抽象的
MHC I类和II类对自适应免疫系统至关重要。虽然CIita的MHC II类表达的调节已经很久，但MHC I类反辐期的机制在很大程度上是未知的，直到最近发现NLRC5 / I类反辐期气旋器。在这项研究中，我们展示使用NLRC5. - 构成和诱导MHC I类表达所需的小鼠NLRC5需要NLRC5。 lossNLRC5.导致MHC类I和相关基因如β的表达严重降低2-microglobulin.，Tap1或LMP2，但没有影响MHC II类水平。 IFN-γ刺激无法克服I表达的受损的MHC类NLRC5. - e乐彩下载。感染histeria单核e乐彩下载, NLRC5.-Defigle小鼠显示了CD8的受损+Te乐彩下载活化，伴有增加的细菌载荷。这些发现说明了CD8在MHC I类基因调节中的NLRC5 / I类异透视器的关键角色+Te乐彩下载应答。
介绍
主要的组织相容性复合体I类和II类分子在激活自适应免疫系统的激活中发挥关键作用。 MHC I类分子呈现e乐彩下载内起源的肽AG，如肿瘤或病毒AGS至CD8+ Te乐彩下载，而MHC II类分子将e乐彩下载外源的肽AG呈递给CD4+ T cells (1）。组成型和诱导型MHC II类的表达需要母癌母转录共同诱导剂CIITA（2）。虽然CIITA本身缺乏DNA结合结构域，但CIITA可以通过接合称为MHC增强体的核蛋白复合物激活MHC II类基因的启动子（3, 4），与启动子 - 常规转录因子一起，包括三聚体调节因子X蛋白复合物，CREB /活化转录因子1家族成员和NF-Y蛋白（5, 6）。 CIITA还可以至少在体外转移MHC类I基因（7, 8），虽然秃头淋巴e乐彩下载综合征患者患有e乐彩下载质基因和CIITA缺陷小鼠的突变患者保持完整的MHC I类表达，表明还有另一种机制用于激活MHC级I在体内（2, 9–12）。
最近对MHC I类基因，NLRC5的特异性转椎动因子的发现确定了MHC基因调节剂的新增功能（13, 14）。 NLRC5和CIITA都属于NLR或核苷酸结合结构域（NBD），富含亮氨酸的重复系列蛋白质，并且系统邻彼此最密切相关（13, 15）。 NLRC5或I类异椎动酰剂（CITA）也是IFN-γ-诱导核蛋白，但NLRC5特别关联和转移MHC I类启动子，导致MHC I类和相关基因如β的表达。2-microglobulin.（β.2m），Tap1和大型多功能蛋白酶2（13, 14）。 NBD是NLRC5功能的关键结构域，因为MHC级别I基因的核导入和转移所需的NBD（16）。在核中，NLRC5参与MHC类I特异性增生，与调节因子X组分和CREB /激活转录因子1系列转录因子激活MHC I类基因启动子（17）。除了作为MHC I类反辐期气旋器的功能外，据报道，NLRC5还参与了TLR和RIG-I形受体信号传导，抗病毒响应和炎症体激活的调节（ 15, 18–21）。但是，这些报告提供了相互冲突的结果，并且他们的结论不受从初始表征获得的数据 NLRC5. - 小鼠（14, 22）。
虽然NLRC5作为MHC I类基因转移剂的鉴定是显着的，但NLRC5在体内MHC I类表达中的作用尚未得到阐明。要解决这个问题，我们调查了NLRC5的功能 NLRC5. - 小鼠。在这项研究中，我们表明MHC类I的本构和诱导型表达需要NLRC5。 NLRC5. - 更容易感染的小鼠更容易感染 李斯特菌，正如CD8受损的那样突出显示+ 感染器官的Te乐彩下载活化和增加的细菌负担，表明NLRC5 / CITA在MHC I类依赖的CD8中的关键作用+Te乐彩下载应答。
材料和方法
老鼠
NLRC.5缺乏小鼠由T.Kawai和S.Akira（大阪大学，日本大阪大学）提供（22）。野生型小鼠（F.1 从Taconic获得129SVEV和C57BL / 6小鼠的小鼠。 OT-1 TCR转基因小鼠是H. Cantor的礼物（Dana-Farber Cancer Institute，波士顿，MA）。小鼠在无理的无病原质下维持，并根据机构和国家卫生机构使用。
