抽象的
Sjögren综合征（SS）患者的唾液腺发生特征的异位淋巴结结构（ELS），其特征在于B / T细胞分区，形成高内皮静脉，滤泡树突细胞网络，功能性B细胞活化，表达活化诱导的胞苷脱氨酶，除了自身反应性浆细胞的局部分化。触发ELS形成，自身免疫和SS中外分泌功能障碍的机制在很大程度上是未知的。在本文中，我们介绍了一种新型诱导型异位淋巴组织形成，突发在递送C57BL / 6小鼠的副腺体腺体中的复制缺陷型腺病毒-5，通过逆行排泄管插管在递送复制缺陷的腺病毒-5。在该模型中，炎症迅速且始终从弥漫性浸润到从ADV递送到2 WK内的SS样悬崖淋巴结体的发展。这些渗透逐渐获得ELS功能和支持功能GL7+/活化诱导的胞苷脱氨酶+生发中心。 ELS的形成前面是淋巴结趋化因子CXCL13，CCL19和LymPhotoxin-β的异位表达，并且与高达75％的小鼠的抗核ABS的发展有关。最后，由于炎症反应的后果，观察到超过3WK后的血液感染后3 WK后的唾液流动减少。这种新型模型具有揭开调节ELS形成的细胞和分子机制及其在SS中的外分泌功能障碍和自身免疫中的作用。
介绍
形成异位淋巴结结构（ELS），定义为在非lyMphoid位置形成的淋巴细胞的聚集体，其特征在于B / T细胞分离，高内皮静脉（HEV）的分化，以及滤泡树突细胞（FDC）网络的发育在自身免疫和微生物来源的慢性炎症病症中观察到生发中心反应（1–3）。在Sjögren的综合征（SS）中，一种慢性自身免疫性疾病，其特征在于循环高亲和力，对核AGS和核糖核蛋白如RO / SSA和LA / SSB（4），并在外分手腺中的免疫细胞浸润产生口腔和眼睛干燥（SICCA综合征）（5），唾液ELS在30-40％的患者中发展（6, 7）。 SS中的ELS的发展被认为是由淋巴结趋化因子CXCL13和CCL21的异位生成调节（7–9），在生理上调节CXCR5的再循环和定位+ 和 CCR7+ 免疫细胞在次级淋巴器官（SLO）内。最近，我们和其他人表明，SS唾液腺中的ELS在SLOS中获得典型的生发中心的结构，并且能够支持自身反应性B细胞克隆的选择和扩展，如通过局部表达激活诱导的胞苷脱氨酶（AID）和自身反应性浆细胞的分化（10–12）。此外，在SS患者的大型队列中的前瞻性数据提供了证据表明，唾液腺中的ELS存在是一种更具侵略性疾病表型和唾液B细胞淋巴瘤的发育的独立预测因子（13），表明ELS在SS中发挥着中心致病作用，并且可能代表潜在的治疗目标。然而，我们目前对唾液腺中触发和调节ELS形成的关键细胞和分子事件的理解是不充分的，并且限于SS患者的横截面分析和SS等NOD小鼠的SS的自发小鼠模型（14）。此外，还不清楚为什么Els在某些患者中形成但不是其他患者，以及这些代表由不同触发剂或不同的进化阶段驱动的离散疾病子集（15）。在本文中，我们呈现了一种新的唾液腺炎在野生型C57BL / 6动物的唾液腺中发育的新诱导模型，以应对复制缺陷腺病毒5（ADV5）的选择性颌下腺施用，这概括了SS的若干特征，如ELS的形成，淋巴趋化因子的异位表达和功能性B细胞活化。重要的是，ADV5感染不仅再现SS的表型特征，而且在功能上导致体液自身免疫的发展到核AGS和唾液流量减少。因此，这种新型模型提供了对唾液腺中调节泄露耐受性，自身免疫和ELS形成的细胞和分子机制的独特可能性。
材料和方法
动物系列
根据本地办事处条例（当地研究伦理委员会），根据当地动物伦理和福利委员会和本地办公室项目许可证进行所有程序。在实验开始时，在10至13周年期间，在10至13周年期间，在标准条件下享有10至13周年龄的年轻成年女性C57BL / 6只小鼠（Harlan Labs，Loughborough，U.K.）。
adv准备和intaralivary腺体交付
