抽象的
巨噬细胞内末端血栓药隔室的膜通常因通过吞噬作用或细胞内病原体分泌的毒素而受到的颗粒的物理或化学作用受损。该研究鉴定了巨噬细胞的新型诱导活性，从而增加吞噬体，晚期骨髓和溶质物到膜损伤的抗性。用LPS，肽聚糖，TNF-α或IFN-γ进行鼠巨噬细胞的预处理赋予了光氧化化学引起的细胞内膜的后续损伤的保护或通过研磨二氧化硅或二氧化硅微球的吞噬作用。吞噬体损伤部分依赖于反应性氧物质，但与吞噬细胞氧化酶无关。来自小鼠缺乏吞噬细胞氧化酶的小鼠的IFN-γ刺激的巨噬细胞抑制细胞内病原体的缺失李斯特菌，这提出了这种诱导型急性急性（抗压力）在巨噬细胞抗性的巨噬细胞抗病中的作用，该病原体损伤细胞内膜。赖定和抑制L.单核细胞增生逃逸部分归因于热休克蛋白-70。因此，促进是一种新颖的，巨噬细胞的一种，巨噬细胞维持或恢复内溶解剂膜的完整性。
介绍
典型巨噬细胞激活响应于LPS，其他细菌衍生的分子，细胞因子IFN-γ和TNF-α在宿主防御中是重要的影响（1, 2）以及败血症，癌症和动脉粥样硬化（3–5）。诱导抵消感染的生化活性包括吞噬细胞NADPH氧化酶（6）诱导诱导没有合成酶（7），其分别产生有毒反应性氧物质（ROS）和反应性氮物质。其他抗菌活性包括增加吞噬物体 - 溶酶体融合，AG呈递，铁螯合和自噬（8–10）。巨噬细胞的细菌感染还增加了热休克蛋白-70-70（HSP70）的细胞表达，这可以通过非分类分泌系统从巨噬细胞释放（11, 12）。在这些过程中仅涉及活化调节基因的一部分（13），这表明存在巨噬细胞用于打击感染的其他活动的存在。
古典巨噬细胞激活最初鉴定出核对感染的能力 李斯特菌 保护小鼠免受随后的传染性挑战（14）。 L.单核细胞增生 是一种革兰氏阳性的细胞内病原体，导致胃肠疾病或更严重的感染孕妇，新生儿或免疫造成的个体（15）。通过吞噬作用进入细胞后， L.单核细胞增生 分泌胆固醇依赖性胞嘧啶，Lysteriolysin O（LLO），其有助于逃离巨噬细胞吞噬物质进入胞质溶胶。细菌通常在吞噬物体溶酶体融合之前逃避巨噬细胞吞噬体（16）。野生型 L.单核细胞增生, 但不是 L.单核细胞增生 lacking LLO (ΔHLY.）可以破坏吞噬噬菌体膜的pH和钙梯度，这延迟了含有灯-1阳性溶酶体的细菌的植物融合（16, 17）。在细胞溶胶中， L.单核细胞增生 乘以并最终将宿主肌动蛋白细胞骨架的寄生胶囊塞多塞以入侵邻近的细胞。 IFN-γ激活巨噬细胞在保护小鼠中具有关键作用 L.单核细胞增生 infection (18），显着改变动态 L.单核细胞增生 in macrophages (19, 20）。活性巨噬细胞产生的活性氧和氮物质抑制 L.单核细胞增生 感染并逃离巨噬细胞吞噬体（21, 22）。激活巨噬细胞其他功能在预防下的作用 L.单核细胞增生 逃避仍然是未知的。
在先前对溶酶体损伤的研究中，我们确定用LPS处理的小鼠巨噬细胞的吞噬细胞造成抗噬菌体或二氧化硅微球（SMS）后更耐损伤，而不是未刺激的巨噬细胞的吞噬细胞（23）。早期的研究表明HSP70在稳定溶酶体中的作用（24–28）。由于对内吞室膜的损害是通过细胞内病原体感染的必要后果，即进入宿主细胞细胞溶胶，增加对这种膜损伤活性的抗性是一种新的感染机制。因此，我们研究了这种新型诱导活动的机制以及HSP70对该阻力的贡献。我们表明保护效果可以通过TLR配体，IFN-γ，TNF-α，完整的细菌和外源添加的HSP70诱导。这种活动有限的各种药剂损伤，包括地面二氧化硅，SMS，光诱导膜损伤和感染 L.单核细胞增生，表明它是活化巨噬细胞的一般保护响应。
材料和方法
材料
荧光素 - 葡聚糖（FDX;平均分子质量3000DA），RPMI 1640，FCS，青霉素/链霉素溶液，缬氨酸霉素，Nigericin，重组小鼠IL-10，重组小鼠IL-1β，细胞染色的重组小鼠IL-1β，SNARF-1羧酸醋酸琥珀酸琥珀酰亚胺酯，细胞痕量CFSE细胞增殖试剂盒，德克萨斯红葡聚糖（TRDX;平均分子量10,000da），德克萨斯红藻素和庆大霉素溶液购自Invitrogen（Carlsbad，CA）。重组人IFN-β，二环碘鎓（DPI）和 N - 乙酰 - l-Cysteine（NAC）购自Sigma Chemical Co.（圣路易斯，MO）。 lps no。 225. Salmonella typhimurium. 来自列出的生物实验室（Campbell，CA）和35毫米菜肴，附着的14毫米覆盖物覆盖物购自理亚金公司（Ashland，MA）。肽聚糖（PGN）来自 大肠杆菌l-LYSINE（PLL）30分钟。重组Hsp70和HSC70纯化为参考文献。 29。已描述YM1（也称为MKT077）的合成（30）。
