼠C /EBPβ（27）。还通过稳定转染通过PRNA-U6.1-NEO（Genscript，Piscataway，NJ）进行模拟转染的NRK / SICONTROL细胞。
瞬态转染
使用电穿孔，用PCDNA-LAP，PCDNA-LIP瞬时转染NRK-52E细胞（由Colado大学，丹佛，CO的J. Friedman提供）（28（日本） （29），Peree-Luc，Pupre-Luc（由L. H. Glimcher，哈佛医学院，波士顿，MA提供）（30），PCMv2-Flag-Tak1，PCDNA-HA-TAB1（由富山大学H. Sakurai提供，日本富山）（31）或PCDNA3-HO-1（由M. P. Soares提供，Instituto Gulbenkian deCiênciaOeiras，葡萄牙）（32）。全长大鼠血红素氧酶-1（HO-1）的PCDNA3-HO-1代码。 PCDNA-LAP和PCDNA-唇编码肝富集的活化蛋白（LAP）和肝抑制蛋白（唇）。 PNFκB-LUC，PERSE-LUC和PUPRE-LUC在κB位点的控制下引入荧光素酶基因，分别是分别的内质网（ER）应激响应元件（ESE）和UPR元素（UPRE）。使用Genejuice（Novagen，Madison，Wi），P65 - / - 用PCDNA3-P65WT或PCDNA3-P65（C38S）瞬时转染MEF（由M. Nishida，九州大学，福冈，日本提供）（33）并进行分析。 HEK293细胞也用PCR-Flag-Traf2（由H. Nakano提供）与PCINeo-HA-UB（由M. Fujimuro，京都药物大学，京都，日本提供）一起进行分类，并进行免疫沉淀测定。
荧光素酶测定
根据制造商的协议，通过荧光素酶测定系统（Promega，Madison，Wi）评估了荧光素酶的活性。通过甲藻测定估计的可行细胞的数量归一化荧光素酶的活性，并且示出了相对值（％）作为图表。
北印迹分析
通过单步方法提取总RNA，如前所述进行Northern印迹分析（34）。 MCP-1的CDNA（35），C /EBPα，C /EBPβ，C /EBPδ（由E.-Z.Amri，Center National de La Recherche Scientifique，Nice，France提供）（36），BIP / 78-KDA葡萄糖调节蛋白（GRP78）（由广岛大学，日本广岛大学提供K. imaizumi）（37），C / EBP同源蛋白（CHOP）（38），激活转录因子（ATF）4（由D. Ron，纽约大学医学院，纽约，纽约州），ORP150（由S. Ogawa提供）（25）和Ho-1（由仙台大学医学院，仙台，日本S. Shibahara提供）（39）用于制备放射性标记的探针。 GAPDH的表达用作负载控制。使用imagej软件（国家健康机构，Bethesda，MD）进行密度计量分析。
Western印迹分析
细胞在放射免疫沉淀测定法中裂解（25mM Tris-HCl [pH 7.5]，150mM NaCl，1％Triton-X，1％[W / V] SDS，50mM NAF和1mM Na3 vo. 4）用蛋白酶抑制剂混合物（Nacalai tesque，京都，日本）并进行Western印迹分析。通过使用Chemi-Lumi One L（Nacalai Tesque）可视化免疫反应性蛋白质。使用的主要ABS如下：抗TRAF2 AB，防RIP1 AB，抗磷酸-KAK1（THR187）AB，抗TAK1 AB，抗蛋白酶AB，抗磷酸-IKKα/β（SER176 / SER. 177）AB，抗胰剂AB，抗磷酸-iκBα（SER32）AB，抗磷酸-P65（SER536）AB，抗磷酸-DSRNA依赖性蛋白激酶（PKR） - 样ER激酶（PERK）（THR980）AB，抗磷酸 - 真核翻译起始因子2α（EIF2α）（SER51）AB，抗磷酸盐（SER473）AB和来自Cell信号技术（Beverly，MA）的抗AKT AB;抗TNFR1 AB，抗-IκBαAB，抗PERK AB，抗EIF2αB，抗C /EBPβB，抗GADD153（CHPH）AB和来自Santa Cruz Biotechnology（Santa Cruz，CA）的抗P65 AB ;来自Sigma-Aldrich日本的抗标志AB，抗血凝素AB和抗β-肌动蛋白AB;和来自Invitrogen的抗Lamin B1 Ab。
免疫沉淀法测定
用蛋白酶抑制剂混合物在放射免疫沉淀测定缓冲液中裂解转染细胞并以16,000×离心 g 30分钟。将上清液与抗标岛M2 Sepharose（Sigma-Aldrich日本）温育4小时，在4℃下通过煮沸在SDS样品缓冲液中进行蛋白质复合物，并进行免疫印迹分析。
细胞质和核蛋白的分馏
根据制造商的协议，用ProteExtract亚细胞蛋白质萃取试剂盒试剂（Merck，Darmstadt，Germany）裂解细胞质和核分裂。对核提取物进行蛋白质印迹分析。作为加载控制，使用Lamin B1的水平。
检测超氧化物
在没有或存在NAC的情况下，用DHMEQ刺激3小时并进行荧光显微镜，将细胞加载过超氧化物检测试剂（Enzo Life Sciences，Farmingdale，NY）30分钟，并进行荧光显微镜。
格式化的分析
使用细胞计数套件-8（Dojindo实验室，熊本，日本），通过Modazan测定评估活细胞数量。
动物实验
C57BL / 6雄性小鼠（18-25g体重）注射PBS或DHMEQ（15mg / kg）I.P. 6小时后，肾脏受到Northern印迹分析 GRP78, 劈 ， 和 C /EBPβ..