萤火虫荧光素酶（LucAdv）的E1-E3复制缺陷型人ADV5的集中股，如前所述产生和表征（16）或用于细菌β-半乳糖苷酶（LaczAdv，Gnudi博士，伦敦，伦敦，伦敦，伦敦，U..）的善良礼物，用于通过HEK293细胞感染产生大量病毒颗粒，然后使用不连续的CSCL梯度纯化。然后将ADV透析含有1mM MgCl的溶液2，在侧-a-lyzer透析盒（Slide-A-Lyzer 3.5K MWCO; Thermo Scientific）上，10mM Tris（pH7.4）和150mM NaCl，用10％甘油（v / v）过夜，过夜过夜，过夜。使用斑块形成的测定法滴定从透析盒收集的ADV颗粒，并根据簧片和麦克解物的统计方法（以下）统计方法50％组织培养物感染剂量（17）。
如前所述在大鼠中描述，进行逆行小鼠颌下排泄口插管，细微修饰（18）。简而言之，用氯胺酮（60mg / kg）和甲嗪（12mg / kg）I.P麻醉小鼠;然后使用热拉玻璃气相色谱管（0.1mm内径;Σ）通过排泄管装入颌下腺。大约20μlAvad解决方案（见稍后），相当于1×108 使用附加的汉密尔顿注射器（Sigma）将PFU报告者编码ADV或缓冲车辆注入潜水腺中。将相同体积的载体缓冲液作为阴性对照输送。
在第4,7天（根据第1周组分组），11,14（第2周），18和21（第3周）后的末端麻醉下剔除小鼠。使用至少每次点的五只小鼠。颌下腺和排出淋巴结的淋巴结并分成10月（Sakura Finetek，Chatcham，U.K.）的冻干，用于丧失低温，部分储存在RNA中（Ambion，Paisley，U.K.）用于基因表达分析。
唾液腺中荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性的检测
对于荧光素酶测定，使用微珠均质器（Bertecly System; Bertin Technologies），Lucadv-Cannulated腺体在Glosic Budder（Promega）中裂解。然后根据制造商的说明用蜡笔衬底（Promega）测定裂解物。在微孔板发光计（MicroLumat Plus）中测量超过10秒的荧光素酶活性。&g berthold）。荧光素酶活性值符合用BCA蛋白质测定试剂盒（Pierce）测量的裂解物的蛋白质浓度。
对于β-半乳糖苷酶检测，LactAdv-inded腺体在OCT中冷冻冷冻呼吸冻干。将六微米厚的部分切割在显微镜载玻片上并固定在2％PFA中。然后将切片与37℃的完全β-半乳糖苷酶（X-Gal）基材（Sigma）一起温育过夜，在PBS中洗涤两次，并在苏木精中染色。然后在光学显微镜下安装并观察幻灯片。
颌下腺组织组织组织
副细胞浸润组织和潜水腺中的ELS形成的特征是通过常规染色&e定义炎症浸润的存在和患病率。隐形焦点定义为存在>50以50μm间隔分析50个潜水渗透白细胞。
插管唾液腺中ELS的特征
通过免疫荧光表征ELS的存在，用于存在T / B细胞偏析，PNAD+ HEV，开发FDC网络，以及先前描述的生发中心B细胞的分化（19）。对于T / B细胞偏析，首先，在三个切割水平的CD3 / B220分开的CD3 / B220分开染色，以具有各聚集体的代表性覆盖率;其次，通过两个独立观察者盲目地评估染色的幻灯片。当两种观察者都同意在三种切割水平中至少两个中的不同区域中的T和B细胞的全部和/或部分聚集的情况下同意的两个观察者都定义了T / B细胞分离。没有满足该定义的汇总被认为是非重建。进行B220 / GL7的双染色以鉴定生发中心B细胞，而FDC-M1用于顺序部分以评估FDC网络的存在。最后，对于HEV的鉴定和淋巴管发生，唾液腺被针对外周节点地址（MECA-79;另见T细胞区域内的HEV分层化的补充表I和补充表I）和补充表I）。对于淋巴趋化因子（CXCL13和CCL21）染色，首先用抗生物素蛋白和生物素预孵育封闭第一内源性生物素;然后将样品封闭在PBS中的10％马血清，并与CXCl13或CCl21，CD3和CD19一起孵育1小时。洗涤后，将载玻片与合适的二级和三级ABS或链霉抗生物素蛋白一起温育30分钟，洗涤，并用Prolog金（ - ）安装。将所有二次ABS预先吸收在孵育前30分钟的10％血清30分钟。染色在室温下在湿腔室中进行。在Zeiss共聚焦显微镜上获得图像，使用LSM510图像检查器软件来处理所获得的图片。介绍了用于免疫荧光的ABS列表 表I. 和补充表I.