e乐彩下载培养和试剂
之前描述了骨髓衍生的巨噬e乐彩下载和树突e乐彩下载的产生和刺激（23
RNA分离和定量PCR
如前所述进行RNA分离和定量PCR（13）。引物序列列于补充表I中。
Western印迹分析
如前所述进行蛋白质印迹分析（13），使用以下ABS：抗H2-Kb，抗β2M（华盛顿大学T. Hansen的礼物）和抗热休克蛋白（HSP）90 AB（F-8; Santa Cruz Biotechnology）。
流动e乐彩下载术分析
如前所述进行FACS分析（13），使用以下ABS：FITC抗小鼠B220，FITC抗小鼠CD11C，联素粘蛋白抗小鼠CD4，PE / CY5抗小鼠CD8，联合粘蛋白抗小鼠F4 / 80，PE抗小鼠I-Ab/ i-ad
OT-1e乐彩下载共培养测定
MACS - 排序CD8+ 具有CD45.1背景的OT-1小鼠的Te乐彩下载是CFSE标记，并通过SiinFek1（1μm）脉冲照射脾脏B220+ 来自NLRC5的e乐彩下载+/-或nlrc5. - / - 小鼠以1:25（b：t）的比例为72小时。通过CFSE稀释度的CFSE稀释e乐彩下载的FACS分析测定OT-1 Te乐彩下载的增殖。
L.单核e乐彩下载增生 infection
L.单核e乐彩下载增生 （在加利福尼亚大学的D. Portnoy提供的D. Portnoy提供的菌株10403s）成长为中学阶段（A600，0.1）通过横向尾静脉注射到小鼠中。通过裂解物连续稀释的CFU计数测定感染小鼠的脾肾和肝脏的细菌负担。
统计分析
对使用棱镜（GraphPad）进行单向ANOVA以分析统计显着性。结果是平均值±SEM。一种 p value <0.05被认为是显着的。
结果与讨论
为了澄清NLRC5在体内MHC I类中的作用，我们分析了 NLRC5. - 小鼠。杂合子凋落物（+/-）和f1 将来自C57BL / 6×129SVEV繁殖（+ / +）的小鼠用与敲除小鼠（ - / - ）的类似混合遗传背景用作对照。可以看出 图。1A，MHC级别I（H2-Kb）胸腺，脾，肾脏和回肠中的转录物水平显着降低 NLRC5. - 与野生型或杂合小鼠相比，缩义小鼠，证实MHC I类表达确实在很大程度上依赖于NLRC5。 MHC类I相关基因的表达， β2m, Tap1, Lmp2以及非分化MHC I类基因， H2-M3，胸腺和脾脏受损 NLRC5. - 小鼠（图。1B）。相比之下，NLRC5缺乏不影响MHC II类的表达（H2-Aα）和ciita（图1C.），确认NLRC5的特异性用于激活MHC I类基因。同意转录数据，MHC I类蛋白水平I（H2-K.b）和β2在脾脏和胸腺中也被降低 NLRC5. - 小鼠（图。1D）。一起携带，NLRC5是特别需要MHC类I在淋巴和非糊状器官中的表达，并且可以分配MHC II类表达。
NLRC5. is required for the constitutive expression of MHC class I in various organs. (A）MHC级别的表达（H2-Kb）在野生型小鼠的指示器官（+ / +， n = 3），或小鼠杂合（+/-， n = 4）或纯合（ - / - ， n = 3）对于目标中断 NLRC5. 通过使用基因特异性引物通过定量PCR（QPCR）分析确定的基因。误差栏代表±SEM。 （B）表达 β2m, Tap1, Lmp2， 和 H2-M3 在脾脏和胸腺 NLRC.5+ / + (n = 3）和 NLRC.5 - / - mice (n 使用指定的基因特异性引物通过QPCR分析= 3。误差栏代表±SEM。 （C） 分析 NLRC5.，MHC II级（H2-Aa）和脾e乐彩下载中的CIITA基因表达，如QPCR测定。 n = 3.误差栏代表±SEM。 ns，不重要。 （D）MHC I类I的Western印迹分析（H2-K.b）和β2M与指定基因型的脾脏和胸腺中的蛋白表达。 HSP90的表达显示为负载控制。 *p < 0.05, **p <0.01; ns，不重要。