统计分析
在记者测定和甲型碱测定中，在全份数中进行实验，并且数据表达为平均值±SE。使用非参数曼恩 - 惠特尼进行统计分析 U 测试将数据与不同组中的数据进行比较。一个 p value <0.05被认为表明统计学上有显着差异。
结果
抑制细胞因子触发的NF-κB activation by DHMEQ upstream of IKK
我们检查了在NF-κB的TNF-α-触发的TNF-α-触发的激活中对DHMEQ预接触的影响。用PNFκB-LUC转染的NRK-52E细胞用DHMEQ将6小时预处理，暴露于TNF-α6小时，并进行荧光素酶测定。记者测定表明，DHMEQ显着抑制了NF-κB的活化（图。1A）。它与钝的诱导相关 MCP-1，NF-κB依赖性基因（图。1B）。符合这些结果，通过DHMEQ的治疗，P65的核易位也受到抑制（图1C. ）。
抑制细胞因子触发的NF-κB activation by DHMEQ upstream of IKK. (A) NRK-52E cells were transfected with pNFκB-luc，用5次预处理μg / ml dhmeq 6小时，暴露在10 ng / ml tnf-α6小时，并进行荧光素酶测定。测定以二份均进行，数据呈现为手段± SE. Statistical analysis was performed using the nonparametric Mann-Whitney U 测试将数据与不同组中的数据进行比较。星号表示统计上有显着差异（ p < 0.05). (B）用DHMEQ预处理6小时，暴露于TNF-α的细胞6小时，并进行Northern印迹分析 MCP-1。表达式 GAPDH. 显示在 底部 作为加载控制。星号表示非特定频段。 （C用DHMEQ预处理细胞6小时，并暴露于TNF-α15分钟。对核蛋白质进行P65的蛋白质印迹分析。 Lamin B1的水平显示在 底部 作为加载控制。 （D）将细胞用Dhmeq预处理1或6小时，暴露于TNF-α15分钟，并在SER的磷酸化P65进行Western印迹分析536 （P-P65）和总P65蛋白质。 β-actin的水平显示在 底部 作为加载控制。 （E）用PCDNA3.1（空载体），PCDNA3-P65WT或PCDNA3-P65（C38S）转染P65-kextout MEF;有或没有Dhmeq的预处理;暴露于TNF-α;并进行Western印迹分析。 （F) NRK-52E用或没有Dhmeq预处理细胞，暴露于TNF-α or 1 ng/ml IL-1β for up to 15 min, and subjected to Western印迹分析. (G 和 H) NRK-52E cells were treated with TNF-α5分钟（g）或10 ng / ml IL-1β在没有或存在Dhmeq预处理的情况下，高达10分钟（h）并进行磷酸化IKK的Western印迹分析α/β.
