抽象的
朊病毒疾病是PRP积累造成的致命的神经退行性疾病SC.，正常，细胞朊病毒蛋白的异常折叠同种型。检测PRP.SC.通常依赖于免疫化学方法，这一策略因缺乏这种疾病的同种型的ABS特异性而受到阻碍。在本文中，在免疫后，我们将八种MAB举行八种MAB对朊病毒蛋白（PRP）的产生PRNP. - 用rprp幼鼠。八种mAb表现出与细胞朊病毒蛋白和PRP的明显差异结合SC.来自不同的物种以及PrP衍生的合成肽。八种MAb中的五种表现出与不连续的PRP表位的结合，所有这些都是通过添加2-ME或DTT而破坏的，这减少了PRP中的单一二硫键。一个mAb F20-29只与人类PRP反应，而F4-31 MAB束缚PRP;这K DMABS F4-31和F20-29的值为〜500 pm。在ELISA，Western印迹和组织中，通过2-ME抑制所有五个依赖性mAb对PRP的结合。一个构象依赖性MAB F4-31将基于ELISA的测试的敏感性增加在用作捕获AB时将基于ELISA的试验的敏感性增加了近500倍。发现这些新的构象依赖性mAb在组织印迹研究中特别有用，其中用2-ME处理后的低背景创造了异常高的信噪比。
累积可选择折叠的同种型（PRPSC.）正常的细胞朊病毒蛋白（PRPC）导致人类和动物的致命神经变性（1–3）。朊病毒疾病包括人类的Creutzfeldt-Jakob疾病（CJD），绵羊，慢性浪费疾病（CWD）麋鹿和鹿，牛海绵状脑病（BSE），传染性水貂脑病和猫开采海绵状病疗法。转换PRP.C into PrPSC. 导致深刻的构象变化，包括降低α-螺旋含量和分子的β-片状含量的增加（4–7）。最初，PRP.SC. 与PRP有区别C 通过其对有限蛋白水解的抵抗力。
发现PRP.SC. 随后的ABS生产ABS至蛋白质使得人类中BSE的明确鉴定成为人类（vcJD）（8, 9）。更重要的是，来自牛的脑干免疫测定，注定用于人类食品供应的脑干已经有助于减少人们对牛朊病毒朊病毒的暴露（10）。令人信服的证据积累了VCJD的消耗量受朊病毒的牛组织（11–13）;幸运的是，vcjd的案例是dwindling。值得注意的是，4例VCJD已经追溯到从后来发育vcJD的捐赠者的血液中转移血液（14, 15）。
尽管有许多尝试生产PRPSC.可以在快速免疫测定中使用的特异性ABS，没有被识别出来。这样的prp.SC.-特定的ABS将与本机PRP反应SC. 和 not with PrPC;几个免疫沉淀天然PRP的ABSSC. have been reported (16, 17）。此外，据报道，据据报告与对应于朊病毒蛋白（PRP）（PRP）（89-112）或PRP（136-158）的肽移植物的ABS选择性地结合天然PRPSC. 在朊病毒鼠标，人和仓鼠组织中（18, 19）。需要PRPSC. - 特定的ABS增加了并非所有形式的PRP的发现 SC. 耐受有限的蛋白水解。蛋白酶敏感的PRPSC. 已被识别在人类，家畜和实验室啮齿动物中。
这里，我们描述了设计用于产生构象依赖的ABS的研究。 prp-eblated（PRNP. 0/0）将FVB小鼠用重组牛或人PRP免疫。经过多次免疫，从中收获脾脏 PRNP. 0/0/ FVB小鼠，可检测血清抗PRP ABS。进行与小鼠骨髓瘤细胞的脾细胞的融合以产生杂交瘤，从中分离出生产IgG mAb的八个克隆。八种mAb中的五种表现出与不连续的PRP表位的结合，所有这些都在减少2-ME或DTT的单次二硫键时破坏。 F20-29 MAb与人类PRP表现出高艾滋病的结合 K D 〜500 pm; F4-31 MAB束缚牛PRP具有相似的亲和力。在ELISA，Western印迹和组织细胞中，通过2-Me或DTT抑制所有五个依赖性mAb对PRP的结合。发现F4-31在用作捕获AB时，将基于ELISA的试验的敏感性提高了近500倍。在组织斑纹研究中，当用2-ME处理后的低背景创造异常高信噪比时，这些新的构象依赖性mAb特别有用。