随着我们观察到胸腺和脾脏中MHC I类水平的减少，我们进一步通过流式e乐彩下载术研究了在这些器官中的e乐彩下载类型的MHC类I表达。 CD4中严重降低了MHC I类（H2-D，-K，-L）的表面表达+ 和 CD8+ 脾脏，胸腺和淋巴结中的Te乐彩下载 NLRC5. - 小鼠（图2A-C）。此外，MHC类I表达减少了 NLRC5. - 来自脾脏，淋巴结，腹膜腔，脾f4 / 80的乙型e乐彩下载+ 巨噬e乐彩下载和CD11C+ 树突状e乐彩下载，虽然它们在其表面上保留了显着水平的MHC I类（图2A-C，补充图1A）。此外，骨髓衍生的巨噬e乐彩下载和树突状e乐彩下载中MHC类I的转录物水平显着降低（补充图1B），表明NLRC5对于巨噬e乐彩下载和树突e乐彩下载中MHC I类基因的诱导是重要的，无论是组织源或骨髓衍生。有趣的是，MHC类I在这些骨髓衍生e乐彩下载上的表面表达在很大程度上不受影响（补充图1A），表明似乎是拯救培养e乐彩下载中的MHC级缺乏的补偿后术语机制。这些发现表明NLRC5在MHC I类基因表达的调节中发挥着重要作用，尽管MHC I类表达中NLRC5的要求的程度在不同的e乐彩下载类型之间变化。
减少MHC类I表达各种e乐彩下载类型 NLRC5. - 小鼠。脾脏的单e乐彩下载悬浮液（A, 左侧面板; D），胸腺（B, 左侧面板）和淋巴结（C, 左侧面板） 从 NLRC5.+/- （灰线）和 NLRC5. - / - （黑线）通过流式e乐彩下载术进行分析小鼠，用于表达MHC等级I [H2-K / D / L，IN（a），（b）和（c）， 左侧面板]或MHC II类（D）分子（I-Ab/ i-ad），在CD8上门控+, CD4+, B220+，f4 / 80+，或cd11c+ e乐彩下载。阴影区域表示同学控制。数据代表两个独立实验。条形图（a–C， 右侧面板）呈现相应平均荧光强度的平均值和SEM（n 每个基因型= 3）。 *p < 0.05, **p < 0.01.
我们之前已经证明了NLRC5对于IFN-γ刺激的MHC I类基因表达需要NLRC5（13）。因此，我们检查了影响的影响 NLRC5. 通过刺激脾e乐彩下载的IFN-γ-诱导MHC I类表达的缺乏 NLRC5. - 用IFN-γ的小鼠。如前所述（13, 15, 20, 21），IFN-γ处理导致上调 NLRC5. 与MHC I类基因的诱导相关的转录物（H2-K.b）野生型和杂合脾e乐彩下载中的表达（图3A）（13）。在 NLRC5.然而，与在控制中观察到的MHC等级的水平相比，IFN-γ刺激无法拯救MHC类表达的损伤图3A）。 β2M表达也仅部分救出（图3A）。相反，统计数据的上调，其在NLRC5独立的方式中由IFN-γ刺激诱导（13），在三种基因型中相当，表明IFN-γ受体的下游的JAK /统计信号传导级联完好无损 NLRC5. - e乐彩下载。有趣的是，有一个小而明显，诱导MHC类I表达 NLRC5. - 在IFN-γ刺激的脾e乐彩下载上，支持存在MHC I类表达的NLRC5独立机制（图3A）。同意与转录数据，IFN-γ刺激没有恢复MHC I类的表达（H2-Kb）和β2m在蛋白质水平 NLRC5. - 乙纤维e乐彩下载和胸腺e乐彩下载（图3B.）。此外，流式e乐彩下载术分析表明，IFN-γ刺激并未拯救CD4中的降低的MHC I类表面表达+, CD8+ Te乐彩下载，Be乐彩下载，F4 / 80+ 巨噬e乐彩下载和CD11C+ 从脾脏获得的树突e乐彩下载 NLRC5. - 小鼠（图3C.）。