以前的报道表明，SER的P65磷酸化536 TNF-α-和LPS诱导的NF-κB活化需要（40, 41）。我们检查了DHMEQ是否会影响P65的TNF-α诱导的磷酸化。如图所示 图。1D，暴露于DHMEQ 6小时明显抑制P65的磷酸化。有趣的是，这种抑制作用在短期（1-H）前对DHMEQ预接触不明显。因为DHMEQ快速传输到细胞中并在15分钟内结合NF-κB亚基（42），DHMEQ在后后的抑制P65磷酸化可能是独立于P65和DHMEQ之间的物理相互作用引起的。检查这种可能性，P65淘汰（P65 - / - ）用野生型P65或C38S突变的P65转染不允许DHMEQ的结合（11）。然后用Dhmeq预处理细胞，暴露于TNF-α，并进行SER的Western印迹分析536 - 磷酸化的p65。类似于野生型P65转染的细胞，DHMEQ在C38S突变的P65转染细胞中类似地阻断P65的磷酸化（图1E.）。该结果表明DHMEQ抑制P65磷酸化与其直接结合到P65，并且可能是通过干扰上游信号传导事件。
众所周知，在Ser的P65磷酸化536 通过TNF-α由IKK复合物介导。活化的IKK还诱导磷酸化并随后IκBα的降解（43）。为了进一步证实我们的结论，我们研究了DHMEQ预处理对IκBα的降解的影响。与P65磷酸化的动力学平行，DHMEQ还抑制了在NRK-52E细胞中抑制了TNF-α诱导的磷酸化和IκBα的降解（图。1F., 剩下 ）。在MEF和HEK293细胞中类似地观察到这种现象（补充图1A）。此外，在IL-1β刺激的细胞中还观察到DHMEQ的P65磷酸化和IκBα磷酸化/降解的抑制（图。1F., 对）。这些结果表明，在后期阶段，DHMEQ不仅通过抑制P65核运输而抑制NF-κB信号，而且还通过抑制IKK的水平或上游的一些事件。实际上，在TNF-α-和IL-1β刺激的细胞中预暴露于DHMEQ抑制IKKα/β的磷酸化（图1G., 1H ）。
抑制细胞因子触发的NF-激活κB through inhibition of TAK1/TAB complex
为了阐明DHMEQ抑制TNF-α-触发IKK的激活，我们首先检查DHMEQ对IKK激活必需的信号分子水平的影响。为此目的，用DHMEQ预处理NRK-52E细胞，暴露于TNF-α，并进行TNFR1，TRAF2，RIP1，TAK1和IKKγ的Western印迹分析。如图所示 图2A，这些分子都不是通过持续暴露于Dhmeq的下调。然而，DHMEQ在NRK-52E细胞和HEK293细胞中显着抑制TNF-α-和IL-1β-触发的TAK1磷酸化（图。2B, 2C，补充图1B）。在TNF-α-和IL-1β-触发的NF-κB信号传导中，TAK1 / TAB复合物上游的分子事件不同（44）。因此，我们的结果提出了Dhmeq抑制细胞因子诱导的NF-κB在Tak1 / Tab络合物水平上的可能性。为了进一步检查这种可能性，我们测试了DHMEQ是否阻止由TAK1和TAB1的过度表达引起的TAK1-IKK信令的激活。然而，由DHMEQ（补充图1C）不抑制由Tak1 / Tab1过度表达引起的Tak1和IKKα/β的磷酸化。该结果表明DHMEQ影响了TAK1 / TAB级上游的NF-κB信令。
抑制细胞因子触发的NF-激活κB through inhibition of TAK1/TAB complex. (A–C) NRK-52E cells were treated with TNF-α5分钟（a，b）或与IL-1β在没有或存在Dhmeq预处理（6小时）的情况下最多10分钟（c）并进行蛋白质印迹分析。
抑制细胞因子触发的NF-κB activation through generation of ROS
先前的报告表明，DHMEQ通过产生ROS引起了生长抑制，水疗酶活性和随后的癌细胞凋亡（18）。虽然已知ROS在早期阶段激活NF-κB，但持续产生的RO可能会产生负面影响NF-κB信号（20）。我们研究了ROS在DHMEQ对NF-κB的抑制作用中的作用。首先，在NRK-52E细胞中研究了DHMEQ诱导ROS生成的潜力。因为O.2− 是从氧分子产生的第一次还原剂和其他ROS的关键前体，我们检查了o的生产 2−。如图所示 图3A，Dhmeq增加了o的水平2−，用抗氧化剂Nac治疗废除。基于这一结果，我们接下来测试了ROS在DHMEQ对NF-κB的抑制作用中的参与。记者测定表明，暴露于DHMEQ抑制TNF-α诱导的NF-κB活化，并通过NAC的治疗显着逆转（图3B.）。还使用用谷胱甘肽还原乙酯预处理的细胞获得类似的结果，膜可渗透的GSH类似物（数据未示出）。符合此结果，抑制作用 MCP-1 Dhmeq. P65的表达和核易位通过NAC治疗衰减（图3C., 3D），建议ROS参与。 DHMEQ的TNF-α诱导的TNF-α诱导的TAK1，IκBα和P65的磷酸化也被NAC逆转（图3E.），表明ROS依赖机构至少部分地靶向IKK的上游TNF-α信令。
抑制细胞因子触发的NF-κB activation through generation of ROS. (A）在不存在或存在1mac NaC的情况下将NRK-52E细胞加载过超氧化物检测试剂30分钟，暴露于DHMEQ 3小时，并进行相位对比显微镜（ 最佳 ）和荧光显微镜（底部 ）。 （ B) Cells were transfected with pNFκB-LUC，在没有或没有DHMEQ的情况下在没有或存在NAC持续6小时的情况下，暴露于TNF- α for 6 h, and subjected to luciferase assay. (C）在没有或没有Dhmeq的情况下在NAC的情况下进行或没有DHMEQ预处理细胞，暴露于TNF-α3小时，并进行Northern印迹分析 MCP-1 。 （ D）在没有或存在NaC的情况下用DHMEQ预处理细胞，并暴露于TNF-α15分钟。提取核蛋白并对P65进行蛋白质印迹分析。 （E）在没有或存在NaC的情况下用DHMEQ预处理细胞，暴露于TNF-α5分钟，并对所示分子进行蛋白质印迹分析。 （F) Cells were transfected with pNFκb-luc，有或没有50的预处理μm menadione 2小时，暴露在tnf-α for 6 h, and subjected to luciferase assay. (G) Cells were pretreated with or without menadione for 4 h, exposed to TNF-α最多15分钟，并对所示分子进行蛋白质印迹分析。在报告中测定中，在全份数中进行实验，数据表达为手段± SE. Asterisks indicate statistically significant differences (p < 0.05).