材料和方法
重组蛋白
重组牛PRP [RBOPRP（102-241）]和重组人PRP [RHUPRP（90-231），如前所述纯化，细微修饰（20, 21）。我们使用碱性磷酸酶（AP）启动子和周质细菌信号肽的PPH41分泌载体 志贺丽 毒素II。转染的细菌在2-或10 -L发酵罐中生长并在接种发酵培养基后24小时收获。通过在8M GdNHCl / 100mM DTT（pH8）中的细菌破坏细菌（pH 8）中释放重组蛋白。使用JUPITER C-4制备柱（25/250mm;现象，通过在HILOAD 26/60-CM SUPERDEX 200柱（GE Healthcare，PISCATAWAY，NJ）上纯化蛋白质在Hiload 26/60-CM超级柱（GE Healthcare，Piscataway，NJ）上纯化，然后是反相-HPLC（25/250mm;现象，托兰斯，加利福尼亚州）和线性乙腈梯度。
脑匀浆
钙（BO），人（HU），绵羊（OV），小鼠（MO），叙利亚仓鼠（SHA）和骡鹿（MD）中制备脑匀浆（10％w / v），在钙和镁中 - 免费PBS。脑组织用3个15-S笔触，用Powergen均化器（Fisher Scientific，Pittsburg，PA）均质化。通过500×的短路离心清除匀浆 g 5分钟，用上清液用于制备样品。
AB生产
六到八周岁 PRNP. 0/0 用RBOPRP（102-241）或RHUPRP（90-231）免疫雌性FVB小鼠，所述RIBI佐剂（Corixa，Hamilton，MT）制备在1mg / mL。本文中使用的氨基酸编号基于Prusiner（22）。通过S.c，将动物免疫。注射100μLAG，然后以14-D间隔进行两次加强免疫。如上所述产生杂交瘤（16），以下修改。骨髓瘤细胞P3X63AG8U.1维持在DMEM中，具有高葡萄糖和 l-Glutamine（没有丙酮酸钠）（Life Technologies;＃11965-092），补充有10％FCS（Life Technologies，Carlsbad，Ca;＃10082-147），2mM丙酮酸和青霉素/链霉素。骨髓瘤细胞（可行性>将99％的）与脾细胞（1：5比）混合，并将混合物以2000rpm离心5分钟。除去上清液，将电池沉淀温和地破坏，每10毫升1mL 50％聚乙二醇溶液8 搅拌时缓慢加入细胞。然后，将细胞混合物离心（500× g， 5分钟）。将细胞沉淀缓慢悬浮在无血清生长培养基中，并在37℃下孵育20分钟。接下来，将细胞离心（500× g5分钟），悬浮在完全生长培养基中调整至15％FCS和1mM非氨基酸，并在7％的CO中在37℃下孵育过夜2 大气层。第二天，将细胞悬浮在含有Fcs，非必要氨基酸，戊嘌呤，氨基丙酮和胸苷的新鲜生长培养基中，并立即分散超过10微孔（96孔格式）含有照射的3T3成纤维细胞。在10-21天之后，筛选培养基用于抗PRP ABS。
筛选
使用多步筛选策略：首先，进行直接结合的ELISA，然后进行双夹层（DS）解离增强的兰丹德荧光免疫乳清（Delfia），最后，使用来自各种种类的正常脑匀浆的西免疫印迹。含有在所有三个筛选步骤中测试阳性的介质的含量的杂交瘤细胞被膨胀，克隆（至少三次），如所述（23）。腹水肿瘤由I.P产生。注射〜5×106 杂交瘤细胞进入 PRNP. 0/0，SCID小鼠（MCLaughlin研究所，大瀑布，MT）和ABS通过蛋白-G亲和色谱纯化。
ELISA方法
使用直接结合的ELISA使用的RHUPRP（90-231）或RBOPRP（102-241）肽吸收到96孔微量滴定板的底部（＃3455;热敏，沃尔瑟姆，MA）上。施加上清液或其他试验溶液，并在37℃下孵育2小时。洗涤板，并加入AP缀合的抗小鼠F（AB'）2（＃31324;热化学）Ig。在最后一组洗涤后，加入底物p-硝基苯基磷酸二钠盐（PNPP）（＃N-9389; Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo），在405nm的96孔分光光度计中读取板。
