肺部CCL18招募人体调节性T细胞

Cécile.Chenivesse.; 莹昌; imane azzaoui; 萨莉哈AIT雅利亚; 奥利维尔 Morales.; 罗雀Plé.; arnaud. Foussat; André-伯纳德Tonnel; 纳迪拉 Delhem.; 汉斯yssel.; 韩沃恩斯; Benoit. Wallaert.; 安妮Tsicopoulos.

doi:10.4049 / Jimmunol.1003616

抽象的

CCL18既是组成型表达的，也是一种诱导性趋化因子，其在炎症反应中的作用是众所周知的。本研究的目的是评估CCL18是否具有吸引人体T细胞的能力（调节T细胞[Treg]）。在不同类型的Treg上进行的趋化性测定结果显示CD4⁺CD25⁺CD127^低的细胞，但是T调节型1型克隆和Treg在体外与抗CD3 / CD46mab分化，通过CCl18以剂量依赖性方式募集。 CCL18招聘内存CD4⁺T细胞富含CD25^高的，CD25⁺CD127^低的，潜伏期相关的肽/ TGF-β1，以及CCR4表达T细胞，而Foxp3则没有富集⁺与对照相比细胞。刺激的CCL18募集内存T细胞产生的调节细胞因子IL-10和TGF-β1的量显着增加，以及IL-4，但不是IFN-γ和IL-17。细胞表面CCL18结合主要在IL-10上发现⁺（26.3±5.8％）和几个潜伏期相关的肽/ TGF-β1⁺（18.1±1.9％）和IL-4⁺（14.5±2.9％）内存T细胞。在接枝人体皮肤的SCID小鼠体内模型中并用自体PBMC重构，CCL18的皮内注射导致CD4的皮肤募集⁺，CD25⁺，和il-10⁺细胞，但不是foxp3⁺细胞。此外，CCL18募集的内存T细胞抑制CD4的增殖⁺CD25⁻效应T细胞通过IL-10依赖性机制。这些数据表明，CCL18可以通过将记忆Tregs吸引到组织中，特别是在肺中，有助于维持耐受性和/或抑制有害炎症，其中高度和组成思考。

介绍

已经描述了两个调节T细胞（Tregs）的主要子集，天然和适应性/诱导的Tregs，其发展，AG特异性和行动机制不同。自然Tregs的表型特征包括转录因子Foxp3的表达（1）和IL-2RαCD25的组成型表达（2）和T细胞活化相关的细胞表面标记CTLA-4（3）。据报道，自然Tregs的抑制功能需要体外细胞 - 细胞接触或接近度，而自然Tregs的体内功能取决于IL-10和TGF-β的分泌（4, 5）。自适应Tregs包括Foxp3⁺ 发育细胞脱近，与自然的Tregs共享大多数表型和功能特征（ 6），以及Foxp3⁻ 似乎主要借助于分泌细胞因子，例如IL-10或TGF-β的细胞，最好的表征是T调节型（TR1）细胞（7）。特定趋化因子受体通过Tregs的表达与将它们迁移到组织中的控制相关，并且可以反映定位到不同组织环境的Treg子集之间的功能异质性（8）。据报道，一些趋化因子受体优先于新鲜分离的休息人特征上表达，例如CCR4和CCR8（9–12）;然而，人为Tregs的归巢特性仍然很差。

趋化因子CCL18显示炎性趋化因子的特征特征。它的生产是由传染病诱导的（13）和过敏原（14），并且还由炎性细胞因子调节，即通过IL-4和IL-13体外上调并通过IFN-γ下调（15）。此外，CCL18吸引了涉及过敏免疫反应的Th2细胞和嗜碱性粒细胞（14, 15）。在体内，CCL18已被证明在皮肤，肺和关节的许多炎症病症中过度表达（16）。迄今为止，难以评估CCL18功能，因为尚未识别CCL18受体，并且没有这种趋化因子的鼠壁球（17）。然而，自发现以来，该想法已经出现了CCL18可能涉及稳态和免疫耐受性。实际上，据报道，CCL18在体外的APC体组成型，特别是单核细胞/巨噬细胞（18），以及体内肺巨噬细胞和淋巴结树突细胞（19）。此外，APCs的表达由抑制细胞因子IL-10上调（15）。此外，CCL18吸引了天真的CD4⁺ T lymphocytes (20）和未成熟的单核细胞衍生的树突细胞（21），这可能导致耐受性免疫应答的发展。此外，最近已显示CCL18将效应存储器T细胞转化为Tregs（22），以及诱导耐受性树突细胞（23）。由于趋化因子的主要功能包括激活细胞迁移，所以我们假设CCL18可以诱导Tregs的迁移。我们在本文中展示了CCL18能够吸引特定的CD25子集 ⁺CD127^低的和 Foxp3⁻ 通过生产IL-10发挥其监管职能的Tregs。

材料和方法

孤立记忆和天真CD4⁺ T cells and culture

EtablissementFrançaisdu Sang提供的静脉血从36个健康的受试者获得。通过密度离心在Ficoll / Hypaque（Pharmacia，Uppsala，瑞典）中，从静脉血液中分离出PBMC。人类CD4⁺ 和 CD4⁺CD45RO⁺ 通过使用CD4对MACS柱的阴性选择将T细胞与PBMC分离⁺ 和 memory CD4⁺ T细胞隔离套件（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国），纯度为96-98％。在某些控制实验中，天真的CD4⁺CD45RA⁺ 使用Naive CD4通过阴性选择纯化T细胞⁺ T细胞隔离套件II（Miltenyi Biotech）具有纯度>95%.