使用o的发电机进一步证实了这一结论2−。记者测定表明，通过植物联合植物的预处理，通过TNF-α激活TNF-κB的激活（图3f.）。此外，o的一代2− 还抑制TNF-α诱导的TAK1，IKKα/β，IκBα和P65的磷酸化（图3G.）。这些结果进一步表明DHMEQ诱导的ROS产生抑制TAK1 / TAB复合物上游NF-κB的TNF-α-触发的激活。
Dhmeq通过一代招收UPR的归纳
Dhmeq.在NRK-52E细胞中导致ROS产生（图3A）。以前的报道表明，ROS可能有可能诱导ER应激和随后的uPR激活患者和香烟烟雾暴露细胞（45, 46）。实际上，在人肝癌细胞中，通过产生ROS（18）。此外，另一种证据表明UPR根据细胞环境（以下）uPR对QF-κB的活性产生正面或负面影响47）。因此，我们假设DHMEQ通过ROS介导的UPR诱导抑制TNF-α诱导的NF-κB活化。为了检查这种可能性，我们首先测试了DHMEQ是否在我们的实验环境中诱导UPR。 UPR涉及三个主要换能器，包括Perk，ATF6和肌醇需要酶1.在ER应力条件下，PERK的激活导致EIF2α的磷酸化，促进ATF4的诱导/活化和斩波的表达。 P90ATF6，ATF6的无活性形式也在GOLGI装置中切割，并且所得P50ATF6激活ERSE和随后的ER伴侣，包括GRP78。类似地，活化的肌醇需要酶1催化从X盒结合蛋白1的mRNA中除去小内含子（XBP1），导致产生活性转录因子XBP1并随后upre激活（48）。基于该目前的知识，NRK-52E细胞与DHMEQ进行治疗不同的时间段，并进行北部和Western印迹分析ER应激标记物。如图所示 图4A，Dhmeq迅速诱导表达 GRP78, 劈 ， 和 atf. 4。 DHMEQ还诱导PERK和EIF2α的磷酸化（图4B.），激活eShe（图4C.），拼接 XBP1 mRNA (图4D），并因此激活UPRE（图4E.）。这些结果表明，DHMEQ有可能激活UPR的三个主要分支机构。
Dhmeq通过生成ROS诱导UPR。 （A）NRK-52E细胞用DHMEQ治疗，表明时间段，表达 GRP78, 劈 ， 和 atf. 4 被北印迹分析检查。 （B）将细胞用Dhmeq处理，最多3小时，并进行Perk和EIF2α的Western印迹分析。 （C–E）用perse-luc（c），pcax-f-xbp1Δdbd-luc（d）或pupre-luc（e）转染细胞;用DHMEQ预处理最多12小时;并进行荧光素酶测定。 （F 和 G）在NAC的不存在或存在下用DHMEQ处理细胞并进行Northern印迹分析 GRP78 和 劈 （f）EIF2α（g）的蛋白质印迹分析。 （H 和 I）用perse-luc（h）或pcax-f-xbp1Δdbd-luc（i）转染细胞，在没有或存在NaC的情况下暴露于Dhmeq，并进行荧光素酶测定。 *p < 0.05.