Dsdelfia在筛选过程中的早期阶段使用（来自原始96孔融合培养物的培养基分析），以鉴定可能在依赖于依赖性免疫测定（CDI）中捕获试剂的ABS。欧盟标记，嵌合人小鼠（HUM）RFAB P（ 24）被用作三明治中的报告AB。荧光箱MAXISORP 96孔黑色板（＃43711;热化学）用抗FC特异性山羊抗小鼠IgG AB（＃AP127; Millipore，Billerica，MA）涂覆抗FC特异性山羊抗小鼠IgG AB（加入100μL/孔的2μg/ ml溶液在碳酸盐涂层缓冲液中（0.1米NaHCO3 [pH 8.6]）并在37℃下温育2小时。然后通过在37℃下在封闭缓冲液中孵育1小时来掩盖塑料上的反应位点（在TBST中制备的5％非耐旱性干乳[NFDM]）。除去阻断溶液，加入试验样品（杂交瘤上清液），将板在4℃下孵育过夜。吸出杂交瘤上清液，用250μL/孔再次洗涤板并在阻塞缓冲液中使用250μL/孔1：1000稀释的纯小鼠IgG（＃PP54; Chemicon International）。该第二阻断步骤对于降低背景荧光至关重要，可能是由于随后的试剂与山羊抗小鼠FC AB的任何未占用的组合位点的结合而导致。将板滗析，加入rhuprp（90-231）或rbopp（102-241）在2μg/ ml的封闭缓冲液中，并将板密封并在37℃下温育2小时。将板洗涤三次，掺入每循环1分钟浸泡，并涂抹干燥。接下来，加入200μL/孔的Eu-缀合的HUM-P，在Delfia测定缓冲液中为0.25μg/ ml（＃4002-0010; PerkinElmer，Waltham，MA），将板在37°孵育2小时C。最后，将平板用每周期1分钟浸泡洗涤七次，并加入200μL/孔介质 - 增强溶液（＃1244-105; PerkinElmer），在室温（RT）下孵育10分钟。使用Packard Discovery荧光计测量时间分辨，荧光强度。在一些情况下，当HRP缀合的HUM-P取代Eu-Cogulated Hum-p时使用DSelisa，并且通过调用谱系进行测定。使用异型特异性的AP缀合的抗小鼠IGS（Southern Biotechnology Associates，Birmingham，Al）以ELISA格式进行AB同种型分析，并使用一步横向血小鼠同种型测定（Roche）。 CDI如上所述（24）。
西方印迹
Western印迹的AGS是10％（w / v）脑匀浆，由朊病毒患病仓鼠，小鼠，人类，牛，绵羊和鹿制备。断奶SHA和CD1小鼠分别接种了50μLscrapie分离物SC237和30μL小鼠传代的岩石山实验室（RML）朊病毒。监测仓鼠和小鼠的神经系统功能障碍的迹象，并且当疾病迫在眉睫时被安乐死（25, 26）。人类样品来自患者通过组织病理学和免疫化学诊断和确认验尸。来自BSE感染牛的脑组织是从兽医实验室机构（新HAW，U.K）收到的。绵羊斯普拉皮，隔离没有。 027从美国农业部获得了与ARQ基因型的Suffolk绵羊。 CO.CORCORCORCO.CORCOR CORINS Fort Collins的野生动物研究中心收集来自动物的大脑。对于每种物种，脑组织在没有钙和氯化镁（Life Technologies）的PBS中均质化，由Powergen均化器（FISHER科学）。匀浆以500×离心 g 5分钟，用上清液用于制备样品。
经过有限的蛋白酶K（PK）消化和西免疫印迹的样品在裂解缓冲液中稀释至0.5mg / ml总蛋白质（100mM Tris，150mM NaCl，0.5％脱氧胆酸钠，0.5％Nonidet P-40）。加入pK（40μg/ mg pk /蛋白），并在37℃下孵育1小时。用2mM PMSF停止反应。将样品以100,000×离心 g 1小时。将沉淀悬浮在裂解缓冲液中并用相等体积的2×SDS样品缓冲液稀释而不还原剂。