骨髓衍生的巨噬细胞
C57BL / 6J（野生型），B6.129S-CYBB.tm1Din/ j（nox2 deficient), and TLR4 - / - 小鼠（菌株C57BL6 / 10SCN）购自杰克逊实验室（Bar Harbour，Me）。所有小鼠都在密歇根大学动物设施的特定病原体条件下维持。先前已经描述了来自小鼠骨髓细胞的巨噬细胞的分化（23, 31）。简而言之，在M-CSF存在下，在M-CSF存在下培养从小鼠股骨提取的骨髓细胞，其由30％L细胞条件培养基提供。将骨髓衍生的巨噬细胞（BMM）冷冻并在-130℃下储存为含M-CSF的含量的等分试样，其中10％DMSO并根据需要进行解冻。
装载巨噬细胞溶酶体和细胞刺激
在用10％FCS和青霉素/链霉素/链霉素中允许BMM在RPMI 1640中附着数小时，在含有150μg/ ml FDX的培养基中孵育细胞过夜。然后将BMM冲洗并在未标记的培养基中捕获至少3小时，以允许FDX贩运indolysomal网络的后期隔间（32）。从BMM培养物中省略了青霉素/链霉素被感染 L.单核细胞增生。 LPS（100ng / ml），pgn（2.5μg/ ml），IFN-γ（100u / ml），TNF-α（100ng / ml），IL-6（5ng / ml），IL-10（在FDX脉冲介质和随后的无乳蛋白瘤中，包括100ng / ml），IL-1β（10ng / ml）或IFN-β（100u / ml）。将未涂覆的SMS送入BMM，在无血清培养基中，将PLL涂覆的SMS加入含有10％FCS的培养基中的细胞中并在成像之前孵育1小时。
测量底糖体舱的损伤
如前所述，通过外延荧光比率显微镜测量底糖体膜损伤，如外延荧光比率显微镜测量（23）。用FDX漂洗和成像在Ringer的缓冲液（155mM NaCl，5mm KCl，2mM CaC1中成像进行搅拌和成像。2，1 mm mgcl2，2毫米nah2宝4使用尼康TE300倒置显微镜，10毫米HEPES和10毫米的葡萄糖）配备汞弧灯，×60平面镜头1.4 - 数值孔径目标，一种冷却的数字CCD相机（Quantix Photometrics，Tucson，AZ），一个温度 - 控制阶段，以及Fura / Fitc Ratiometric二向色镜（Omega光学，BrattleBoro，VT）。获取三个图像的每个细胞领域：一个相位对比图像和两个荧光图像，它使用510nm发射滤光器和两个不同的激励带通滤波器（以440nm和485nm为中心），安装在计算机中 - 受控过滤轮（Sutter Instruments，Novato，CA）。 Metamorph软件（分子装置，Downingtown，PA）用于图像捕获和分析。
440nm激励通道中的FDX信号对pH相对不敏感，而485nm激励通道中的信号在pH 4.5和7.5之间变化。因此，485-nm信道中的FDX荧光与440nm信道中的FDX荧光的比率与图像（像素）的任何子区域中的pH相关。对于校准，使用离子团Nigericin和Valinomycin（10μm）固定在pH 9,7.5,7.0,6.5,6.0,5.5,7.0,6.5,6.0,5.5,5.0,4.5和4.0的细胞中测量485nm / 440nm激发比。在夹紧缓冲器中（130 mm KCl，1mm MgCl2，15毫米HEPES，15毫米MES）。如前所述将比率转化为pH（17, 23, 33）。然后使用Sigmaplot软件（SAN JOSE，CA）构建四种变量的矩形标准曲线。表现出pH大于pH5.5的地区表示溶酶体释放。通过在5.5的pH值区域中的440nm强度求和440nm强度并将该值除以整个细胞的总和440nm强度来计算细胞中释放的FDX百分比。