纯化后，记忆或幼稚CD4⁺ T cells (10⁶ 将细胞/ ml）在RPMI 1640培养基中保持过夜，补充有2mmol / L谷氨酰胺，100IU / mL青霉素，100mg / ml链霉素和10％FCS。

T细胞亚群的流式细胞术分选

CD4⁺CD45RO⁺ or CD4⁺CD45RA⁺ 通过磁分离（Miltenyi Biotec）从PBMC纯化T细胞。用抗CD4-FITC（BD Pharmingen）和抗CD25-PE（BD Pharmingen）或抗CCR4-PE（BD Pharmingen）染色细胞，并用CD127-联合粘蛋白（BD Pharmingen）在冰上30分钟，洗涤PBS / 2％BSA，过滤，然后通过流式细胞术分类（Facsaria; BD Biosciences，San Jose，CA）。 CD4.⁺CD25⁻, CD4⁺CD25^高的, CD4⁺CCR4⁺, CD4⁺CCR4⁻和CD4.⁺CD25⁺CD127^低的 T cell purity was >96%.

产生抗CD3 / CD46 Tregs和Tr1克隆培养物

纯化的CD4.⁺ 刺激T细胞（2×10⁵ 细胞/孔）用10μg/ ml涂覆的抗CD3 mAb（OKT3）和5μg/ ml抗CD46 mAb（C. kemper博士，英国博士，英国的佳肴），平底微纤维板块（BD，Franklin Lakes，NJ），并在补充有2mmol / L谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中培养，100IU / ml青霉素，100μg/ ml链霉素，10％FCS和10ng / mL重组人IL- 2（TEBU，Le Perray en Yvelines，法国）3天并评估趋化性测定。使用了两个人TR1克隆的来源。首先是从皮肤延迟型超敏反应中产生的，在初始致敏之后在健康的人类志愿者中诱导，随后用2,4-硝基氯苯诱导，如前所述（24）。第二个是从克罗恩病患者的PBMC生成的ova特异性克隆，在X-Vivo15和Cytokine-Chiched的天然卵巢存在下培养果蝇如前所述的饲养细胞上清液（25）。

趋化性和Transwell迁移

收获不同的T细胞群并悬浮在10的浓度⁶ RPMI 1640中的细胞/ mL。如前所述进行趋化方案（ 26）使用48孔微型速率Boyden室（Neuroprobe，Cabin John，MD），用5μm孔聚碳酸酯过滤器（核常细胞，Pleasanton，CA）。将T细胞在37℃下在5％CO中孵育2小时30分钟₂ with CCL18 (R&D Systems，明尼阿波利斯，Mn）以10的浓度⁻⁷ to 10⁻¹¹ m RPMI 1640和CXCL12（PEPROTECH，洛基山，CT）10⁻⁷ m分别用作阴性和阳性对照。每种条件都一式三份进行。通过过滤器迁移的细胞在下井中计数，结果表达为与培养基相比的趋化性指数。在一些实验中，使用对CCL18的中和AB来评估招募的特异性。中和AB（培养）将CCL18孵育30分钟（R&D Systems），并将混合物用作趋化性测定中的化学反应剂。为了恢复响应CCL18的内存T细胞，我们使用Transwell用5-μm孔聚碳酸酯过滤器（Costar，Cambridge，MA）。以2×10的浓度悬浮在RPMI 1640中的T细胞⁶ 细胞/ ml并在37℃下在5％CO中孵育2小时30分钟₂。 RPMI 1640和CXCL12用作对照。转发存储器T细胞在下部隔室中恢复，并刺激或不刺激（10⁵ 细胞/孔）用10μg/ ml涂覆的抗CD3 mAb（OKT3）和2μg/ ml可溶性抗CD28 mAb（BD Biosciences）在96孔，平底微纤维板（BD，Franklin Lakes，NJ）中。作为基线细胞，在相同的条件下也刺激了纯化的内存T细胞，而不会受到迁移。在3 d刺激后，收获培养上清液和细胞以进行进一步的实验。

细胞因子谱的定量

IL-4，IL-10，IFN-γ（双峰研究，BENANÇON，法国），IL-17和TGF-β1（R&D Systems）根据制造商的建议，通过ELISA测量细胞培养上清液。对于IL-10，IL-10和IFN-γ的IL-4，12.5pg / ml的敏感性水平为1.1pg / ml，对IL-17和TGF-β1的15.6pg / ml。结果表明非刚才内存T细胞的增加百分比。

流式细胞术表型分析

通过如前所述的标准化方案通过流式细胞仪评估与Treg相关的表型（27）。对于细胞外标记，用抗CD25-PE，抗CD127-联合粘蛋白（Bd Pharmingen）染色细胞，抗CD103-FITC（Beckman Coulter，Fullerton，Ca），抗CTLA-4-FITC，抗-ccr4-pe（两者来自 R&D Systems）和TGF-β1mAbs的生物素化的抗延迟相关肽（抗LAP）（R&D Systems）随后是链霉蛋白-PE，或LAP / TGF-β1-PE MAB用于双染色（R&D Systems）。对于细胞内染色，根据制造商的建议，用抗人Foxp3-Fitc染色组（eBioscience，San Diego）标记细胞。对于CCL18受体表达，细胞用生物素 - 缀合的CCl18（Sigma，Steinheim，Germany）标记，然后用链霉抗生物素蛋白 - 联蛋白（R&D Systems）。通过抑制其与非标记CCl18（数据未显示的数据）抑制其对幼稚T细胞的结合来证明生物素化的CCL18的特异性。作为一个控制，我们使用了一个小的m.w.衍生自的蛋白质 疟原虫疟原虫 （法国里尔博士博士的礼物。编码的基因的完整开放阅读框架 P. falciparum. TAF10 homolog (28）克隆到PGEX-6P-3（Amersham，乌普萨拉，瑞典）。根据制造商的指示（Amersham），使用预备蛋白酶和谷胱甘肽-Tepharose 4B柱从重组蛋白中除去GST。纯化 P. falciparum. TAF10经受SDS-PAGE，然后进行Coomassie蓝染色，然后使用生物素化试剂盒（Sigma）标记。对于伴随的细胞外CCL18R和细胞内细胞因子表达，在50ng / ml的PMA刺激细胞，在50ng / ml和1μg/ ml下的离子霉素刺激细胞24小时。 Brefeldin被添加到了文化的最后4小时。如前所述，将细胞染色CCL18R，根据制造商的建议使用Cytofix / Cytoperm Bd Pharmingen套件，随后使用抗IL-4-PE和抗IL-10-PE mAb（BD Biosciences）来渗透。