使用15％Tris-HCl，SDS-PAGE凝胶（Bio-rad，Hercules，CA）电泳。将样品煮沸5分钟，并且将10μg（RML感染的小鼠样品为5μg）的总蛋白质施加到凝胶中。 SDS-PAGE在1毫米厚的15％聚丙烯酰胺凝胶中进行，然后在Immobilon-P转移膜（Millipore）中电动转移。在室温下，在TBST中封闭膜1小时，在TBST中具有5％NFDM。我们在1μg/ ml下用不同纯化的初级mAb开发了印迹，其次是二次AB，免疫褥疮抗小鼠IgG（Fc），过氧化物酶 - 缀合（Pierce），在TBST中稀释1：5000。 ECL检测试剂（GE Healthcare）用作底物。将印迹暴露于Amersham超胶ECL（GE Healthcare）。
免疫沉淀
蛋白质A或蛋白质G-Sepharose（100μl;＃10-1041和＃10-1242; Invitrogen，Carlsbad，Ca）在TBS的最终体积为0.5ml的最终体积中混合2μgab。蛋白A和蛋白G的pH值分别为9和7.5。在4℃下在坚固的旋转器上在粗糙的旋转器上完成将AB对琼脂糖的结合。用TBS（pH7.5）洗涤三次洗涤后，将混合物用10％BSA嵌入TBS（pH7.5）中。如前所述，AGS是用或没有PK制备的10％脑匀浆，或者没有来自未感染的小鼠，RML感染的小鼠，未感染的人或CJD病例。我们将5μl至琼脂糖/ AB混合物中加入1mL TBS（pH7.5）和0.3％甲糖基，然后在4℃下在坚固的旋转器上温育1小时。在用TBS（pH7.5）和0.25％甲糖基的三次连续洗涤后，将样品在样品缓冲液中煮沸，而不还在还原剂并通过Western印迹分析。用RFAB HUM D18-HRP AB检测小鼠样品（27）;用HUM-P-HRP检测人类样品（24）。
表位确定
合成了两种系列肽：一系列跨越跨越的BoPRP（95-241），12A的长度，具有八个残留的重叠，并且一系列跨越Huprp（88-226），10 AA的长度，具有七个残留的重叠（ Sigma-Genosys，林地，TX）（补充表I，II）。将三个赖氨酸残基加入到N-末端以改善溶解度;还将单个生物素分子加入到N-末端赖氨酸残基中。 C-Termini被淘汰。将肽溶于10％乙腈中并在10％乙醇中稀释至1mM。
在实验的当天，肽在TBST（pH7.4）中稀释200倍，得到终肽浓度为5μm。通过添加300μl/孔5％阻断缓冲液（NFDM或TBST），在室温下封闭三抗生物素蛋白涂覆的微量滴度孔（＃15501; Pierce）。滗析封闭溶液，加入50μl5μM肽溶液，将板在室温下孵育1小时。加入抗PRP ABS，将板在37℃下温育1小时。在200μl/孔TBST的三次洗涤后，加入100μL/孔HRP缀合，山羊抗小鼠IgG + A + M（＃65-6420，Invitrogen），在5％NFDM-TBST缓冲液中稀释1：2000并且将板在室温下孵育60分钟。最后，用TBST洗涤板3次，加入100μL/孔K蓝基质（新生，氯化，Mi），并用0.1N HCl停止反应。在96孔板读卡器中，在650nm中记录着色。或者，我们使用了AP标记的次级AB，并且基材是PNPP。
RFAB HUM-P AB的评价与肽的结合需要100μLA1：5000稀释的HRP缀合的抗小鼠IgG稀释的HRP缀合的抗小鼠IgG稀释剂的取代。
降低PRP的ELISA
PRP，在涂布缓冲液中以5μg/ ml（0.1米NaHCO3 [pH8.6]），与还原剂，DTT的终浓度为10mm。将混合物在96孔微量滴定板中涂覆并在4℃下温育过夜。板被洗涤;塑料上的非反应性位点在TBST缓冲液中封闭在0.25％BSA中，并在涂层孔上滴定合适的AB。该测定用AP缀合的山羊抗小鼠IgG-F（AB'）2（Thermof Shor）开发。使用的基材是PNPP。
Sandwich Cdi为人类和牛PRPSC.