唾液腺中的ELS相关基因的基因表达分析
使用Rneasy Mini试剂盒（QIAGEN）从颌下腺中提取总RNA，用柱DNase I消化以避免基因组DNA污染。用于第一链CDNA合成（Invitrogen Life Technologies）的RT-PCR热磷酸盐系统用于产生1mg总RNA的cDNA。用于CXCl13，CCL19，CXCR5，CCR7，LTβ），LTβ），LTβR，AID，BAFF，IL-4和IL-21的定量Taqman的引物和探针是从应用的生物系统中获得的实时评估（表二）。样品在10ng cDNA /孔中一式三份运行，使用ABI棱镜7900HT仪器检测，并使用ABI棱镜7900HT序列检测系统2.1分析结果。使用用作校准剂的车辆插管腺体的比较阈值循环方法评估相对定量。
唾液外分功能评估
在末端麻醉下在Adv处理和对侧潜水腺中评估分泌功能（戊四碳75mg / kg i.p.）。每个潜水管通过从腹腔表面通过卵骨肌肌剖检暴露。在用紫罗兰甘油刺激后切割，插管和唾液中切割，插管和唾液，10分钟（0.5mg / kg i.p.）。在收集到称重的Eppendorf管后，重新引起管，并计算唾液的体积（1mg =1μl唾液）。结果表示为Mg唾液/ 10分钟/克体重。
抗核AB检测
十二点显微镜幻灯片（Ca Hendley，Essex，U.K.）用Hep-2细胞以5×10播种4 细胞/孔，在培养上过夜。准备就绪时，将载玻片用PBS洗涤并固定在丙酮中。在PBS中连续稀释动物血清（1:80，1：160,1：320），并且在每个孔上沉积15ml稀释的血清。来自抗核AB阳性的合并血清的连续稀释（ANA+）动物（MRL / LPR小鼠）用作阳性对照。将样品和对照血清在室温下孵育1小时，在PBS中洗涤两次，并用FITC抗小鼠IgG（Sigma，Poole，U.K）孵育30分钟。将载玻片在PBS中洗涤两次，安装在荧光显微镜中，用于ANA染色。
Western Blot检测抗ADV ABS
为了评估在不同时间点的危险小鼠血清中产生抗病毒腹肌，LucAdv-或LaczAdv-感染（或未治疗）HEK293细胞在RIPa缓冲液中裂解，并通过BCA测定法测定蛋白质浓度（Pierce，Cramlington ， 英国）。通过SDS-PAGE在4-12％Novex聚丙烯酰胺凝胶（Invitrogen，Paisley，U.）上分离了总共25μg/巷的不同裂解物。使用制造商的指示，使用IBlot器件（Invitrogen）在硝酸纤维素膜上转移。在室温下在TBST中含有5％牛奶的膜条，然后与来自ADV或载体处理的小鼠的单个血清（在5,9,12,15,20,33d）中孵育1：100在4°C下块缓冲液过夜。一只兔子抗ADV抗血栓（ABCAM，Cambridge，U.K.）被用作阳性控制。然后将膜条与HRP缀合的抗小鼠（Sigma，Poole，UK）或抗兔（达科，伊梅，英国）IgG AB一起培养，并使用ECL试剂（Amersham，Amersham，UK）在制造商之后的eCloxidase活性可视化过氧化物酶活性指示。
统计分析
Mann-Whitney分析了定量变量的差异 U 在比较多个群体时，在比较两组和Kruskal-Wallis的kruskal-wallis时测试。 χ2 在需要时使用yates的校正或使用适当的时候进行确切的测试来评估不同组中定性变量的关联。所有统计分析都是使用GraphPad Prism 5.01用于Windows（GraphPad，San Diego，CA）进行的。一个 p value <0.05被认为是统计学意义。
结果
adv基因转移的剂量响应时间过程分析
通过检测到排泄管道的鼠颌骨唾液腺中的复制缺陷型ADV5先前已被描述为瞬态局部基因转移的合适有效工具（20）。我们改编了一种我们以前在大鼠开发的逆行插管技术（18）使用定制的玻璃套管，并且它被证明是在潜水腺中特定于小体积（最多50μl）的可靠方法（图。1A, 1B）。如图所示 图1C.，这种技术允许精确的递送和全渗透C57b / 6小鼠的插管潜水腺，但不是相邻的舌下腺体或对侧腺体。使用这种方法，我们接下来使用复制缺陷的人ADV5进行基因转移的时间过程和剂量 - 反应分析，用于萤火虫荧光素酶基因（LucAdv）。如图所示 图。1D在第一周PC中使用增加的Lucadv，观察到增加荧光素酶活性，然后在接下来的2WK上减少。