实时定量RT-PCR

除去上清液后，转向存储器CD4 ⁺ 将T细胞悬浮在三试剂（Ambion，奥斯汀，TX）中，并根据制造商的程序提取总RNA。使用高容量cDNA逆转录试剂盒（应用生物系统，福斯特城，加利福尼亚州）进行逆转录。使用SYBR Green PCR试剂盒（Applied Biosystems），通过实时PCR将cDNA一式三份扩增。将FoxP3 mRNA表达的量标准化为β-肌动蛋白并根据比较ΔΔCT方法计算。底漆对如下：Foxp3,5'-GaaacagcacattCCCAGAGGTTC-3'和5'-ATGGCCCAGCGGATGAG-3'; β-肌动蛋白，5'-TCCTCACCCTGAAGTACCCCA-3'和5'-AGCCACACGCAGCTCATT GT-3'。

增殖抑制测定

FACS-Sorfed CD4⁺CD25⁻ T cells (5 × 10⁴/孔）用可溶性抗CD3 mAb（10ng / ml）和抗CD28mab（10ng / ml; BD Biosciences）在96孔圆底板（Corning Costar，Corning，Ny）中的三份孔中刺激，在没有或存在CCL18招募的CD4⁺CD45RO⁺ T细胞在抑制剂/响应者比例为1：4,1：2和1：1。照射（50Gy）自体PBMC作为APC（5×10⁴/出色地）。纯化分类CD4⁺CD25^高的将T细胞用作T细胞抑制的阳性对照，中等 - 和CXCL12募集的CD4⁺CD45RO⁺ T细胞作为T细胞抑制的阴性对照。在甲基 - [甲基）后一式三份测量增殖³H]胸苷（1μCI/井; GE Healthcare，Bucks，U.K.）在过去18小时内纳入。在玻璃纤维过滤器（印刷过滤器A; Wallac，Turku，Finland）上收获培养的细胞使用收割机（Tomtec; Wallac）并在干燥后密封在样品袋中，并加入闪烁液（Beckman Coulter，Ca）。通过使用1450 Triluxβ-Counter（Wallac，Turku，Finland）进行闪烁计数并估计CPM，通过闪烁计数来检测掺入的放射性胸苷。结果表达为CD4的增殖±SEM的百分比⁺CD25⁻ 仅效应T细胞。在一些实验中，1μg/ ml中和抗IL-10（R&D Systems），1μg/ ml中和抗TGF-β（R&D Systems（或向培养物中加入1μg/ ml异型mAb。要调查接触依赖机制，我们分开了CD4⁺CD25⁻ T cells from CD4⁺CD45RO⁺ CCL18使用具有0.4μM聚碳酸酯膜（康宁）的96孔Transwell板募集的T细胞。

用人体皮肤嫁接SCID鼠的体内模型

人类捐赠者的皮肤是从胸部手术中获得的，丢弃皮肤。将皮肤保持在无菌生理盐水中，加入青霉素和链霉素，并在收获后2小时内移植到SCID小鼠上。在手术后，在肝素6周上收集来自同一供体的血液。该议定书由RégionalEtUniversitaire伦理委员会的中心核准核准（没有.96102）。所有捐助者根据赫尔辛基议定书宣言签署了知情同意书。

具有SCID（CB-17 SCID小鼠）的近亲小鼠是从最初由M. Liberman（斯坦福大学，CA）提供的繁殖对中维护在Lille的灭菌孤立州的里尔的巴斯特的繁殖对中。丢弃泄漏的小鼠（在6周后显示自发IgG生产）被丢弃。在无理体的条件下饲养小鼠。根据欧洲塔夫茨大学欧洲中心建立的动物实验的道德原则来处理动物。

如前所述进行皮肤接枝（29, 30）。简而言之，在麻醉后，通过从5厘米的剃毛剃毛后，制备6至8周龄小鼠进行接枝² 侧腹区域每侧的区域。通过去除剃剃的小鼠皮肤来制备直径为1.5厘米的两个圆形移植物床。将相同尺寸的全厚度人体皮肤移植物放置在卷绕床上。每只小鼠的两个皮肤移植物允许每只小鼠都是自己的控制。使用6-0丝缝合材料覆盖移植物，并用粘合剂伤口敷料覆盖，然后用标准绷带覆盖。移植后，将敷料材料和缝合线移除10 d。

人体皮肤移植后六周，antiasialo gm1（1/20稀释; Wako，大阪，日本）被注射I.P.中和小鼠NK活动。二十四小时后，将SCID小鼠重构I.P. 20×10⁶ 从供体血液中纯化的自体PBMC，并重新悬浮在PBS中。在该SCID小鼠模型中，使用从相同的人类供体中获得的单核细胞和皮肤样品在该SCID鼠标模型中具有重要性，因为它避免了在重构期间的同种异体反应。然后将重组人CCl18立即以2.5μg的剂量在两个皮肤移植物中注射2.5μg，其中5％Evans蓝染料（Sigma）标记注射部位。在相对的部位上，用含有当量的BSA和5％Evans Blue Dye的稀释剂注射皮肤移植物以用作对照。二十四小时后，使用圆柱形无菌冲头的evans蓝色染料标记的注射部位拍摄人体皮肤活组织检查，并切成两半。一半立即嵌入OCT化合物（Labonord，Villeneuve D'Ascq，France），在异戊烷中的卡扣冷冻，在液氮中预冷，并储存在-80℃。另外一半固定在4％多聚甲醛中，在OCT嵌入，冷冻和储存在-80℃之前在15％PBS /蔗糖中洗涤。