本文中描述的CDI数据与RFAB HUM-P产生（24用N-（p-异硫氰酸苄基）的Eu-Chelate标记 - 二亚乙基三胺-N-n1，n2，n3，n3如所述，在室温下在pH8.5的乙酸（DTTA），如下所述（28）。使用Eu标记的MAB 3F4生成附加数据（29, 30）。
PRP的原理，开发，校准和计算SC. 描述了来自CDI数据的浓度（24, 28, 30, 31）。简而言之，将每个样品分成两类等分试样：未处理（指定天然[N]）或混合至4M GdnHCl的终浓度，并在80℃下加热5分钟（指定变性[D]）。将两个样品立即用H稀释20倍2o含蛋白酶抑制剂（5mM PMSF;抑肽酶和Leupeptin，每个4μg/ ml）。在96孔黑色聚苯乙烯板（PerkinElmer）上装载等分试样，其先前用磷酸钠缓冲液（pH7.4）中的5μg/ ml mAb rf-d18或mAb F4-31涂覆过夜并用TBS（pH7.8）封闭在室温下含有0.25％BSA（W / V）和0.1％吐温20（w / v）。将每个样品的N和D等分试样的平板在室温下温育2小时。将板用含有0.05％（v / v）吐温的TBS（pH7.8）洗涤三次，在室温下与Eu标记的RFAb Hum-p一起温育2小时，并在七个洗涤步骤中进行的增强液欧盟标签供应商（PerkinElmer）。该信号被计算在发现双波长，时间分辨的荧光计（Packard Instruments）上。作为标准，我们使用的rhuprp（23-231）在-80°C中储存在-80°C和50％（v / v）稳定（Surmodics，Eden Prairie，Mn）中。结果表示为CPM中测量的时间分辨荧光的（D-N）差异。 PRP的浓度SC. 与（D-N）值成正比成比例，并由先前公布的等式计算（24, 28, 31）。
亲和力测量
使用两种独立方法，通过ELISA和表面等离子体共振（SPR）获得F4-31和F20-29的AB - 亲和测量。
elisa。
这 K D 使用Friguet等人描述的方法通过ELISA测量溶液中的值。 （32）。数据分析与计算 K D 使用Bobrovnik修改的以下关系（33）：
(1)
(2)敖 当存在No Ag时等于测量的吸收性（100％Ab与板的粘合）， A 当存在不同浓度的RPRP（LI）时，等于测量的吸收性， k a 等于按率， k d 等于偏差。至少五个RPRP浓度，范围在0.1到50之间（×10−9 m），用于每次分析。在这些实验中使用恒定的AB（0.2μg/ ml）。将AB与溶液中的AG混合，并在室温下温育高达18小时。优化ELISA中的孵育时间（15分钟），以免在平衡下干扰AB / Ag复合物。这 K D 作为在等式1中详述的线性关系的斜率以图形方式确定值。
弹簧测量。
用Biacore 2000（GE Healthcare）仪器获得SPR测量。通过将AB耦合到芯片，最好地完成SPR中IgG的亲和力常数的测定。由于PRP的物理化学性质，我们无法在序列注射Ag溶液中再生芯片表面。因此，单循环动力学方法（34使用了使用Biacorous软件的Biacore Control软件方法分析的数据，符合Kevin Lindquist（GE Healthcare）的算法。简而言之，在最佳pH（pH 4,4.5,5和5.5分别来自Biacore Br 100349,100350,100351和100352的最佳pH（pH 4,4.5,5和5.5，将AB（10μg/ ml）偶联至CM5芯片（Biacore） ，导致〜1000个相对单元在CM5芯片上使用胺偶联化学固定在CM5芯片上，如制造商所述。
对每种测定进行三个样品循环。前两个样品循环包括注射运行缓冲液（HEPES缓冲盐水，3mM EDTA和0.005％（V / V）表面活性剂P20 [GE Healthcare]，0.05％Tween 20,0.1mg / ml BSA [pH 7.4]） ，然后注射AG解决方案。在运行缓冲液中，在1到150nm之间的5个Ag溶液，从最低到最高浓度依次注入，每次注射之间具有1分钟的稳定期。在最后一次注射后，使Ag离解30分钟。减去背景（空白样本循环数据跟踪），并使用Biaevaluation软件分析数据以生成计算的速率（k a）和离事（k d）。 K D 通过划分计算值 k d/k a.