图1。
通过逆行小鼠颌下腺排泄管灌装术后转染效率。 （A 和 B）插入玻璃套管，插入12-WK旧的C57BL / 6小鼠的颌下腺的排泄口腔中。 （C）显示递送50μl溴苯酚蓝染料的递送的插管鼠标的代表性图像足以渗透插管潜水腺，没有溢出到对侧腺体或相邻的舌盖（箭头）。 （ D）10次左右leucap酶活性的代表性剂量 - 响应时间过程实验6, 107和10.8 PFU /腺和载体控制显示第一周内剂量依赖性酶活性。尽管持续的转基因表达，但在第2周和3周内损失剂量依赖性。
在颌下腺中形成Ss样胚胎的聚集体取决于导管上皮细胞中的ADV剂量和缺乏病毒间隙
插管腺体的组织学分析证明了10个adv剂量8 pfu / gland，但不是车辆控制（或剂量<107 PFU，数据未示出），从周2 PC引起淋巴细胞凋亡的形成组织为潜水骨料，其在SS患者中发现了强烈类似的淋巴细胞病灶（图2A-F.）。
图2。
普遍型C57BL / 6小鼠的导管上皮细胞的ADV递送及其持久性逐渐诱导SS样潜血炎症病灶。 （A–F）代表性的显微照片，显示通过局部施用载体（A-C），Lucadv（D-F）或LaczAdv（G–I）。在ADV递送之后，在第一周（D，G）的弥漫性淋巴细胞凋亡之后，随后在第2周（E，H）和第3个PC（F，I）期间逐渐组织过渡炎症聚集体。车辆递送诱导可忽略不计的炎症（A-C）。在不同时间点的Lucadv或LaczAdv递送后的云视灶/腺体数量的平均值±SEM（J）。 （G–i）潜水腺的代表性显微镜子感染了LaczAdv并染色了β-galactosidase (X-Gal, with nuclear counterstaining with hematoxylin). Numerous X-Gal+ 细胞存在于腺体中，在第一周PC（G，箭头）内。截至第2周PC，只有导管上皮细胞，通常被潜水炎症浸润所包围，显示酶活性（H）。截至3个PC，没有残留的X-gal+ 细胞是可检测的（I），但LucAdv感染腺体中的高敏感性荧光素酶活性测定显示持久的信号良好，高于背景水平，高达3 WK PC（K, mean ±荧光素酶活性的SEM。原始放大倍数×100 (A–I). **p < 0.01, ***p <在每个时间点的ADV-和车辆处理的小鼠之间，最小10只小鼠/时间点之间0.001。
淋巴聚集体的形成总是通过迅速诱导的弥漫性炎性浸润，其在第一周PC（图2D, 2G）通过典型的潜水局灶性渗透到第2周PC。重要的是，这种现象与所用的报告基因无关，因为它也被相同量的LaczAdv（图2g-i）在比较两种病毒的潜水焦点的患病率和大小没有显着差异。报告了在不同时间点递送leucadd或laczadv后唾液腺发生的悬垂性腺体数量的平均值±sem 图2J..
使用LaczAdv允许我们研究分析的不同时间点的病毒定位和免疫细胞浸润之间的关系。如图所示 图2g-i，用于细菌β-半乳糖苷酶的染色表现出腺体内病毒的早期广泛分布（图2G）。在第2周PC，LacZAdv几乎完全位于由初始炎症聚集体包围的导管上皮细胞内（图2H.）。通过用抗细胞角蛋白酶AB双免疫染色（补充图1），证明了导管上皮细胞中ADV粒子的选择性分层化的选择性分层化。虽然我们无法检测到在第3页PC上由大骨料包围的管道中的残留β-半乳糖苷酶染色（ 图2I.），在此时间点的所有渗透腺中仍然可检测到荧光素酶活性（图2K.）。总体而言，在存在残留的荧光素酶活性的情况下，从第2周的PC向前，100％的插管腺体显示局灶性潜水聚集体，展示了我们模型的高再现性和疾病渗透。
Adv Delivery后局灶性淋巴细胞渗透显示ELS的渐进功能：B / T细胞分离和FDC网络的开发