为了审查DHMEQ的UPR诱导是否归因于ROS生成，在NAC的不存在或存在下用DHMEQ治疗细胞，并进行北部/免疫印迹分析和报告分析。如图所示 图4F. 和 4G，dhmeq诱导的表达 GRP78 和 劈 通过NaC的处理衰减EIF2α的磷酸化。此外，激活渗流和拼接 XBP1 在NAC存在下，DHMEQ也被抑制了（图4h., 4I）。这些结果清楚地表明Dhmeq通过产生ROS引起UPR。
UPR. 参与Dhmeq对NF-的抑制作用κB
我们研究了UPR参与Dhmeq对NF-κB的抑制作用。首先，用连续浓度的DHMEQ预处理细胞并用TNF-α刺激，检查UPR水平与NF-κB抑制程度之间的关系。如图所示 图5A，Dhmeq诱导的表达 GRP78 和 劈 以剂量依赖的方式，它与剂量依赖性抑制相反 MCP-1 (图5A）。记者测定还表明，ER应激标记物的剂量依赖性诱导与NF-κB的剂量依赖性抑制相反相关（图5B.）。为了确认ER压力确实负责DHMEQ抑制NF-κB，我们建立了ER应激性NRK / ORP150细胞。 ORP150是一个ER伴侣，可保护细胞免受ER应激诱导的损伤（49, 50）。已建立的NRK / ORP150细胞表达 ORP150 丰富，并且响应于DHMEQ（补充图2A），它与抑制蛋白质的抑制诱导相关。在这些ER抗应力的细胞中，DHMEQ的抑制作用 MCP-1 谦虚，但显着减少（图5C. ）。
UPR. 参与Dhmeq对NF-的抑制作用κB. (A）将NRK-52E细胞用序列浓度的DHMEQ进行预处理6小时，暴露于TNF-α6小时，并进行Northern印迹分析 GRP78, 劈 ， 和 MCP-1 ( 剩下 ）。水平 GRP78 和 MCP-1 被水平标准化 GAPDH.，图表中显示了相对强度（对 ）。 （ B) NRK-52E cells were transfected with pNFκB-luc，用序列浓度的Dhmeq进行预处理，暴露于TNF-α, and subjected to luciferase assay. (C) NRK/Neo cells and NRK/ORP150用或没有Dhmeq预处理细胞，暴露于TNF-α, and subjected to 北印迹分析 of MCP-1 和 ORP150。星号表示非特定频段（ 剩下 ）。北方印迹的密度分析如图所示（对 ）。 （ D）NRK / Neo细胞和NRK / ORP150细胞用或不含DHMEQ处理6小时，通过TNF-α刺激15分钟，并进行Western印迹分析（ 剩下 ）。水平 IκBα磷酸化的p65被归一化的水平归一化β-actin, and relative intensity is shown in graphs (中间 和 对 ）。 （ E）在不存在或存在下的5mM 4-PBA的情况下用DHMEQ进行预处理NRK-52E细胞，暴露于TNF-α15分钟，并进行Western印迹分析（ 剩下 ）。 Western Blot数据的密度计量分析如图所示（中间 和 对）。实验以一式三份或四份化进行，并且数据表示为平均值±SE。
为了进一步检查DHMEQ诱导的ER应激的作用部位，用DHMEQ预处理模拟转染的细胞和NRK / ORP150细胞，暴露于TNF-α，并对IκBα和磷酸化P65进行Western印迹分析。如图所示 图5DORP150的ER压力衰减不影响DHMEQ对IκBα降解和P65磷酸化的抑制作用（图5D）。当使用化学伴侣4-PBA来衰减ER应力时，该结果是可重复的。也就是说，4-PBA的ER应激的衰减不影响DHMEQ对IκBα的TNF-α-触发的降解的抑制作用和P65的磷酸化（图5E.）。注意，4-PBA有效地减弱了ER应力，这通过eIF2α的磷酸化和表达的磷酸化减少证明 GRP78 和 劈 （补充图2b）。总之，这些结果表明DHMEQ通过IKK-IκB水平下游的UPR抑制NF-κB的激活。
诱导C / EBPβ由Dhmeq通过ROS–ER stress pathway
我们调查了DHMEQ对ER应激介导的NF-κB抑制的机制。如上所述，DHMEQ触发UPR导致抑制IκBα降解水平下游的NF-κB。尽管持续的ER应力可能通过TRAF2的下调，AKT的去磷酸化和A20（NF-κB的内源性抑制剂）的下调来影响TNF-α信号传导。26, 51–53），这些分子事件位于IKK的上游（26因此，不应该是Dhmeq的主要目标。实际上，TRAF2水平不受DHMEQ预接触的影响（图2A）。同样，DHMEQ没有抑制磷酸化AKT的水平（数据未显示）并且没有诱导表达 A20 (53）。有助于UKK下游NF-κB的UPR介导的抑制的一种可能候选者是C /EBPβ。 C / EBP是一种转录因子系列，其在C末端含有高度保守的基础亮氨酸拉链域。先前的报告显示，可以在ER压力下引起一些C / EBP（54）。另一份报告还表明C / EBP与P65物理相互作用，从而抑制NF-κB介导的转录（55）。 DHMEQ触发的UPR可以诱导C / EBP，从而抑制NF-κB的活化。为了检查这种可能性，用DHMEQ处理细胞，并测试C / EBP系列成员的表达。如图所示 图6A，Dhmeq优先诱导表达 C /EBPβ. mRNA没有诱导 C /EBPα. 