溶酶体的光氧化损伤
BMM用150μg/ ml FDX与75μg/ ml TRDX加固，然后用LPS和IFN-γ刺激18小时，如前所述。将TRDX用作光敏剂，并且FDX成像用于监测溶酶体损伤。用林格的缓冲液冲洗BMM，安装在显微镜加热阶段上，并使其平衡5分钟。选择用于成像的字段，然后获取初始FDX图像集。使用580nm trdx励磁滤波器，细胞在规则的5-s曝光中暴露在明亮的光线上。在每次曝光之间，获取440nm处的FDX图像和485nm以评估溶酶体损伤。重复该过程60秒的580纳米照片暴露（12×5秒）。然后从每个时间点从FDX图像计算FDX释放百分比。
感染细胞 L.单核细胞增生
野生型 L.单核细胞增生 应变（DP-L10403）和δHly L.单核细胞增生 （DP-L2161）由Daniel Portnoy（加利福尼亚大学，伯克利）提供。 L.单核细胞增生 将培养物在室温下在室温下生长过夜，然后在37℃下在37℃下稀释并生长到OD 600nm = 0.8。然后离心一毫升细菌培养物（2分钟以5000× g）并重新悬浮在Ringer的缓冲区中。在振动37℃培养箱中使用Snarf-1或CFSe染料染色15分钟的细菌。然后将培养物在Ringer缓冲液中洗涤三次。通过在没有抗生素的情况下添加细菌至200μl培养基并用这种感染混合物替换BMM培养基的细菌来感染BMM。所有感染均为10分钟，然后在林格的缓冲液中漂洗并在含庆大霉素的培养基中追逐。在90-120分钟的培养后，被感染的细胞成像以损坏或固定以测量 L.单核细胞增生 escape.
瓦苏逃逸的测量 L.单核细胞增生
BMM感染CFSE染色 L.单核细胞增生 使用细胞骨架固定固定（2％多聚甲醛，30mM HEPES，10mM EGTA，0.5mM EDTA，5 mm MgSO4，33mm乙酸钾，5％聚乙二醇400），并在PBS中透明于0.1％Triton X-100。盖玻片在含有2％山羊血清的PBS中封闭，并使用德克萨斯红藻素和DAPI染色。对细胞进行成像，对每个感染的巨噬细胞记录了总量（DAPI阳性）和逃逸的数量（德克萨斯红细胞素阳性）细菌。
免疫荧光显微镜
用IFN-γ或LPS刺激12 mm圆形盖玻片上的BMM，然后为免疫荧光显微镜制备。将细胞在37℃下固定60分钟（固定剂：2％多聚甲醛，4.5％蔗糖，20mMHEPES，pH 7.4,70mM NaCl，10mM KCl，10mM MgCl2，用-20℃甲醇萃取，2mM EGTA，70mM赖氨酸-HCl，10mM钠碘酸钠-HCl，10mM钠周期），冲洗（TBS：20mM Tris-HCl，pH 7.4,4.5％蔗糖，150mM NaCl），用TBS冲洗加上2％绵羊血清（TSS），与HSP70（兔抗HSP70 / HSC70; Santa Cruz Biotechnology）和Lamp-1（大鼠单克隆1d4b;发育研究杂交瘤银行，爱荷华州，IA）的射击液孵育，冲洗与TSS一起孵育（Alexa Fluor 488标记的山羊抗大鼠IgG; Alexa Fluor 594标记的山羊抗兔IgG; Invitrogen），冲洗，安装在抗褪色，并通过数字荧光显微镜观察。从每种条件的10个细胞的数字图像量化Alexa 488标记的Hsp70的荧光。
统计方法
学生 t 对含有相似量的SMS的细胞组进行测试， L.单核细胞增生或者光刺激。
结果
巨噬细胞活化稳定溶酶体
以前的研究确定，用LPS刺激巨噬细胞后，降低了颗粒介导的溶酶体损伤（23）。为了确定哪些其他试剂可以诱导这种效果，BMM晚期内体和溶酶体被FDX加载并用细胞因子或TLR配体刺激，然后通过SMS的吞噬作用诱导的损伤作为从底糖组织中的FDX释放到细胞质中（图。1A, 1B）。 LPS，PGN，IFN-γ和TNF-α受到SMS挑战的影响，而IL-6，IL-10，IL-1β和IFN-β没有。时间过程测量表明，需要18小时的LPS刺激所需的全溶酶体保护，尽管在5小时后观察到显着的保护（图1C.）。我们称之为这种诱导膜抗性或修复机制典型：对压力的抵抗力。
图1。