组织布洛斯
来自TG的冷冻冠状截面（10μm）（Boprp+ / +)PRNP. 0/0/ FVB4092和TG（HUPRP，M129）PRNP. 0/0/ FVB440小鼠以及从正常的人和牛脑大鼠转移到硝酸纤维素膜上，用10％2-me（Sigma-Aldrich）过夜。在还原后，通过将膜与F20-29和F4-31（1：1000）吸收2小时进行免疫组织化学，然后用抗小鼠孵育1-H孵育AP缀合的次级AB（Promega，Madison，Wi ）。使用NBT / 5-溴-4-氯-3-吲哚基（Roche）底物进行信号。
结果
AB生产
在免疫后观察到高血清滴度 PRNP. 0/0/ fvb小鼠（35）用Rhuprp（90-231）或RBOPRP（102-241）。使用小鼠，沙，人类，牛，羊和鹿的正常脑匀浆的Western印迹分析表明 PRNP. 0/0/ FVB小鼠用PRP生产ABS反应性C （数据未显示）。在多种细胞融合实验之后，在直接结合的ELISA中获得了数百个推定的杂交瘤（在背景上以上3〜5倍被认为是阳性的）。然而，直接结合的ELISA和DSDELIFIA只有少数阳性（表I.）。
选择八种MAb（F4-31，F10-26，F20-29，F20-49，F20-80，F20-89A，F20-108A和F20-130A）进行进一步研究。使用正常对照动物的脑匀浆的Western印迹显示了一种多样化的绑定模式（表I.）。两个mabs（f4-31和f10-26）从中分离出来 PRNP. 0/0/使用RBOPRP免疫（102-241）免疫的FVB小鼠，而剩余的六种mAb是从 PRNP. 0/0/使用Rhuprp（90-231）免疫的FVB小鼠。同型分析表明，这八个ABS是具有κ1链的子类IgG1。三种mAb（F20-108A，F20-130A和F20-80）显示与PRP的结合C 在所有经过测试的所有物种（牛，人，绵羊，小鼠，仓鼠和骡鹿）。 F4-31所有但人类PRP所有C，而F20-29仅限于人类PRPC.
ab特异性
确定八种mAb与PRP的免疫反应性模式SC.，含有BSE的脑匀浆，Sporadic Creutzfeldt-Jakob疾病（SCJD），绵羊瘙痒病，小鼠刮板或叙利亚仓鼠刮板，在37°C下用PK消化1小时。使用八种mAb进行未消化和消化的样品对蛋白质印迹进行蛋白质印迹（FI.g. 1）。没有测试与CWD的MD感染的脑匀浆的AB与CWD的致簇结合。我们的数据显示出与用未感染的脑匀浆观察到的结合行为，展示了识别PRP的MABC 也涉及变性的PK抗性PRPSC. isoform (rPrPSC.），也称为PRP 27-30（FI.g. 1）。用MAb F4-31观察到与BSE感染的牛脑的最强的结合，其也能够结合PRPSC. 在瘙痒病感染的绵羊，rml感染的小鼠和sc237感染的仓鼠大脑（FI.g. 1）。 F20-29 MAb仅限于人类PRPC 在未感染的大脑中（表I.）在SCJD脑匀浆中变性人类PRP 27-30（FI.g. 1）。 F20-89a mab没有与prp结合C 在未感染的小鼠或仓鼠大脑（表I.），但它在感染的小鼠和仓鼠大脑中弱了PRP 27-30，这表明对这些PRP年的亲和力可能是低的（FI.g. 1）。
图1。
Western印迹显示八种mAb中的每一个与来自不同物种感染的脑匀浆中的PRP的结合。用BSE的牛的Obex制备样品（配对 车道 1），人类scjd（配对 车道 2），羊皮羊（配对 车道 3），鼠标感染RML朊病毒（配对 车道 4）和沙感染SC237朊病毒（配对 车道 5); samples were undigested (−）或用20次消化μG / ml PK（+）在37左右1小时°C. Brain homogenates from PrP-knockout mice are shown as controls, 泳道C.。用1μg/ mL明确的MAb和过氧化物酶标记的抗小鼠次级AB进行蛋白质印迹，然后加入化学发光基质。他们r 蛋白质片段显示在KDA中。