和 C /EBPδ。 它与C /EBPβ蛋白，臀部和唇缘上调有关（图6B.）。另一个UPR诱导剂，ThapsIgargin，类似地诱导C /EBPβ（补充图3A）。 DHMEQ诱导C /EBPβ蛋白通过4-PBA的治疗衰减（图6C.），建议upr的作用。此外，诱导 C /EBPβ. Dhmeq的mRNA和C /EBPβ蛋白通过NAC治疗衰减（图6D., 6E）。这些结果表明DHMEQ通过ROS介导的UPR来推动C /EBPβ。值得注意的是，DHMEQ的C /EBPβ的诱导不仅在培养细胞中观察到，而且在体内情况下观察到。如在补充图所示。3B，I.P.注射DHMEQ诱导的表达 C /EBPβ. 在大鼠肾脏中，它与ER应激诱导有关。
诱导C / EBPβ由Dhmeq通过ROS–UPR压力途径及其参与抑制NF-κB. (A 和 B）NRK-52E细胞用DHMEQ处理，以进行指示时间段，并进行Northern印迹分析 C /EBPα., C /EBPβ.， 和 C /EBPΔ.（a）C / EBP的Western印迹分析β (LAP and LIP) (B). (C– E）在不存在或存在4-PBA（c）或NaC（d，e）的情况下，用或不含Dhmeq处理细胞6h（d）或9h（c和e），并进行Northern印迹分析（d）和Western印迹分析（C，E）。 （F) Cells were cotransfected with empty vector, pcDNA-LAP, or pcDNA-LIP together with pNFκB-luc。然后将细胞暴露于TNF-α for 6 h and subjected to luciferase assay. (G）用空载体，pcdna-leap或pcdna-lip转染细胞;暴露于TNF-α长达30分钟;并对所指示的分子进行蛋白质印迹分析。 （H）用空载体或用PCDNA-LAP和PCDNA-唇部转染细胞。然后将细胞暴露于TNF-α持续15分钟，并对核蛋白质进行P65的蛋白质印迹分析。 （I) Cells were cotransfected with siControl or siC/EBPβ together with pNFκB-luc，用Dhmeq预处理，暴露于TNF-α, and subjected to luciferase assay. (J) NRK/siControl cells and NRK/siC/EBPβ用或没有Dhmeq预处理细胞，暴露于TNF-α for 15 min, and subjected to Western印迹分析 of indicated molecules. *p < 0.05.
C /EBPβ在UPR介导的NF-κB抑制中的参与
这 C /EBPβ. 基因编码三种不同的蛋白质，包括LAP1，LAP和唇缘。为了检查C /EBPβ的涉及DHMEQ对NF-κB的抑制作用，将细胞用PNFκB-LUC与臀部或唇部共转录。然后将细胞暴露于TNF-α并进行荧光素酶测定。通过Western印迹分析证实了LAP和唇缘的增强表达（补充图3C）。如图所示 图6F.，通过膝盖或唇部显着抑制TNF-α诱导的NF-κB活化。然而，膝盖或唇的过度表达不影响IκBα的TNF-α-触发的降解和P65的磷酸化（ 图6G.），表明C /EBPβ的诱导抑制了IκBα降解下游NF-κB的活化。基于此结果，我们测试了C /EBPβ是否影响P65的核易位。如图所示 图6H.，LAP和唇缘过表达响应于TNF-α抑制P65的核转位。该结果表明，即使当P65完全磷酸化时，C /EBPβ的结合也会干扰P65的核易位。
为了进一步确认C /EBPβ的涉及TNF-α在抑制NF-κB中，用PNFκB-LUC与对照siRNA或SiC /EBPβ一起用COT甘露出来。然后用Dhmeq处理细胞，暴露于TNF-α，并进行荧光素酶测定。通过蛋白质印迹分析证实了SiRNA的C /EBPβ的敲低（补充图3D）。记者测定显示C /EBPβ的敲低部分，但显着逆转DHMEQ对NF-κB的抑制作用（图6i.）。与所示结果一致 图6G.，C /EBPβ的敲低对DHMEQ对TNF-α诱导的IκBα的降解的抑制作用和P65的磷酸化没有影响（图6J.）。这些结果表明，DHMEQ通过UKK-IκB水平下游的C /EBPβ诱导抑制NF-κB的活化（Fig. 7 ）。
NF-封锁的机制κB由Dhmeq激活。在早期阶段，DHMEQ直接结合P65亚基，从而抑制它们的核易位和DNA结合，导致抑制细胞因子诱导的NF-κB activation ( 剩下 ）。然而，在后期的阶段，DHMEQ通过多种机制干扰NF-κB信号传导（对 ）。 DHMEQ causes generation of ROS that contributes to suppression of the TNF-α在ikk的上游和下游的信号传导–IκB级。一个目标是上游信号，激活Tak1，其磷酸化由ROS抑制。 ROS的另一个目标是C / EBPβDhmeq通过ROS引起的–UPR pathway. C/EBPβ抑制NF-的核易位κb通过与p65和其他nf的物理互动κB subunits.