接下来，评估炎症焦点的逐步获取SLO特征，例如T / B细胞分离和FDC网络的分化。使用CD3 / B220和B220 / FDC-M1进行颌下腺渗透的双免疫荧光顺序截面分析，以评估T / B细胞分区的存在和FDC网络形成（ 19）。介绍了用于免疫荧光的ABS列表 表I.。初始渗透（第1周）大多弥漫性，其特征在于T细胞浸润的主要渗透，然后是B细胞的渐进式流量以及高度有组织的淋巴结结构，具有在离散区域定位的T和B淋巴细胞（周2-3周; 图3A-C）。因此，在ADV递送，T和B细胞首先用非团成的图案串联进入腺体，然后逐渐在高达70％的聚集体中发育有组织的隔离配置（图3G.）。此外，我们观察到在分离渗透的上下文中，观察到富含B细胞的区域内的FDC网络的分化>每周3台PC（图。3D-F., 3H）。
图3。
C57BL / 6小鼠颌下腺中T / B细胞分离和FDC网络的逐步发展。 （A–C）显微镜图显示来自ADV处理的C57BL / 6唾液腺的冷冻切片的CD3（T细胞，绿色）和B220（B细胞，红色）的双免疫荧光染色。核用DAPI（蓝色）染色。早期弥漫性浸润由T细胞（a）支配，随后募集B细胞，所述B细胞显示在前2WK PC（B）内的初始T / B细胞分区化。截至第3周，>60％的潜水灶显示在单独的区域（C和）中的T和B细胞的完全分离（C和 G）。 （D–F在第3周的PC下，ADV处理的C57BL / 6个颌下腺的显微镜图显示了FDC-M1（D，棕色; e，红色）染色的染色的FDC网络的差异。 FDC网络总是在聚集体（F）的富含B细胞的地区的背景下发展>60％的普通治疗的C57BL / 6只小鼠（H）。原始放大倍率×200（A-F）。
淋巴结趋化因子的异位表达
淋巴化趋化因子CXCL13，CCL21和CCL19在慢性自身免疫疾病（包括SS）中的ELS开发方面是关键重要性2, 15）。淋巴趋化因子的诱导和分泌已被证明依赖于异映型LTβ的表达（21–23）。为了验证这些调节器在我们的模型中的参与，我们评估了CXCL13和CCL19的异位表达及其同源受体CXCR5和CCR7，以及插管唾液腺中的LTβ/LTβR轴。介绍了用于表达分析的Taqman探针的列表 表二.
如图所示 图4A-F.，与载体处理的小鼠相比，CXCL13 / CXCR5和CCL19 / CCR7 mRNA转录物大量上调，与载体处理的小鼠相比，它们的异位表达与唾液腺中ELS的逐步检测一致，达到它们之间的表达峰值第2周和3个PC。相关性，LTβ，CXCL13 / CXCR5和CCL19 / CCR7 mRNA在第一周PC中显示出显着的上调，表明这些因素在这种诱导型淋巴新发生模型中形成了ELS。
图4。
C57BL / 6潜水腺中的ELS的研制前面是淋巴趋化因子/ LT的异位表达。β pathway. (A–F) Quantitative TaqMan real-time PCR time-course analysis of CCL19 (and its receptor CCR7) (A, D), CXCL13 (and its receptor CXCR5) (B, E), and Ltβ（及其受体）（C，F）mRNA转录物显示在潜水腺中的Adv递送后的丰富上调。对于CXCL13和LT，观察到最早的上调。βmRNA，而这些因子的表达峰值是与ELS的全组织学发展平行检测的（a–E). Conversely, Ltβr表达不受adv治疗（f）的影响。数据表示为均值± SEM of the fold increase compared with an internal calibrator. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p <在每个时间点的ADV-和车辆处理的小鼠之间，最小10只小鼠/时间点之间0.001。 (G–N) Microphotographs of multicolor confocal microscopy analysis confirming protein expression of lymphoid chemokines CXCL13 (I, in blue) and CCL21 (M), and showing colocalization of CXCL13 within the B cell-rich area (G–j）和富含T细胞内的CCL21的聚集体。 （K.–n）B细胞以红色（CD19）和绿色（CD3）中的T细胞显示。原始放大倍数×200 (G–N).