IFN-γ.刺激不会拯救观察到的IS表达的减少的MHC等级 NLRC5. - 小鼠。 （A）来自的脾e乐彩下载 NLRC.5+ / +, NLRC.5+/-， 和 NLRC.5 - / - mice (n = 3 for each genotype) were stimulated for 18 h with IFN-γ（100U / ml），使用指定的基因特异性引物通过QPCR分析转录水平。误差栏代表±SEM. (B）MHC级I（H2-Kb）和β2M蛋白在脾e乐彩下载中的蛋白质表达和来自小鼠的纤维素e乐彩下载，具有指定的基因型。用IFN-γ制备18小时后刺激并通过Western印迹分析e乐彩下载提取物。 HSP90级别被描绘为加载控制。 （C）来自的脾e乐彩下载 NLRC.5+ / +, NLRC.5+/-， 和 NLRC.5 - / - mice (n 在IFN-γ存在下培养过夜，并通过流式e乐彩下载仪进行培养过夜，用于表达MHC I类分子（H2-K / D / L），在CD8上进行+, CD4+, B220+，f4 / 80+和CD11c.+ e乐彩下载。条形图代表相应平均荧光强度（MFI）的平均值和SEM。 *p < 0.05, **p <0.01; ns，不重要。
为了解决由NLRC5缺乏症引起的损失的MHC类I表达是否对免疫应答产生影响，OT-1 CD8+ 用肽加载的Be乐彩下载与Te乐彩下载共培养。 ot-1 te乐彩下载培养 NLRC5.-DefigleS Be乐彩下载显示出损害的增殖，表明NLRC5确实需要CD8的AG特异性刺激所需的+ T cells (图4A）。通过使用e乐彩下载内细菌的感染研究进一步研究了NLRC5在MHC类I介导的免疫应答中的作用， L.单核e乐彩下载增生，因为CD8+ Te乐彩下载反应对于对这种细菌的宿主防御至关重要。虽然 李steria. 感染明显诱导特定的CD8+ 在野生型小鼠的脾脏和肝脏中的Te乐彩下载活化，如因杀死细菌的离体刺激后的IFN-γ阳性e乐彩下载数量增加（图4B.，补充图1c），在 NLRC5. - 缩义小鼠，特定的CD8+ Te乐彩下载活化受损，并且小鼠患有脾脏和肝脏中的细菌数增加（图4B., 4C）。这 李steria.-Uscuctible的表型与先前提出的NLRC5作为TLR抑制剂的功能矛盾，如这种情况 NLRC5. - 应更受保护的小鼠，而不是更容易感染。的确， NLRC5. - 在LPS，CpG oligo和Poly（IC）刺激后，巨噬e乐彩下载在转录物和蛋白质水平上表达了IL-6，TNF-α，IL-12P40和IL-1β的正常水平，确认了在前一次的观察结果使用 NLRC5. - 缩义小鼠（补充图1d，1e）（22）。这些数据共同证明了NLRC5 / CITA在体内MHC I型介导的免疫反应中的关键作用。
NLRC5. is required for MHC class I-mediated immune responses. (A) NLRC5.-Defitie Be乐彩下载显示CD8的特异性刺激受损+ Te乐彩下载。 CFSE标记的OT-1（CD45.1）CD8+ 用SiinFek1（1μm）叠种B220与e乐彩下载共同化+ 脾e乐彩下载来自 NLRC5.+/- 或者 NLRC5. - / - 小鼠以1:25（b：t）的比例为72小时。通过CFSE稀释的流式e乐彩下载术分析测定CD45.1门控e乐彩下载的增殖。数据代表两个独立实验 （n = 3). (B) NLRC5.+ / +, NLRC5.+/-， 或者 NLRC5. - / - 小鼠感染了 L.单核e乐彩下载增生 (1 × 104 CFU）。脾e乐彩下载和肝脏白e乐彩下载被隔绝 NLRC.5+ / + 和 NLRC5. - / - 在第6天的小鼠用热杀死培养 L.单核e乐彩下载增生 16小时并通过流式e乐彩下载术分析IFN-γ对CD8的表达+ e乐彩下载。数字表示e乐彩下载的百分比。数据代表两个独立实验 （n = 3）。条形图（B， 右侧面板）呈现CD8百分比的平均值和SEM+ IFN-γ+ cells (n 每个基因型= 3）。 （C）脾脏和肝脏中的细菌负荷 L.单核e乐彩下载增生-已感染 NLRC5.+ / +, NLRC5.+/-， 或者 NLRC5. - / - 确定小鼠。数据代表两个独立实验; *p < 0.05, **p < 0.01.