巨噬细胞激活增加了溶酶体的赖定。 （A 和 B) BMM were loaded with Fdx, chased for 3 h in medium without Fdx, then fed SMS and imaged to measure lysosome damage. The number of SMS phagocytosed by each BMM was counted, and groups of BMM with similar numbers of SMS phagosomes were compared. LPS, PGN, IFN-γ, and TNF-α增加巨噬细胞抵抗SMS损坏; IL-6，IL-10，IL-1β, and IFN-β没有保护。条形和数据点是释放的FDX的平均百分比（±SEM, n ≥ 100 cells). (C）LPS诱导的时间过程。 LPS包含在培养基中表示指示的时间。 BMM刺激18小时显示损伤明显较低，而且刺激0,1或2小时（p < 0.001) or 6 h (p < 0.05); n > 30 cells. (D）BMM喂食SNARF-1染色， HLY.-缺乏（Δ.HLY.) L.单核细胞增生 或用LPS刺激，然后用短信喂食17小时以测量损坏（n >200细胞）。 LPS或通过先前感染减少损伤ΔHly L.单核细胞增生。 （E）从δ中重新提出数据HLY. - （D）中的SMS喂养条件。使用SNARF-1荧光，将BMM分成吞噬至少一种细菌的细胞（δHLY.;暗杆）和那些在没有摄取细菌的相同盖玻片中的细胞（W / OδHLY.;条纹栏）。 （a） - （c）中的条形表示包含七至九个短信的细胞。 （d）和（e）的条形表示含有一到三个短信的细胞。 *p < 0.05, **p < 0.001.
杀死的研究（14）首先描述了对宿主防御中活化的巨噬细胞的作用，表明用亚致死剂量感染小鼠 L.单核细胞增生 导致巨噬细胞的分化随着随后的抗性增加 L.单核细胞增生 感染。尽管激活最终归因于IFN-γ和TNF-α的作用（34），我们假设一些增加的抗性可以直接通过细菌诱导。因此，我们测量了血谷素缺陷的吞噬作用的程度（δHLY.) L.单核细胞增生, 哪个不损害苍渣（17, 35, 36），通过吞噬SMS增加巨噬细胞抗性对随后的挑战。 BMM被摄取δHly L.单核细胞增生 在短期吞噬作用症后抗溶酶体损伤（图。1D）。暴露于δ的BMM子集Hly L.单核细胞增生 但没有摄取细菌表明溶酶体损伤水平与未刺激的细胞相当（图1E.），表明δHly L.单核细胞增生 在摄入它们的细胞内激活这种保护机制，而不是通过一些分泌因子。这表明由巨噬细胞摄取的微生物引发与更耐抗性的表型的细胞因子差异。
罗斯有助于粒子介导的溶酶体损伤
诱导型促进可能会干扰颗粒损伤膜的机制。由于ROS通过溶酶体损伤涉及NLRP3炎症体激活（37, 38），我们研究了ROS对吞噬症造成的贡献。用DPI预处理巨噬细胞，其是巨噬细胞中的ROS产生活性的有效抑制剂，包括吞噬细胞氧化酶（NOX2）和线粒体电子传输链（ 39–41）。加入FDX并在DPI或对照培养基中孵育的巨噬细胞被送入磨碎的二氧化硅或SMS，并评估损伤程度。 DPI在两种颗粒吞噬后吞噬损伤降低了吞噬子损伤（图2A, 2B）。类似地，BMM预孵育在抗氧化剂NAC中显示出比对照细胞的损伤较少（图2C.）。这种降低的损害与对吞噬效率的任何DPI影响无关，因为具有吞噬细胞短信的DPI处理的BMM表现出比摄入当量颗粒的对照细胞的溶酶体损伤较少。这些数据表明吞噬氧化酶无关的ROS有助于二氧化硅诱导的溶酶体损伤。因此，促进可能由干扰细胞质中的ROS产生的机制组成。
图2。
壬糖胺反应性氧中间体有助于二氧化硅介导的溶酶体损伤。 BMM加载FDX，然后喂养地面二氧化硅（A, D）或PLL涂层短信（B, C, E）。然后，将5μMDPI（A，B）或50mM NAC（C）与颗粒加入培养基中。 （d和e）来自野生型的BMM或 nox2-缺乏（Nox2 - / - ）用FDX，喂养颗粒加载小鼠，并对溶酶体损伤进行评分。所有数据点代表均值± SEM Fdx release with n >200 bmm for（a），（b），（d）和（e）和 n > 50 BMM for (C). *p < 0.05, **p < 0.001.