为了确认蛋白质水平的淋巴趋化因子的存在和表达模式，我们使用多色的共聚焦显微镜检查CXCL13或CCL21以及B220 / CD3。如图所示 图4G. 到 4N在分离聚集体的背景下，CXCL13和CCL21分别保留其在B和T细胞的区域内的表达模式，表明在引导T / B细胞偏析方面的作用。
诱导型异位淋巴含量逐渐获取功能性生发中心的特征
接下来评估通常与发芽中心功能相关的特征的存在，例如生发中心B细胞的分化和辅助的表达。如图所示 Fig. 5，顺序截面分析（图5A-D）证明了T / B隔离的聚集体，其特征在于富含T细胞的区域中HEV的分化（参见补充图3，用于HEV和T细胞的直接分层化）和B细胞卵泡内的FDCS支持众多的激活GL7.+ 生发中心B细胞。 GL7的外观+ 通过检测高水平的辅助MRNA转录物，发芽中心与功能性B细胞激活强烈有关，如辅助的高水平mRNA转录物（图5E.），Ig体细胞高原（SHM）和Class-Switch Refommination（CSR）所需的酶。相关性，异位诱导辅助诱导也与已知在B细胞中直接合作的若干细胞因子的表达有关，例如IL-4，BAFF和IL-21（图5f-h）。总体而言，这些数据表明，adv传染后，Els支持在这些异位位点处获得机器的B细胞的功能性耐药性的开发。
图5。
在C57BL / 6颌下腺中的ADC诱导的ELS获取功能异位生发中心的特征。 （A–D）3 WK PC的C57BL / 6小鼠的持续免疫荧光染色，显示C57BL / 6小鼠的3 WK PC，显示高度有组织的ELS，其特征在于HEV（A，RED），T / B细胞分离（B，B220在红色和CD3中的红色和CD3） ，FDC网络（c）支持GL7的差异化+ 生发中心B细胞（D，B220在红色和GL7中绿色）。 （E–H) Quantitative TaqMan real-time PCR time-course analysis of salivary gland expression of AID mRNA (E) and transcripts for cytokine downstream AID activation, such as IL-4, BAFF, and IL-21 (F–H）。辅助表达与完全形成的ELS的发育并行峰值，并且与IL-4，BAFF和IL-21的显着上调相关。原始放大倍数×200 (A–d）。数据表示为均值± SEM of the fold increase compared with an internal calibrator. *p < 0.05, **p <在每个时间点的ADV-和车辆处理的小鼠之间0.01，最小10只小鼠/时间点。
对抗AVIAC感染的体液免疫反应有利于违反核自我AGS的耐受性
在SS患者中，在唾液腺中形成免疫细胞浸润与循环核AGS和核糖核蛋白的存在有关（4, 24, 25）。因此，我们接下来研究了这种腹膜腺炎的这种模型不仅与抗ADV ABS的形成相关，还与违反自杀耐受性和ANAS的发育。正如预期的那样，来自adv-cantulated小鼠的血清，但不控制C57bl / 6，逐渐显示出早5天出现的强烈抗病毒活性，具有对病毒核心蛋白质和病毒帽的蛋白质引用的体液反应（图6A）。使用Hep2细胞作为底物测定ANA的存在和滴度。我们选择了1:80的初始血清稀释，因为这在患者的自身免疫临床试验中被认为是显着的。如图所示 图6B-E，在第1周内没有来自Adv-Cannulated小鼠的血清显示Ana积极性。相反，通过第2次PC在30.7％的小鼠中检测到ANA反应性，并且在第300条PC中剔除的动物百分比增加到75％。有趣的是，在第3周PC，FDC的ANA患病率更高+ versus FDC− 小鼠（87.5与25％）。最后，年龄/性别匹配的车辆控制C57BL / 6小鼠没有显示任何反应性。这些观察结果表明，非自动免疫易患小鼠的血颅脑炎与核核AGS的体液自身免疫诱导有关。
图6。
在C57BL / 6小鼠潜水腺中的抗病毒ABS和ANA的发展。 （A）Western Blot显示抗AVIGG在血清血清血清中的渐进式，而不是车辆插管小鼠。来自Avv-Cerved（+）和未感染的（ - - ）293细胞的蛋白质提取物并行运行。 （剩下 到 对）在20d pC的载体处理的C57BL / 6小鼠血清，商业抗ADV抗血清，来自不同时间点（5,9,12,15,20,23d PC）的AV-Cantiblated小鼠的血清。早在第5次PC中观察到抗副反应，主要针对病毒核心和CAPSIDE的蛋白质。 （B–E）使用HEP2细胞作为底物（B，C）的ANA免疫荧光检测的代表性显微镜谱图证明了血清血清中的强核反应性，但不含载体插管（B），C57BL / 6小鼠3 WK PC（稀释1:80）。随着时间的推移，ANA反应性随着时间的推移在ADV-inculated C57BL / 6小鼠（d）中，75％的小鼠通过第3周（E）显示ANA阳性。原始放大倍率×400（B-C）。
ADV感染诱导受影响但不对侧腺体中的唾液流动持续降低
SS.患者的特点是唾液（和泪腺）腺体的放射功能障碍，导致口（和眼睛）干燥，也表示为SICCA综合征。为了评估adv递送是否诱导受影响的腺体中的外胚层功能障碍，我们每只小鼠装箱108 PFU adv在一个潜水腺和对侧腺体中的车辆控制。在插管后的适当时间点，如下所述单独从每个单独的腺体测量皮甘油刺激的唾液流程 材料和方法.