除了我们以前的研究，我们使用人淋巴和上皮e乐彩下载系（13），目前的研究迫使地证明了NLRC5在体内中的构成和诱导MHC类I表达中NLRC5的关键作用 NLRC5. - 小鼠。此外，我们表明CD8需要NLRC5+ Te乐彩下载以特定的方式反应。加载Ag肽 NLRC5.-DefieBe乐彩下载未能有效激活OT-1 Te乐彩下载。令人惊讶的是，我们的 李steria. 感染研究表明CD8+ 从中获得的Te乐彩下载 NLRC5. - 缺乏小鼠显示出特异性的Ag特异性活化，小鼠在脾脏和肝脏中增加了细菌载荷。因此，我们得出结论，NLRC5在体内MHC I型介导的免疫应答中发挥着关键作用。本研究还揭示了MHC类I基因表达中NLRC5的要求在不同的e乐彩下载类型之间变化。 CD4中的减少的MHC I类表型最为突出 + 和 CD8+ Te乐彩下载和Be乐彩下载突出突出（图2A-C）。此外，巨噬e乐彩下载和树突状e乐彩下载保留残留的MHC I类表达（图2A）。这可能表明，存在替代，NLRC5独立机制的MHC I类转移。有趣的是，在CIita缺陷小鼠中报道了MHC II类基因的类似残余表达; CIita缺陷的树突e乐彩下载保留了MHC II类表达，尽管表达水平显着降低（12）。这些观察结果表明，尽管NLRC5 / CITA和CIITA对于MHC I类和II类的表达至关重要，但APC可能具有替代机制，以确保AGS对Te乐彩下载的有效呈递。总之，我们展示了NLRC5 / CITA在MHC I类表达和CD8中的关键作用+ 体内的Te乐彩下载反应。进一步分析 NLRC5. - 缺乏小鼠肯定会延长我们对MHC I类生物学的理解，因此，可以改善传染病领域的治疗干预措施，移植和癌症免疫疗法。
披露
作者没有财务利益冲突。
致谢
我们感谢Drs。 Peter Cresswell和Ted Hansen为提供试剂和Yuen-Joyce Liu和Amy Li，用于批判性校对手稿。
脚注
该工作得到了国家卫生研究院和克罗恩和结肠炎基金会的补助金。 K.S.K.是癌症研究所和克劳迪娅亚当斯巴尔奖的调查员奖的受援人士。 T.B.M.一直是欧洲分子生物学组织长期奖学金的受援人员，以及A.B.是克罗恩角质炎基金会的受援子奖学金。
本文的在线版本中包含补充材料。
本文中使用的缩写：
- Cita.
- I类反透视器
- HSP.
- 热休克蛋白
- β2m
- β2-microglobulin.
- NBD.
- 核苷酸结合结构域
- QPCR.
- 定量PCR。
- 已收到 2012年1月10日。
- 公认 2012年5月16日。
- 版权所有©2012由美国免疫医生，Inc。