讨论
Dhmeq.是一种新型NF-κB抑制剂，预计是炎症和恶性疾病的有效治疗剂（56）。之前的报道显示，在早期阶段，DHMEQ直接与NF-κB亚基的特异性半胱氨酸残基结合，从而抑制其核易位和DNA结合（Fig. 7, 剩下 ）。 In this work, we describe additional mechanisms by which DHMEQ suppresses cytokine-triggered activation of NF-κB. Our current results suggest that, in the later phase, DHMEQ interferes with cytokine-induced NF-κB signaling via multiple mechanisms. That is, DHMEQ causes generation of ROS that contributes to suppression of TNF-α在ikk的上游和下游的信号传导–IκB level. One possible target is upstream signaling that activates TAK1, the phosphorylation of which is inhibited by ROS. Another possible target of ROS is C/EBPβDhmeq通过ROS引起的–UPR pathway and抑制NF-的核易位κB through physical interaction (Fig. 7, 对 ）。
目前，Dhmeq如何通过ROS抑制Dhmeq如何抑制细胞因子诱导的Tak1的磷酸化。我们发现，DHMEQ（补充图1C）没有抑制过表达塔巴1介导的TAK1的磷酸化，表明DHMEQ靶向上游分子，例如TNFR1，TRAF2，RIP1或突出部/ 3。值得注意的是，DHMEQ没有下调TNFR1，TRAF2，RIP1和TAB2的蛋白水平（图2A，补充图1D）。以前的报道显示氧化应激抑制遍在蛋白缀合酶的活性（57, 58）。 TRAF2是E3泛素连接酶，并在RIP1上产生K63多泛素链（4）。 TRAF2的多聚覆盐对于响应于TNF-α的响应于TNF-κB而异（59）。基于此目前的知识，我们测试了DHMEQ可以通过阻断TNF-α诱导的TRAF2多聚素抑制NF-κB。然而，免疫沉淀测定表明，Dhmeq对Traf2的多边覆疏水影响（补充图1E）几乎没有影响，不包括这种可能性。总之，这些结果支持一个想法，即DHMEQ的主要目标可以是Tab2 / 3。最近，张等人。 （60）报道，通过在NPL4锌指结构域中的半胱氨酸残基进行修饰，直接灭活Tab2 / 3。一种可能的机制可以是DHMEQ触发的ROS产生通过类似机制导致突出的突出蛋白灭活。众所周知，通过半胱氨酸残基的S-谷胱甘肽化改性各种信号分子（61–64）。特别地，参与NF-κB信号传导的分子对该改性敏感。例如，先前的研究表明Cys的S-谷胱甘肽62 P50封闭NF-κB的DNA结合（65）。另一份报告还表明，在Cys的Ikkβ的S-谷胱甘肽179 是由暴露于h引起的2O2，导致灭活NF-κB（66）。类似机制可以参与DHMEQ ros介导的标签抑制。我们的初步数据显示还原剂DTT部分反转DHMEQ对P65磷酸化的抑制作用（数据未显示）。
罗斯 通过抑制NF-κB的另一种可能的机制可以涉及HO-1。 HO-1是一种催化血红素分为三种产品的酶，包括一氧化碳，胆汁丁，自由铁，所有这些都介导HO-1的抗炎，抗污染和抗增殖作用（67）。已知HO-1通过氧化应激激活（68, 69），并且许多报告显示HO-1具有抑制NF-κB的激活（70–72）。我们发现Dhmeq诱导的表达 HO-1 mRNA和它在NRK-52E细胞中的NAC衰减（补充图4A）。此外，转染 HO-1 适度，但显着，减弱TNF-α-触发的NF-κB活化（补充图4B）。虽然其贡献可能是次要的，但HO-1介导的机制也可以参与DHMEQ的NF-κB的ROS介导的抑制。
在本调查中，我们表明DHMEQ通过产生ROS诱导UPR，这有助于抑制NF-κB。目前，目前尚不清楚ROS如何引起ER压力。以前的报道显示，通过抑制CA抑制ER中的氧化应激诱导钙储存的枯竭 2+-ATPase，从而扰乱ER功能（73, 74）。但是，ROS可能会导致CA中的ER压力2+ - 独立的方式。例如，持续的氧化应激可能导致蛋白酶体系的失活（21）通过氧化E3泛素连接酶的氧化（75），导致积累展开的蛋白质。类似的机制也可以参与DHMEQ的ROS介导的UPR诱导。