唾液流动的显着和急剧下降（Fig. 7）在第1周内观察到，符合弥漫性上皮细胞凋亡的组织学证据，最多可达第3步PC（补充图2）。令人惊讶的是，在第2周和3个PC时，唾液产生的显着降低仍然显着降低，其特征在于唾液腺中的淋巴细胞聚集体，其具有另外重构的缩醛和导管结构。这表明在观察到的时间内，免疫细胞浸润会诱导功能性损伤，不允许完全恢复腺体的排泄功能。
图7。
唾液流动后持续减少C57BL / 6只小鼠颌下腺的血液血液感染。柱图比较肝癌中的唾液流动在第1,2,2,200,2个PC处的副治疗和对侧腺体中。唾液流量被测量为在柳甘油刺激后10分钟/体重在10分钟/体重产生的唾液（见 材料和方法）。可以观察到AV-Chorpulation腺体中的外分功能障碍，最多可观察到3个WK PC。数据表示为平均值±SEM。 *p <在每次点，最小5只小鼠/时间点之间的adv-和车辆处理的小鼠之间0.05。
讨论
在包括SS的几种慢性炎症条件的靶器官中形成ELS，长期以来一直被认可（1–3, 7, 26–28）。 ELS形成与SS高度相关，因为唇唾液腺中的生发中心样结构是疾病严重程度增加和朝向B细胞淋巴瘤的进化的独立预测因子（6, 13）。
缺乏可靠的诱导动物模型的异位淋巴淋巴新生，这有限地了解导致唾液腺中ELS形成的机制的理解。据报道，鉴于SS响应全身或局部病毒感染的一些特征的诱导唾液腺腺炎的鼠模型。然而，为了诱导唾液腺炎，以前的工作依赖于使用完全传染性和复制自身免疫性小鼠的Sialropic病毒，例如LPR / LPR小鼠（29, 30）或复制缺陷型adv载体携带编码促炎介质（如IL-17）的基因（31）。此外，没有综合演示，即病毒诱导的唾液盂炎可以朝着官能团的形成，类似于SS（即，自身抗体的形成）对我们的知识进行了尚未提供的。
在本文中，我们呈现了一种新型模型的诱导淋巴细胞癌，在野生型C57BL / 6小鼠的潜水腺中迅速发展，响应于局部递送复制缺陷的腺病毒载体。在这种唾液腺炎模型中，免疫细胞浸润从弥漫性炎症过程朝着形成悬崖淋巴细胞聚集体的形成，进一步在3WK内进一步发展到来自病毒感染的高度组织的ELS。该方法是可再现的和同步，淋巴细胞焦点在每周2台PC中在100％的小鼠中发展，并在第3000页上发展到完全形成的ELS，其特征在于通过T / B细胞分离和FDC网络的形成〜70％的小鼠与人对应物相似的发芽中心状结构（7）。
已经提出了ELS的形成是严格调节的免疫学和分子过程系列的结果，具有促进产前生命中淋巴组织中涉及的主要途径（32）。胚胎淋巴室的发育危重依赖于VCAM-1生产的淋巴趋化因子CXCL13，CCL19和CCL21+ICAM-1+ltβr.+ 间充质“组织者”细胞响应与CD3密切相互作用−CD4+CD45+IL-7Ra+秩+ 表达TNF家族膜结合异酰基（α1β2）的淋巴“诱导剂”细胞，LTβ（32）。在淋巴趋化因子和LTβ之间建立阳性反馈环路对于促进SLOS的基质和血管结构的发展至关重要，包括HEV的分化（21）。
然而，来自ELS的转基因模型的证据已经质疑淋巴诱导细胞在成年生命中异位淋巴新发生中的淋巴诱导细胞的相关性（33）。类似地，在慢性炎症疾病期间患有ELS患者的淋巴趋化因子表达，包括SS（7–9, 11, 34），表明诱导型ELS形成中的淋巴趋化因子/LTβ途径由细胞和分子机制调节，所述细胞和分子机制不同于胚胎发育期间观察到的常规相互作用。
在这项研究中，我们表明，腹期后发出，淋巴趋化因子CXCL13，CCL19和CCL21 mRNA的早期上调在伴随完全官能的ELS的情况下伴随ELS和峰的发育。感兴趣的是，淋巴趋化因子保留其在乳糜源中观察到的离散表达模式，CXCL13限制在周围T细胞区域中的悬垂聚集体和CCL21的B细胞的富胞细胞区域。这表明唾液腺中T和B细胞亚群的渐进招募和定位患者血糖腺体中的血栓感染不是随机事件，而是紧随紧身调节的化学性梯度，并将这种诱导型els的诱导型号建立为适当的平台来解剖动态表达，来源生产，调节异位淋巴新生的关键因素的产量和等级重要性。