吞噬物质腔内的ROS的主要来源是吞噬细胞氧化酶。我们通过比较野生型和吞噬细胞氧化酶来检查吞噬细胞产生的RO对损伤的贡献（nox2） - 在地面二氧化硅吞噬作用后观察到相似水平的吞噬作用损伤（图2D）或短信（图2E.）。这表明吞噬细胞氧化酶不会有助于颗粒介导的溶酶体损伤。
L.单核细胞增生 血溶酪素损害鼻底糖浆
之间的关系 L.单核细胞增生 研究了真空逃生和内腐病毒损伤。先前的研究表明，在低多样性的感染（MOI）， L.单核细胞增生 从灯-1阴性，晚期内剂样的空泡逃脱（16), which suggests that escape could occur without causing release of Fdx from late endocytic compartments. To determine if infection at higher MOI damages late endocytic compartments, Fdx-loaded BMM were fed SNARF-1–标有野生型或ΔHly L.单核细胞增生 并测定内腐病毒损伤。在含有少于七种细菌的细胞中，野生型 L.单核细胞增生 显示出低水平的溶酶体损坏，与一种机制一致 L.单核细胞增生 在早期成熟的阶段逃离空泡。然而，较高的细菌载荷显示出更多的损坏，与数量相关联 L.单核细胞增生 per BMM (图3A-D）。 BMM感染δHly L.单核细胞增生 既不显示溶酶体损害也不是 L.单核细胞增生 逃避，确认这两个活动都需要LLO。因此，虽然在低moi L.单核细胞增生 进入细胞质，损伤晚期内吞室，更高的MOI导致将来自这些隔室的FDX释放到细胞质中。
图3。
诱导令人挑剔保护IFN-γ–activated macrophages from L.单核细胞增生 escape and damage. (A–C）感染伤害 L.单核细胞增生. C57/BL6 BMM were loaded with Fdx overnight, chased in dye and antibiotic-free medium for at least 3 h, infected with SNARF-1–标有野生型或ΔHly L.单核细胞增生，追逐含庆大霉素的培养基90分钟，并成像以测量溶酶体损伤。 （a）用野生型感染BMM的FDX pH图 L.单核细胞增生。蓝色像素表示溶酶体损伤（即细胞质FDX）。 （b）用δ感染的BMM的FDX pH图Hly L.单核细胞增生 indicates that the lysosomes are intact. Scale bar, 10 μm。 （a）和（b）中的绿色像素表示Snarf-1–labeled L.单核细胞增生。 （c）BMM的平均±SEM百分比FDX释放（n >每组100个以含有相似数量的总野生型（填充条）的细胞组绘制成绘制ΔHLY. （打开栏） L.单核细胞增生。 （D）从（c）中的FDX释放数据显示平均逃逸的数量（阴影素阳性） L.单核细胞增生 ± SEM (n >每组100册）绘制在 x - 通过总数分组的每个类别的BMM L.单核细胞增生 每个细胞（在括号中）。填充的圆圈代表了用野生型感染的BMM群体 L.单核细胞增生;原点附近的打开符号代表所有δ组Hly L.单核细胞增生。 （E 和 F）C57 / BL6（WT）和 nox2 - 菲力（NOX2. - / - ）用IFN-刺激BMM-γ (open bars) or left unstimulated (dark bars) and loaded with Fdx. BMM infected 120 min with wild-type L.单核细胞增生 用phalloidin固定并染色以测量 L.单核细胞增生 逃生（e）或成像以fdx释放（f）。 （e）中的酒吧是阴极素阳性的平均百分比 L.单核细胞增生 误差酒吧是sem（n ≥350细胞）。 （f）中的条形表示FDX释放的平均百分比± SEM of BMM containing one to seven L.单核细胞增生 per cell (n ≥ 130 cells). *p < 0.05, **p < 0.001. l.m., L.单核细胞增生.