在这项工作中，我们表明DHMEQ通过氧化应激 - UPR途径诱导C /EBPβ。 C /EBPβ基因编码三种不同的蛋白质，包括LAP1，LAP2和唇缘。与膝盖形成鲜明对比，唇缺乏反式激活结构域，但可以二聚化并与DNA结合。因此，唇部用作转录因子圈的显性阴性抑制剂。在先前的报告中，人C /EBPβ基因在3'末端具有upre，ER应力可以通过激活该元素诱导C /EBPβ的表达（54, 76）。可能，DHMEQ可以通过类似机制诱导C /EBPβ。
目前，C /EBPβ抑制TNF-α-触发NF-κB的分子机制在很大程度上是未知的。 Stein等人。 （77）证明重组C /EBPβ抑制NF-κB亚基与C / EBP的碱性亮氨酸拉链区域和NF-κB亚基的rel同源结构域之间的物理相互作用结合κB增强子基序的能力。然而，在目前的研究中，我们观察到，在NRK-52E细胞中，LAP和唇疱疹的过度抑制核易位P65（图6H.）。使用B淋巴细胞，Takeiri等。 （78）表明，Relb的DNA结合活性的丧失降低了培养核蛋白质进口的Importin的稳定性和亲和力，导致Relb的细胞内定位改变。 C /EBPβ可能与P65结合并降低其DNA结合活性，导致通过封闭P65和Importin之间的物理相互作用来减弱P65的核转位。
胡等人。 （79）表明，对ER应激的预处理抑制了TRAF2的水平，这可能损害TNF-α-触发的NF-κB的活化。我们还报告说，肾细胞的长期暴露于ER应激导致Traf2的下调（26, 51, 80）。随后的实验表明，通过ER相关的降解，ER应激会加速TRAF2蛋白的降解（79）。在目前的研究中，我们在早期阶段没有观察到DHMEQ的堕落（图2A）。然而，在后期的阶段，DHMEQ可以具有降解TRAF2通过ER应激的可能性，从而抑制TNF-α的NF-κB的激活。
NF-κB抑制剂被认为是各种炎症和恶性疾病的潜在治疗剂。然而，由于其有效性和副作用不足，常规NF-κB抑制剂的临床应用仍然有限。与常规NF-κB抑制剂相比，DHMEQ与治疗剂有几个优点。首先，它具有较强的潜在能够在多个靶位点抑制NF-κB信号传导，如本工作所述。在体内，Dhmeq不仅可以施用i.p.，而且可以施用。或者是在截留的（ 56）。 DHMEQ快速进入细胞并立即抑制NF-κB（42）。此外，短暂暴露于DHMEQ可能足以抑制持续时间的NF-κB活化（42）。它可能是由upr诱导引起的。 DHMEQ的这些性质允许快速，强烈，持久的NF-κB抑制，而无明显不良反应，这对于抗炎剂是理想的（56 ）。
总之，我们证明了Dhmeq对NF-κB的多能抑制。除了先前描述的机制之外，还涉及其他药理作用，特别是在后期。在早期阶段，DHMEQ快速结合NF-κB亚基并阻止其核易位。然而，在后期的阶段，ROS的产生和随后的UPR也有助于抑制NF-κB。这些多种机制使DHMEQ能够在广泛的疾病中发挥有效，持久的抗炎/抗癌活动（56 ）。
披露
作者没有财务利益冲突。
致谢
我们感谢Drs。 Hirooyasu Nakano，Masahiro Fujimuro，Senobi Ogawa，雅各布弗里德曼，Takao Iwawaki，Lauriaki H. Glimcher，Hiriaki Sakurai，Miguel P. Soares，Motohiro Nishida，Ez-Zoubir Amri，Kazunori Imaizumi，David Ron和Shigeki Shibahara提供实验材料。
脚注
这项工作得到了教育，文化，科学，科学和技术部的42390235的助理资助（对M.K.）。 S.N.来自日本促进科学学会的年轻科学家的研究奖学金得到了支持。
本文的在线版本中包含补充材料。
本文中使用的缩写：
- atf.
- 激活转录因子
- 劈
- C / EBP同源蛋白质
- Dhmeq.
- 脱羟基甲氧吡啶喹啉蛋白酶
- eIF2α
- 真核翻译开始因子2α
- 呃
- 内质网
- ERSE
- 呃 应激响应元件
- GRP78
- BIP / 78-KDA葡萄糖调节蛋白
- HO-1
- 血红素氧合酶-1
- IKK.
- IκB激酶
- l
- 肝富集的活化蛋白
- 唇
- 肝抑制蛋白
- Mef.
- 小鼠胚胎成纤维细胞
- n
- N - 乙酰 - l-Cysteine.
- ORP150
- 150 kda氧气调节蛋白
- 4-PBA
- 4-苯基丁酸
- Perk.
- DsRNA依赖性蛋白激酶样ER激酶
- RIP1
- 受体 - 相互作用蛋白1
- 罗斯
- 反应性氧气
- siRNA
- 小干扰RNA
- 标签
- TAK1结合蛋白
- TAK1
- TGF-β-活性激酶1
- TRAF.
- TNFR相关因素
- UPR.
- 展开的蛋白质反应
- 芬兰
- UPR. 元素
- XBP1
- X盒结合蛋白1。
- 已收到 2013年1月18日。
- 公认 2013年4月11日。
- 版权所有©2013由美国免疫学家，Inc。