免疫组织化学

将冷冻罩部分（6μm）的PFA固定组织切割，风干，用铝箔包裹，并储存在-20℃下进行免疫组化。从BD Bioscience购买抗人CD45，CD25和CD4 mAb。抗人类CD45RO MAB来自达科（Glostrup，Denmark），抗人类Foxp3 mAb来自Abcam（剑桥，英国），抗人IL-4，IL-5和IL-10 mAb来自Pharmingen（圣地亚哥，加利福尼亚州）和抗人类IFN-γmab来自IBT（Hycult Biotechnology，Uden，荷兰）。快速红色（快速红色/萘酚Asmx片剂）来自Sigma（法国圣Quentin Ralkavier）。对于除抗人IL-4，IL-5和IL-10mab的所有ABS，使用改性碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶方法进行免疫化学，如前所述（26）。简而言之，将PFA固定的低温溶液部分在0.3％Triton X-100中温育20分钟，在TBS中洗涤，并在4℃下用伯泊过夜温育，并连续孵育30分钟，兔抗小鼠Ig然后单克隆碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶ABS（来自DAKO），在20％正常的人AB中稀释⁺ 血清。使用快红色开发着着色，并且使用苏木精剖去。使用相同物种的无关伯AB作为阴性对照。对于IL-4，IL-5和IL-10，通过使用改性的抗生物素蛋白复合方法进行免疫组织化学，如前所述（14）。简而言之，将PFA固定部分在0.3％Triton X-100中温育20分钟，并含有1％过氧化氢的PBS。通过使用载体实验室套件（Peterborough，U.K）淬灭内源性生物素。将部分用兔血清预孵育并用含有0.1％皂苷（Sigma）的PBS中的抗细胞因子MAb孵育过夜。将部分与ABC Vectastain Elite Kit（载体实验室）进行治疗，并通过使用二氨基苯并二氯化钴 - 镍（矢量实验室）开发的颜色。用相同物种的不相关AB取代伯AB作为阴性对照。抗人ABS没有与鼠结构的交叉反应性显示，通过免疫组织化学在人们和鼠组织之间的边界进行的活组织检查中验证的免疫组织化学。使用目镜晶格在×250放大率下以致盲的方式编码并计数载玻片。对于皮肤部分，将栅格的上边缘放置在表皮结处。对于每个样本，评估至少三个部分，从中计算三到六个田间的免疫组化。每平方毫米计数阳性细胞的绝对数。

统计分析

首先通过使用单向ANOVA测试，并且当重要性，然后是HOC多比较测试进行统计分析。对于正常分布式数据，我们使用Bonferroni的测试，而不是通常分布式数据，我们使用了Dunnett的测试。对于体内研究，使用Wilcoxon匹配对测试进行比较稀释剂和CCL18注射部位之间的差异。这 p values <将0.05被认为是统计学意义。使用GraphPad Prism 4软件（GraphPad软件，La Jolla，CA）进行统计分析。

结果

CCL18吸引人类CD4⁺CD25⁺CD127^低的 Tregs，但不是体外TR1克隆

为了探讨CCL18是否能够吸引人体Tregs，我们使用不同浓度的CCL18的不同类型的人类Tregs进行趋化性测定，从10⁻¹¹ to 10⁻⁷ m CD4对CD25的组成型表达⁺ T细胞是Treg的标记物（2），尽管该受体在活性效应器T细胞上也瞬时上调。已经显示出IL-7R CD127的低表达来区分CD4⁺CD25⁺ Tregs和活性效应CD4⁺CD25⁺ T cells (31）。因此，高度纯化的FACS排序记忆CD4⁺CD25^高的和 CD4⁺CD25⁺CD127^低的评估Tregs，以及偏振TR1型电池，即在体外抗CD3 / CD46偏振IL-10分泌Tregs（ 32）和IL-10产生的TR1克隆。对于FACS，净化内存CD45RO⁺ T细胞用于丢弃幼稚的T细胞，其被CCl18吸引但主要在淋巴器官中定位，并且因为大多数Tregs是存储器细胞。对于CD4.⁺CD25^高的和 CD4⁺CD25⁺CD127^低的 T cells, we used CD4⁺CD25⁻ 和 CD4⁺CD25⁻CD127⁺ 细胞分别为阴性对照。如图所示图。1A 和 1B，排序CD4.⁺CD25^高的和 CD4⁺CD25⁺CD127^低的细胞依赖于响应于CCL18依赖于CCL18的效果10⁻⁷ 和 10⁻⁸ m，而控制细胞没有。通过与最低剂量的CCL18进行比较进行统计分析，以证明剂量依赖性效果，这是趋化性的趋化性特征，而不是趋化因子因子。相反，在体外分化的Tregs不会被CCl18吸引，在24或48小时的分化（图1C.）。为了评估CCL18对体内分化的TR1细胞的影响，在趋化性测定中评估来自皮肤和PBMC的T克隆。类似地，CCL18在静止状态或抗CD3 / CD28刺激（数据未显示）之后，CCL18没有吸引这些细胞。已经表明，趋化因子受体CCR4和CCR8在人体TH2细胞和Tregs（9–12）。鉴于与CCL18功能的相似性，对排序的内存CD4的迁移⁺CCR4⁺ 评估响应CCL18的细胞。如图所示图。1D, CD4⁺CCR4⁺ T细胞依赖于CCL18吸引的剂量，最大效果为10⁻⁷ M.我们无法评估CD4的吸引力⁺CCR8⁺ CCL18的细胞由于缺乏所有商业上可获得的抗CCR8 ABS的特异性，这在不允许细胞分选，至少在我们手中。检查CD4的特异性⁺CD25^高的 T细胞募集，我们在趋化性测定之前将CCL18孵育CCL18对抗CCL18。如图所示图1E.，完全抑制CD4⁺CD25^高的获得T细胞迁移。最后，因为幼稚T细胞是CCL18和CD25的靶标⁺ 野生T细胞已被证明表现为Tregs（33），我们还评估了流式细胞仪的募集分类了CD45RA⁺CD25⁺ versus CD45RA⁺CD25⁻ T细胞。如图所示图。1F.，通过CCL18没有差异征集这两个小区子集。总的来说，这些发现表明CCL18吸引了CCR4表达的记忆T细胞和高度纯化的CD4⁺CD25⁺CD127^低的记忆Treg，但它不会影响TR1克隆。