诱导型担心抑制 L.单核细胞增生 逃避和相关的溶酶体损伤
吞噬细胞氧化酶抑制 L.单核细胞增生 逃离激活的巨噬细胞（21, 22）。确定诱导型急转还有助于抑制 L.单核细胞增生 逃离活化的巨噬细胞，野生型和 nox2 - 用FDX加载乙型BMM，用IFN-γ激活，用野生型感染 L.单核细胞增生，并评分肌动蛋白阳性细胞质细菌。 IFN-γ治疗有限公司 L.单核细胞增生 逃离野生型和 nox2 - 融资BMM。虽然IFN-γ激活， nox2-Defitie BMM没有抑制逃逸，如IFN-γ-活化的野生型BMM，它们明显优于未激活， nox2 - 融资BMM（图3E.）。 IFN-γ-激活， nox2 - 缺血BMM还显示出在后溶血体损伤的降低水平 L.单核细胞增生 感染与未激活相比 nox2 - 细胞（图3f.）。这个 nox2 - 依赖性抵抗表明诱导诱导潜力抑制 L.单核细胞增生 逃离活化巨噬细胞的液泡。但是，其他IFN-γ-诱导活动的贡献对巨噬细胞抵抗力 L.单核细胞增生 逃生不能被排除在外。
诱导诱导促进保护溶酶体免受光氧化损伤
还在非突出物鼻内体损伤测定中测量诱导型急性。晚期内体和溶酶体被通过细胞增多率加载，TRDX，作为光敏剂和FDX，以监测膜完整性。用LPS或IFN-γ刺激细胞，然后暴露于580-nm光，这激发TRDX但不是FDX。激发的TRDX增加了损伤细胞膜的光氧化化学品（24, 42）。通过在每次580纳米暴露后进行FDX测量溶酶体完整性。在未刺激的BMM中，在25次暴露后可以检测到溶酶体损伤，并且几乎完成50秒（Fig. 4）。对照BMM，其中底糖体用FDX加载但不是TRDX并类似地暴露于580nm光，显示没有损坏。 LPS刺激或IFN-γ刺激的BMM中的半最大溶酶体损伤需要比在未刺激的BMM中更大的光线暴露（Fig. 4因此，对膜损伤的诱导性抗性也影响了非甘氨酸溶酶体。
图4。
诱导型担心保护抗光电模压。 BMM溶酶体用FDX和TRDX加载。将细胞从5-S脉冲中的显微镜弧灯暴露于580-nm光;在每个脉冲之间获取FDX pH图像。 （A）PHOTS刺激BMM字段的样品pH映射，右侧的pH色键和图像下方的50μm秤条（右边）。 （B) Percent of Fdx released was calculated for each cell. Average percent release for each time point is plotted ±SEM。对每个条件分析至少50个细胞。对照巨噬细胞与LPS刺激和IFN-的显着不同γ–simulated cells with p <0.001，适用于30至50秒之间的所有数据 p <在25和55秒（未配对的学生）的数据0.05 t test).