有趣的是，在该模型中，尽管有病毒无法复制，但在该模型中，ELS的形成总是与转基因腺体中的转基因产品3周内的持续存在。在导管上皮细胞内选择性地观察到尖锐的病毒和转基因蛋白表达，观察到与这种细胞类型无能为止，以清除病毒病原体，如啮齿动物和人唾液腺（35, 36）。这与SS相关，因为在SS发病机制中涉及几种病毒，并且类型I IFN签名是典型的疾病（37, 38）。因此，在该模型中，ELS的诱导可能导致缺乏病毒间隙，导致延长的抗原暴露，这是ELS形成的有效触发，如前所述在其他模型的异位淋巴新生诸如慢性接枝抑制的模型中（39）NOD小鼠中的自身免疫性紫外线（19）。因此，我们认为，该模型具有揭开亲密的物理病毒学病毒宿主相互作用，这些病毒宿主相互作用导致SS中的ELS形成。
重要的是，在这项工作中，我们还证明了adv诱导的els不仅重新延长了SLO的细胞和分子组织，而且通过表达辅助的辅助酶，引发IG基因的酶和IG基因的酶（40），导致内存B和血浆细胞的亲和成熟和分化（41, 42）。促进唾液腺的表达需要形成生发中心等FDC网络和GL7的els获得标志物，同样与SS患者（10）。 Naive B细胞中的辅助表达和随后的CSR可以通过细胞因子的Milieu直接诱导，其中甚至在没有B细胞受体交联的情况下，即使在没有B细胞受体交联（）的情况下也是如此43–47）。因此，在该模型中，AID转录水平与BAFF，IL-4和IL-21 mRNA的表达严格相关，表明在B细胞激活下对这些因素的功能作用。
因为在该模型中的ELS的建筑，细胞和分子特征高度让人在SS观察到的那些中，我们接下来研究了该模型中是否存在人类疾病的典型特征。 SS的两个标志是违反循环自身抗体和渐进式外分泌功能障碍的自我免疫耐受性，导致口腔/眼睛干燥（SICCA综合症）的典型迹象和症状。在第3000周，75％的Avd-cantulated小鼠对IgG Ana产生的阳性;相比之下，没有车辆控制显示自身免疫的证据。有趣的是，ANA的发作前面是由Pyknotic核和正动脉染色的存在（补充图2）所证明的上皮细胞凋亡后的上皮细胞凋亡后的快速和丰富诱导。在唾液腺中B细胞卵泡的异位形成的背景下，核材料暴露可能足以引发自身免疫。在这方面，剖析ELS是否直接参与淋巴结的自身抗体的产生，如前所述，它将是有趣的，如先前对SS患者的ELS（11, 12）。
最后，我们表明，唾塞炎和ELS的发展也伴随着外分泌功能障碍。虽然我们没有阐明该模型中乳糜茸的病理生理学，这可能是由病毒和/或免疫介导的机制引起的，但我们的观察结果将与患有患者患者的患者的指示保持局灶性唾液腺炎的外科治疗患者主要是由于函数而不是解剖学障碍（48）。
总之，我们介绍了一种新型的促进淋巴新生模型，具有揭开病毒感染，植物突发，免疫耐受性和唾液腺中外分泌功能障碍的临界相互作用，提供适当的调查平台调节ELS形成的机制及其在SS典型特征开发中的作用。
披露
作者没有财务利益冲突。
致谢
我们感谢Luigi Gnudi博士（糖尿病和代谢医学教授，代谢医学单位，心血管部门，国王学院伦敦），用于证明LaczAdv。
脚注
mB.是来自关节炎研究英国的临床医生科学家团契的受援人员（授予18237年）。 F.B.来自康威信托的临床医生科学家团契的收件人。
本文的在线版本中包含补充材料。
本文中使用的缩写：
- adv
- 腺病毒
- 援助
- 活化诱导的胞苷脱氨酶
- ANA.
- 抗核AB
- CSR.
- Class-Switch Recompination
- 埃尔斯
- 异位淋巴结结构
- HEV.
- 高内皮venule.
- LaczAdv.
- 细菌β-半乳糖苷酶编码adv
- LTβ.
- LymPhotoxinα1β2
- Lucadv.
- 萤火虫荧光素酶编码adv
- 个人电脑
- 后扫描
- 舍克
- 躯体倍壮具
- Slo.
- 次级淋巴管器官
- SS.
- Sjögren的综合征
- X-Gal.
- β-半乳糖苷酶。
- 已收到 2012年4月25日。
- 公认 2012年7月30日。
- 版权所有©2012由美国免疫医生，Inc。