图1。

CCL18在不同CD4上的趋化作用⁺ Treg亚群。（A）流式细胞仪分选存储器CD4⁺CD25^高的与CD4相比T细胞⁺CD25⁻ T cells. (B）流式细胞仪分选存储器CD4⁺CD25⁺CD127^低的与CD4相比T细胞⁺CD25⁻CD127⁺ cells, (C）在24至48小时后体外分化的抗CD3 / CD46 Tregs，和（D）流式细胞仪分选存储器CD4⁺CCR4⁺ 细胞与CD4相比⁺CCR4⁻ cells. (ECCL18的趋化效果用中和AB对抗CCl18或流式细胞仪上的同种型对照分选储存CD4⁺CD25^高的 T cells. (F）流式细胞仪分选Naive CD4⁺CD25⁺ 与CD4相比T细胞⁺CD25⁻T细胞。使用Boyden室进行趋化性测定，用不同剂量的CCL18，RPMI 1640培养基为阴性对照和CXCL12作为阳性对照。结果表达为与培养基相关的趋化性指数± SEM of n = 6-7实验。中等趋化指数显示为每条图中1的水平线。 *p < 0.05, **p < 0.01.

人类记忆CD4⁺ 通过CCL18吸引的T细胞体外显示出一些表型特征，而不表达FOXP3

为了评估CCL18是否能够在竞争性T细胞环境中优先募集Tregs，我们通过评估由CCl18在非选择性记忆T细胞中吸引的T细胞的表型进行了实验。为此目的，CD4⁺CD45RO⁺ 通过磁性电池分离分离T细胞，并响应于10，允许在Transwell系统中迁移⁻¹¹, 10⁻⁹和10.⁻⁷ M CCL18或控制（中等和CXCL12使用10⁻⁷ m）。 2小时后30分钟，从下部隔室收获细胞。我们获得了中度但重要性，依赖于记忆CD4的趋化性⁺ CCL18的T细胞（CCL18 10增加43.2±5.7％⁻⁷ 米与中等， p <0.001），这对CXCL12更重要（226±44％增加;数据未显示），确认先前描述的结果（20）。在通过流式细胞术中表型表型之前，使收获的细胞恢复24小时。作为基线，使用在相同条件下保持的内存T细胞，但不允许迁移。尽管Treg没有明确的特异性细胞表面标志物，但已经显示了一些标记优先于人的Treg上表达，特别是CD25^高的 (34），CD25⁺CD127^低的 (31），LAP / TGF-β1（35），CD103（αeβ7整合蛋白）（36）和ctla-4（37）。如图所示图2A，在记忆CD4中⁺ CCL18招募的T细胞10⁻⁷ 和 10⁻⁹ m与迁移前的基线水平相比，表达CD25的细胞百分比小但显着增加^高的（分别为5.35±1.1和4.69±0.86％，分别为3.91±0.63％），CD25⁺CD127^低的（6.9±1.7和5.67±0.56％，与4.73±0.9％）或LAP / TGF-β1（6.34±1.9和5.88±1.37％，对应于这两个第一个人口和100的富集〜30％％对于后者。内存T细胞均由中等或CXCL12招募10⁻⁷ M没有富集这些人群。相比之下，表面标志物CD103和CTLA-4没有差异表达（图。2B）。虽然CD4的数量没有增加⁺CCR4⁺ T细胞（数据未显示），我们观察到CCL18募集的细胞群中的CCR4平均荧光强度（MFI）的强烈上调，表明CCL4强烈表达CCR4的T细胞（104.4±182.3MFI，10⁻⁹ m与基线相比; 214.1±62.4 MFI; 图。2B）。作为Treg的另一种读数，通过细胞内染色评估T细胞转录因子Foxp3。但是，CD4的百分比没有增加⁺CD25⁺Foxp3⁺ 细胞，独立于测定中使用的趋化因子（图2C.）。为了确认这些数据，我们通过定量RT-PCR评估FOXP3的mRNA表达。与蛋白质水平的结果类似，在CCl18募集细胞中没有增加FoxP3 mRNA（未显示数据）。虽然推定的CCL18R的性质尚不清楚，但我们在记忆CD4上通过流式细胞术检查其表达⁺CD25⁺ 使用生物素化配体的细胞。只有一些内存CD4⁺CD25⁻ T细胞结合CCL18（4.28±0.72％），而CCL18结合细胞的百分比在CD4中加倍⁺CD25⁺ 细胞（8.25±1.4％; 图2D）。因此，CCL18招募了内存CD4⁺ T细胞显示Treg的一些特征，即CD25的高表达，CD127的低表达，LAP / TGF-β1的一些表达，但无表达Foxp3。

图2。

记忆CD4的表型⁺ 来自CCL18招募的健康受试者的T细胞。外围内存CD4⁺ 允许T细胞在培养基中迁移到培养基中，CXCl12或CCl18迁移2小时。回收的细胞静置过夜，并染色以表达表面分子CD25，CD127，LAP / TGF-β1，CD103，CTLA-4和CCR4，以及用于细胞内表达FOXP3。结果表示为（A）阳性细胞±SEM的平均百分比 n = 9–11 subjects, (B）MFI±SEM for n = 7-11科目，（C）阳性细胞±SEM的平均百分比 n = 9 subjects. (D）CCL18在纯化的记忆CD4上的细胞表面结合⁺CD25⁺ cells versus CD4⁺CD25⁻T细胞。结果表达为阳性细胞的平均百分比± SEM for n = 6 subjects. *p <0.05与媒介相比， ^#p <0.05与基线非迁移细胞相比。