HSP70限制损坏
由于感染可以从巨噬细胞增加HSP70的合成和分泌（11, 12）外源添加的Hsp70可以增加溶酶体耐受光电二孔（24），我们假设HSP70有助于诱导智能。巨噬细胞与重组Hsp70或LPS一起孵育，并且在短期吞噬作用后测量内溶血体损伤。外源性Hsp70降低溶酶体损伤对LPS活性细胞中的水平（图5A）。排除内毒素污染作为HSP70介导的溶酶体保护的替代解释（43），在TLR4缺陷的BMM中测量损伤。当用重组Hsp70或IFN-γ处理但不用LPS处理时，这些细胞显示出对损伤的显着抗性（图5B., 5C）。 HSP70介导的保护也受到HSP70 ATPase活性YM1（30, 44）和myr（29, 45, 46）（图5B.）。 HSC70诱导比HSP70更少的保护（图5C.），与先前观察结果一致，表明HSP70对于溶酶体保护作用的特异性（24）。为了测试内源性HSP70有助于诱导型溶酶体尿的假设，用FDX加载巨噬细胞并用LPS刺激0,5或18小时。对于SMS吞噬作用前的最后5小时，用HSP70抑制剂YM1和MYR处理细胞。在抑制剂存在下用LPS刺激的巨噬细胞显示出比没有药物的细胞更大的内腐病毒损伤（图5D），表明HSP70介导LPS诱导的典型。 HSP70对诱导型急转的贡献也在一个 L.单核细胞增生 感染模型。用HSP70或IFN-γ处理TLR4缺陷的BMM，感染 L.单核细胞增生，并逃脱得分。 HSP70治疗的BMM表明 L.单核细胞增生 逃避与IFN-γ刺激的细胞相当（图5E.）。 HSP70的抑制剂部分逆转IFN-γ介导的减少 L.单核细胞增生 真空逸出，表明HSP70介导的膜保护抑制 L.单核细胞增生 真空逃逸，HSP70有助于诱导诱导态度。
图5。
HSP70有助于诱导令人尊重。 （A–D）HSP70抑制短信损坏。 （a）将FDX加载的BMM暴露于LPS或300nm重组Hsp70，持续5小时，然后将细胞冲洗并馈送SMS 1小时并成像以进行FDX释放（1-3个SMS /细胞， n >100细胞）。 （b）来自TLR4的BMM - / - 小鼠暴露于IFN-γ过夜，LPS为5小时，或300nm HSP70，5小时，有或没有HSP70抑制剂YM1（20μM) or Myr (25 μM). HSP70 inhibited lysosome damage (n >300细胞）。 （c）TLR4 - / - BMM暴露于IFN-γ overnight or 300 nM recombinant HSP70 or HSC70 for 5 h, then assayed for SMS damage (n >180个细胞）。 （d）野生型BMM暴露于LPS 5或18小时或未治疗。 YM1（20. μM) or Myr (25 μM) were included for the last 5 h of stimulation (n > 120 cells). (E) TLR4 - / - 将BMM暴露于重组Hsp70 5小时或IFN-γ过夜。指示IFN-γ–stimulated cells were also incubated with Ym1 or Myr for the last 5 h of stimulation. BMM were infected with WT. or ΔHly L.单核细胞增生测量真空逃生（n >500个细胞）。酒吧是人口平均值（± SEM). *p < 0.05, **p < 0.001. (F 和 G) Immunofluorescence localization of HSP70 and LAMP-1 in (F) unstimulated BMM and (G) IFN-γ–刺激的BMM。叠加图像显示相应的灯泡 - 1（绿色）和Hsp70（红色）分布。秤栏，10μm.
免疫荧光显微镜表明，用LPS刺激的BMM中HSP70的总水平增加（图5f., 5G）和IFN-γ（数据未示出），HSP70本地化为小的灯泡1负囊泡。 HSP70和LAMP-1之间缺乏分致化表明HSP70对底糖瘤网络内不会发生对尿的影响。
讨论
该研究鉴定了诱导型巨噬细胞激活的新常见特征，其可以由TLR配体LPS和PGN，整个细菌和细胞因子IFN-γ和TNF-α诱导。在各种不同的膜损伤中观察到尿素，包括地面或微球颗粒，LLO依赖性膜穿孔和光氧化化学物质的吞噬作用。因此，诱导诱导的典型不太可能涉及特异于任何一种损伤的机制，而是代表一种增强内溶血素膜的一系列活性。虽然这里使用的测定允许我们分析典型作为晚期内体和溶酶体的特征，但是也可以将其他膜状隔室（例如早期的底物或内质网）也可能表现出典型。确定是否在诸如树突状细胞和上皮细胞等其他常见的感染靶标中诱导诱导症状，这将是有趣的。
巨噬细胞常规激活的介质诱导促进促进，表明炎症和宿主免受感染的作用。以前的研究表明，LPS可以诱导溶酶体对各种损伤的抗性（23），TNF-α（47）或hsp70（24），所有这些都与感染有关。这种感染者 ΔHlyL.单核细胞元 也可以诱导促进表明TLR的早期信号诱导促进作为免受随后的感染的保护。当地归意 ΔHlyL.单核细胞元 (图1E.）表明至少一些诱导是细胞自主。如果通过TLR信号传导，通过膜损伤本身或细菌Hsp70（即，DNAK）诱导，则仍有待确定。
在含有少量细菌的细胞中， L.单核细胞增生 逃脱发生损伤损伤损伤和溶酶体（图。3D）。随着溶酶体穿孔可以激活炎症（38），逃脱 L.单核细胞增生 从Prelysosomal隔间可以用作免疫逃避策略。虽然含有少量细菌的巨噬细胞造成的损伤很小，但含有许多细菌的细胞显示出广泛的底灭血糖损伤，这表明允许的机制 L.单核细胞增生 在吞噬物体溶血体融合之前逃逸，可能在一个区域存在更多细菌时可能会在感染后分解。 llo分泌 L.单核细胞增生 在逃生之前可能被贩运到以后的隔间和穿孔膜。或者，通过细胞溶溶剂分泌的LLO L.单核细胞增生 可能会损伤溶酶体膜。
潜在的机制仍然未知，但可以包括对膜损伤化学的易感性降低，膜的抗性增加，或膜修复过程的上调。非染色体ROS导致二氧化硅颗粒诱导的损伤（Fig. 2），在溶酶体内部生成的ROS可能会通过TRDX PhotoStimulation造成光毒性损伤（Fig. 4）。谷胱甘肽的合成增加涉及TNF-α-诱导对溶酶体损伤的抗性（47），与细胞抗氧化剂在限制损伤中的作用一致。在感染的细胞中 L.单核细胞增生，吞噬物质衍生的ROS抑制逃脱 L.单核细胞增生 从巨噬细胞吞噬物质（21）。因此，虽然ROS的调制仍然是用于限制损伤的可能机制，但这不太可能是促进的主要机制。降低LPS或IFN-γ诱导的光电模压的敏感性（Fig. 4）表明底糖体膜变得更耐受损坏。常用膜损伤修复机制的潜在作用仍有待测试。
真空膜损伤可具有显着的生理和免疫后果。除了允许微生物或毒力因子进入细胞质，膜损伤在巨噬细胞中诱导促炎细胞死亡计划（38）。溶酶体损伤涉及晶体或粒子积累的几种疾病，如矽肺，动脉硬化，痛风和缺乏症（37, 38, 48）。未活化细胞的溶酶体损伤导致非炎性细胞死亡（49）。活化和非激活细胞中的这些不同后果可以解释为什么促进诱导活动。低水平的内吞膜渗入细胞质（23, 50）在某些情况下可能有益，因为它可能允许通过细胞质的点燃的受体进行监测（51）或促进在MHC I类分子上的外源AGS的交叉呈递（52）。
HSP70的内溶血体保护机制未知。巨噬细胞的细菌感染可以通过非化学途径增加HSP70的合成和分泌，包括外泌虫（ 12）。外源性Hsp70激活溶酶体酸鞘磷脂酶，其又催化了磷脂化学，这增加了成纤维细胞中溶酶体膜的抗伤性抗性（24）。本研究中提出的证据表明，活化的巨噬细胞在其溶酶体中诱导相似的状态（Fig. 5）。 LPS和IFN-γ增加了HSP70水平，但HSP70没有定位于溶酶体。这表明HSP70对促进的影响可能是自治。随着HSP70抑制剂仅部分逆转LPS诱导的溶酶体尿素（图5D）或IFN-γ（图5E.），我们假设HSP70介导的保护是几种膜稳定活动之一，这些活动构成了诱导的令人敏感性。
因此，促进是在活化的巨噬细胞中诱导的新途径，从而减少了由机械力引起的底糖膜膜损伤 L.单核细胞增生。这表明增加促进的治疗干预措施可能是由于细胞内病原体或减少由于微粒或纳米颗粒而减少炎症的感染。
披露
作者没有财务利益冲突。
致谢
我们感谢Yoshinari Miyata为YM1的合成。
脚注
该工作得到了国家卫生研究院支持AI 035950（j.a.s.）和ns 059690（至j.e.g.）。 M.J.D.由国家卫生研究院得到支持，授予T32 HL07749。
本文中使用的缩写：
- BMM
- 骨髓衍生的巨噬细胞
- DPI.
- 二苯内碘鎓
- FDX.
- 荧光素-Dextran.
- HSP70
- 热休克蛋白-70
- llo.
- Lysteriolysin O.
- moi.
- 多种感染
- n
- N - 乙酰 - l-Cysteine.
- PGN.
- 肽聚糖
- PLL.
- polyl-LYSINE.
- 罗斯
- 反应性氧气
- 短信
- 二氧化硅微球
- TRDX.
- 德克萨斯红德克兰
- TSS.
- TBS加2％绵羊血清。
- 已收到 2011年11月3日。
- 公认 2012年8月7日。
- 版权所有©2012由美国免疫医生，Inc。