人类记忆CD4⁺ CCL18在体外吸引的T细胞在激活后产生IL-10和TGF-β1

为了评估CCL18募集的内存T细胞的偏振曲线，我们检查了它们的细胞因子产生。使用前面描述的相同的Transwell系统，我们刺激了用抗CD3 / CD28 ABS的回收的细胞3d，收获上清液并分析用于产生IL-4，IFN-γ，IL-10，TGF-β1，和ELISA的IL-17。作为基线，使用在相同条件下刺激但不迁移的内存T细胞。与该基线相比，响应于培养基募集的记忆T细胞通常仅在其细胞因子产生的增加50％，表明迁移非特异性地活化这些细胞（Fig. 3）。与培养基相比，CXCL12募集的细胞表现出IL-4，IL-10和IL-17的产量增加，这与CXCL12对不同T细胞亚群的普遍趋化学效应一致。相反，响应于CCL18募集的内存T细胞显示出在CCL18最高浓度的IL-10和TGF-β1的产生显着增加（169.2±75.1和122±27.4％）。 IL-4生产细胞也在10时更容易被CCL18吸引⁻⁹ M浓度（增加161.9±44.4％），但在较小程度上比CXCl12（增加284.9±76.9％），而IFN-γ-和IL-17产生细胞没有观察到显着差异。为了评价IL-10-和IL-4产生细胞中表达CCL18R的细胞的比例，对基线记忆CD4进行双重免疫染色⁺ T细胞用PMA和离子霉素刺激，并通过流式细胞术评估。在非刺激记忆T细胞上也对细胞表面CCL18R和LAP / TGF-β1进行双免疫染色。 CCL18R的平均百分比⁺ IL-4的细胞为14.5±2.9％⁺ IL-10中的细胞，26.3±5.8％⁺ l / TGF-β1中的细胞，18.1±1.9％⁺ 细胞在5-9个受试者中（数据未显示）。这些数据表明，除了已知的TH2细胞的化学处理（14），CCL18还招募能够产生免疫抑制细胞因子的细胞。

图3。

内存CD4的细胞因子剖面⁺ CCL18在体外募集的T细胞。外围内存CD4⁺ T cells were allowed to migrate in a transwell system against culture medium, CXCL12, or CCL18 for 2 h 30 min. Recovered cells were rested overnight and stimulated for 3 d. The production level of IL-10, TGF-β1, IL-4, IFN-γ，并通过ELISA评估IL-17。结果表示为平均百分比增加± SEM as compared with stimulated baseline cells for n = 8–12 subjects. *p < 0.05, **p <0.01与培养基相比。

人类CD4⁺ CCL18在体内表达CD25中吸引的T细胞，但不是FOXP3，并产生IL-10

确认CCL18招募CD4的表型⁺ 在体内的T细胞，我们使用了由人体皮肤接枝的SCID小鼠模型中的人源化模型，并用自体单核细胞重构。 CCL18以及其稀释剂注入皮肤移植物中，并在24小时后进行活组织检查并通过免疫组化分析。首先，与对照稀释剂相比，评估通过注射CCL18产生的细胞渗透。 CCL18招募的T细胞包括记忆（CD45ro⁺, p < 0.01; 图4A）和CD4.⁺ T cells, whereas CD8⁺ 未找到T细胞（数据未显示）。与体外发现一致，CCL18注射移植物中的CD25标记上调（p <0.02），而没有Foxp3⁺ 可以证明细胞（图4A）。接下来，我们检查了CCl18注入的移植物的细胞因子谱表达，发现IL-10的百分比升高⁺ 与稀释剂注射部位相比的细胞（p < 0.03; 图4A）。相反，对于IFN-γ没有观察到免疫染色，并且对于IL-4和IL-5观察到小的，非间意地显着增加。显着的免疫染色的实例图4B.。这些结果证实了CCL18在体内CD4中招募的能力⁺ 具有与调节功能相容的表型的T细胞。

图4。

CCL18在体内募集的人T细胞亚群和细胞因子表达细胞。在I.P之后立即将CCL18注入人体皮肤外移植物中。用自体PBMC重建SCID小鼠。在皮内CCL18或稀释剂注射后24小时回收皮肤异种移植物。（A）人体皮肤活组织检查的低温恒温器与（a）针对人类CD45RO的MAB⁺ memory T cells, CD25⁺ 和 Foxp3⁺ 细胞群，和（b）与侵入人类细胞因子。结果表示为每毫米±SEM的平均数量² (n = 8). (B）人体皮肤移植物的显微照片24小时稀释剂（a, c, e）或ccl18（b, d, f) intradermal injection immunostained with anti-CD4 Ab (a, b), anti-CD25 Ab (c, d) or anti–IL-10 AB（E，F）。箭头指出阳性细胞。原始放大倍数×250. *p < 0.05, **p < 0.01.

人类记忆CD4⁺ 通过IL-10依赖性机制抑制T细胞增殖的T细胞

为了确定CCL18募集的细胞是否是真血管调节细胞，通过评估体外CCL18招募记忆CD4的能力进行功能测定⁺ T细胞抑制效应CD4⁺CD25⁻ T细胞增殖。高度纯化的CD4⁺CD25⁺ 和 CD4⁺CD25⁻ 通过流式细胞术分类的T细胞，以及记忆CD4⁺ 在培养基存在下募集的T细胞CXCL12或CCL18在增加的比率下加入到固定数量的辐照的PBMC和自体CD4 ⁺CD25⁻ 用可溶性抗CD3和CD28 ABS刺激效应细胞。单独评估其基线增殖，中等和CXCL12募集的T细胞增殖与效应T细胞相似的程度，而CD4⁺CD25⁺ T细胞和CCL18募集的T细胞分别在其增殖响应（未示出的数据）中分别减少3-2倍。添加CD4⁺CD25⁻ 作为阴性对照的效应细胞导致T细胞增殖增加，而添加CD4⁺CD25⁺ Tregs（阳性对照）导致比例依赖性增殖（60.25％抑制为1：1）; 图5A）。添加记忆CD4⁺CD25⁻ 与阴性对照相比，培养基或CXCL12募集的T细胞没有显着抑制T细胞增殖。相比之下，添加CCL18招募的内存CD4 ⁺ T细胞显着抑制了增殖，与在1：1的比例下的42.7％抑制的阴性对照相比，以及与1：2和1：1的中等募集细胞相比（图5A）。已经显示出两种主要机制有助于Treg介导的抑制，细胞 - 细胞接触和可溶性抑制分子，例如IL-10和TGF-β（38）。研究CCL18招募记忆CD4抑制效果所涉及的机制⁺CD25⁻ T细胞，我们进行了抑制和细胞接触实验。添加阻断抗IL-10 mAb完全逆转了所有比率的响应者T细胞增殖的抑制（图5B.）。添加中和抗TGF-βMAb诱导小培养的T细胞增殖，然而，这是没有统计学意义的（图5B.）。为了探讨是否抑制效果的一部分是否取决于细胞接触，我们分离了CCL18招募的记忆CD4⁺ T cells from CD4⁺CD25⁻ 在Transwell中由0.4μm孔径膜的效应细胞。在这些条件下，CCL18招募内存CD4⁺ T细胞仍然能够抑制CD4的增殖⁺CD25⁻ 效应细胞（以1：1的比例为40.8％抑制; 图5B.）。这些数据表明CCL18新兵Tregs，反过来依次抑制CD4⁺CD25⁻ 通过IL-10-效应细胞增殖，但不是细胞接触依赖性机制。总的来说，这些研究结果表明，CCL18能够通过IL-10生产来招募Tregs，但不表达Foxp3。

图5。

CCL18募集内存CD4的抑制作用⁺ CD4增殖的T细胞⁺CD25⁻ effector cells. (A）记忆CD4.⁺ CXCL12或CCL18募集的T细胞在1：4,1：2和1：1的抑制剂/响应比中加入到自体CD4中⁺CD25⁻ 用可溶性抗CD3和抗CD28 ABS刺激的效应细胞。照射的自体PBMC用作APC。通过掺入[³H]胸苷48小时。 CD4⁺CD25⁻ 和 CD4⁺CD25⁺ 将T细胞分别用作阴性和阳性对照。结果呈现为CD4增殖的平均百分比±SEM⁺CD25⁻ cells alone. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p <0.001与阴性对照相比， ^#p <0.05与中募集细胞相比。 n =每次条件的三份孔的实验。（B）CCL18募集细胞抑制效应的机制对CD4的增殖⁺CD25⁻效应细胞。同种型，反–IL-10, or anti–TGF-β1 neutralizing Abs were added to the coculture system, and a transwell system was used to abrogate the cell contact between the suppressor and responder cells. Results are expressed as described earlier; *p < 0.05, ***p <与同种型处理的CCl18募集的内存T细胞相比0.01。 n =每个条件的三份孔的4个实验。

讨论

在这项研究中，我们首次展示了我们的知识，CCL18招募了表达CD25但不是Foxp3的特定特定的特定特征，这是通过生产IL-10的作用。迄今为止，报告了几个Treg子集，包括天然和适应性T细胞。 CD4. ⁺ 组成型表达CD25的T细胞首先被描述为赋予自耐耐受的天然特雷格。然而，IL-2Rα-Chain CD25也是由活性效应器T细胞表示的。表达高水平CD25的人T细胞，而不是表达低水平CD25的细胞，以支持Treg活性（34）。 IL-7Rα-链CD127的表达可用于帮助区分CD4⁺CD25⁺ Tregs，下调CD127（CD127^低的），来自活性效应CD4⁺CD25⁺ T细胞，其上调CD127（CD127^高的）（31）。在本研究中，CCL18诱发了综合募集高度纯化的记忆CD4⁺CD25^高的和 CD4⁺CD25⁺CD127^低的然而，当使用NONERECTED，NORNECTED，记忆T细胞时，T细胞不太突出，争论不同响应群体内的竞争。虽然CCL18募集的T细胞没有表达Foxp3，但既不在转录也不在蛋白质水平上，它们是真绒特雷格，如其抑制T细胞增殖的功能能力所示。因为趋化性体外（39）和响应于注射的趋化因子的细胞积累并不总是在体内准确地预测趋化因子功能，使用人体皮肤白细胞募集的生理环境。在体内观察到体内观察到的特定表型在人体环境中，表明它没有与体外伪影有关。转录因子Foxp3的表达是天然Treg的特征（1）通过高亲和力识别自我AGS（40, 41）。因此，这些数据表明CCL18招募的Tregs不是自然的，而是适应性的Tregs。 CCL18募集的Tregs被证明通过IL-10作用。 CD4生产IL-10⁺ T细胞已与包括Foxp3的不同小组的不同子集相关联⁻ 细胞，特别是在人类和外围诱导的自适应Tregs中。后两端的最佳特征是TR1细胞，最初被描述为天真CD4的后代⁺ T细胞在IL-10或IL-10条件的树突细胞存在下激活离体（42, 43）。 TR1细胞的特征在于通过细胞 - 接触无关的细胞因子依赖性机制丰富的IL-10产生并施加抑制，所述细胞因子依赖性机制涉及IL-10和TGF-β（7）。这些特征适用于CCL18招募的Tregs的一般性;然而，CCL18没有吸引TR1克隆或抗CD3 / CD46分化的T细胞。值得注意的是，本研究中使用的TR1克隆表达了Foxp3（25），由CCL18招募的细胞中缺少的功能。关于抗CD3 / CD46分化的T细胞，它们也被认为是与其抑制T细胞增殖的能力相关的TR1型细胞，并产生抑制细胞因子IL-10（32），以及它们诱导灭菌蛋白介导的细胞毒性的能力（44）。除了表达FOXP3的其他Treg种群中，CD69的子集⁺CD4⁺ 已经描述了T细胞以抑制T细胞增殖通过小鼠中的膜结合的TGF-β（45）。然而，与CCL18募集的Tregs相比，后一种亚population不表达CD25并且不会产生IL-10，从而排出它们之间的潜在相似性。一些CCL18募集的T细胞表达了LAP / TGF-β1的增加。先前已经在活性人和小鼠Foxp3的表面上检测到TGF-β1的潜在TGF-β1⁺ Tregs并显示转换Foxp3⁻ T cells into Foxp3⁺ Tregs (46–48）。最近，该标记已被证明是在人类中表征另一个CD4的子集⁺ Tregs没有表达Foxp3（49）。在后一项研究中，主要在CD4内发现leap / tgf-β1的细胞⁺CD25^高的虽然在低水平与CD4相比，T细胞⁺CD25^㈡和 CD4⁺CD25^低的人口。这个CD4⁺l / TGF-β1⁺Foxp3⁻ 潜水在刺激后产生的IL-10和TGF-β1，并且还在体外表现出TGF-β1和IL-10依赖性抑制活性，从而表现出类似于CCL18募集的Tregs的特征，并表明CCL18可以招募一部分这个亚居民。我们最近显示CCL18还能够从CD4生成自适应Tregs⁺CD25⁻ effector T cells (22）。与这些发现相比，需要72-96小时来产生这些细胞，其表达FOXP3并通过细胞因子和细胞 - 细胞接触依赖性机制作用。因此，CCL18具有双重，立即和延迟的活动：它迅速招募特定的Tregs子集，而它也能够诱导CD4的转换⁺CD25⁻ 效应细胞进入Tregs。

在多种组织中抑制正在进行的免疫应答需要记忆力记忆Tregs以表达各种粘附和趋化因子受体（50, 51）。 Tregs进入不同组织的适当定位对其体内活动至关重要。今天的受体结合CCL18仍然是未识别的。幼稚在淋巴结中，在组织中，淋巴结的差分定位表明，至少两种不同的受体可以介导CCL18活性。本文中提出的数据表明一些记忆Tregs表达CCL18受体，因为它们能够结合标记的CCl18并响应于该分子迁移到组织中。感兴趣的是，趋化因子受体CCR4也被Tregs表达（9–12, 52）还将T细胞引导至肺部（53）。虽然CCR4不是CCL18的受体（14, 19），它似乎在CCL18募集的细胞的细胞表面上高度表达。 Tregs上的CCR4表达在体内功能活跃。实际上，在Treg舱室中具有完全丧失CCR4的小鼠在该器官中缺乏Tregs积累的肺部的严重炎症疾病的发展经历（54）。总之，这些数据表明CCL18R和CCR4对记忆Tregs的共同表达可能有利于它们对肺部的本地化。此外，CCL18由健康的肺泡巨噬细胞和替代活化的巨噬细胞高度表达，所述巨噬细胞具有良好的巨噬细胞具有抗炎性质。最近的一项研究表明，将单核细胞的Treegs单核细胞转向可选择活化的单核细胞/巨噬细胞分泌高水平的CCL18（55）。总之，这些数据表明CCL18通过将Tregs吸引到肺部并通过促进可转移的巨噬细胞相互相互作用来发挥至关重要的作用。

然而，有证据表明CCL18也涉及过敏性疾病。我们和其他人表明，CCL18通过过敏原刺激和在许多过敏性疾病中过度表达，包括过敏性哮喘，特应性皮炎和春季角膜瘤性炎（14, 56, 57）。此外，CCL18向TH2细胞表现出趋化活性，这是过敏反应的基石（14）。在该研究中证实了这种能力，除了Treg募集之外，还吸引了Th2型细胞，如IL-4在体外产生募集细胞和CCL18至IL-4产生细胞的结合所示。虽然CCL18吸引TH2和TREGS的能力可能看起来矛盾，但不能排除差异吸引力。 CCL18介导的Th2与Treg细胞募集可能受到与不同趋化因子受体相关的竞争效果的影响，所述微观环度因子如内皮细胞内皮蛋白和糖胺聚糖，根据趋化因子浓度，或通过CCL18的同型化或杂化化或异二聚体的差异募集/或其受体。有趣的是，已经提出了这两个细胞子集从相同的细胞群导出，因为它们都过表达了许多类似的基因转录物，包括趋化因子受体CCR4和CCR8，这可能解释两个子集上的保守趋化因子受体表达（58）。因此，最近已经表明，可以将Th2存储器单元转换成能够抑制过敏性哮喘的Tregs（59）。相比之下，一些报告显示了这两个子集在过敏性炎症的遗址上的共存（60）。

CCL18受体表达在Tregs和Th2子集中的重叠可以允许它们在肺中的分层化以充当过敏性炎性病症的调节反馈机制。在基础条件下，如在我们的研究中所观察到的，CCL18募集细胞的全球效果是抑制T细胞增殖，表明这种趋化因素在健康的人体中的调节功能。

总之，本研究结果表明，CCL18激活人为Tregs的迁移。在这方面，CCL18可能会通过将Tregs吸引到组织中，尤其是在肺的主要宿主环境界面中来促进对有害炎症的耐受性和/或抑制的耐受性和/或抑制的耐受性和/或抑制。。因此，CCL18可以是具有吸引力的治疗靶标，特别是炎性肺疾病。

披露

作者没有财务利益冲突。

致谢

我们承认博士。 Claudia Kemper和Stan Tomavo善良的抗CD46 AB礼品并纯化 P. falciparum. TAF10蛋白质分别。

脚注

这项工作得到了美化倒入的La RechercheMédicale，Santelys和Agence Nationale De La Recherche Physiopathologie des Malladies Hubaines。
本文中使用的缩写：
l
潜伏期相关肽
MFI.
平均荧光强度
Tr1
T监管类型1
Treg.
监管T细胞。

已收到 2010年11月2日。
公认 2012年4月22日。

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