为了量化来自各种哺乳动物的PRP的F4-31的亲和力，使用Dsdelfia分析与RPRP的AB结合（FI.g. 2）。用重组多肽的F4-31 AB看到最常见的结合：RBOPRP（102-241），RMOPRP（89-231）和RSHAPRP（90-231）。对RoVPRP（23-231）多肽观察到大约10倍的结合，使用Rhuprp（90-231）观察到最低活性。测量的 K D F4-31 MAB与RBOPRP（102-241）在溶液，ELISA和固定的AG，分别通过SPR，分别为630μm和255μm（FI.g. 3, 表二）。每个值表示三份的三个独立测量的平均值。 ELISA和SPR的F20-29 MAb与Rhuprp（90-231）结合的解离常数分别为276μm和463μm。虽然ELISA和SPR测定的解离常数对F4-31 MAB与RBOPRP（102-241）和F20-29 MAB结合到RHUPRP（90-231），但是 K D 通过ELISA获得的RMOPRP（89-231）的F4-31 MAb结合的价值比SPR发现的高40倍（表二）。
图2。
MAB F4-31在DSDELIBIA中的rprp结合。测量CPM中的时间分辨荧光信号的结合。对每个RPRP AG测试5个浓度的MAB F4-31。
图3。
测量 K D ELISA溶液中MAB的值。 A，具有不同浓度的RBOPRP（102-241）和RMOPRP（89-230）的F4-31。 B，F20-29使用不同浓度的rhuprp（90-231）。
差动ab绑定
免疫沉淀实验，以及冷冻脑切片的免疫染色，称为组织细分，表明F4-31和F20-29 MAB与天然PRP结合C 但不是原生prpSC. (FI.g. 4A, 4B，补充图1）。 F4-31和F20-29 MAB（FI.g. 4A, 4B, 车道 1）免疫沉淀的天然PRPC 在无感染的脑匀浆中，分别由FVB小鼠和正常人体对照制备。 F4-31和F20-29 MAB（FI.g. 4A, 4B, 车道 2）分别由RML朊病毒感染的小鼠和SCJD案例制备的朊病毒感染脑匀浆中的免疫沉淀天然PRP。 F4-31也不是F20-29（FI.g. 4A, 4B, 车道 3）免疫沉淀的天然PRPSC. 在受朊病毒感染的小鼠和SCJD案例中分别制备的朊病毒感染脑匀浆。在免疫沉淀之前，将这些样品用20μg/ ml PK在37℃下用20μg/ ml PK消化，以除去PRPC 和prp的n末端SC. 形成PRP 27-30。通过免疫组织化学证实了PRP 27-30的染色（数据未显示）。
图4。
F4-31和F20-29 MAb识别本土PRPC 和 denatured PrPSC. but not native PrPSC.。免疫沉淀显示F4-31与MOPRP结合（A）和f20-29与huprp结合（B）在未感染的，控制脑匀浆（车道 1）未消化，感染的脑匀浆（车道 2）。 F4-31和F20-29 MAb没有与本机RPRP联系起来SC. 在pk消化的，感染的脑匀浆（车道 3）。基于蛋白质标准迁移的表观分子量显示在KDA中。 DSELISA数据显示RML感染的小鼠脑匀浆中F4-31至PRP的结合（C）F20-29与人SCJD脑匀浆中的PRP的结合（D）。 Samples were untreated (○），用PK消化（□），仅用gdnhcl变性（◇）或用PK消化，然后用4米gdnhcl变性（△）。将蛋白酶消化的样品与20孵育μG / ml PK在37左右1小时°在PK消化后，将变性样品与GDNHCL一起在室温下孵育15分钟。 HUM-P用作检测AB。
在ELISA研究中，F4-31在未消化的未消化，Nondenated脑均匀的RML感染的小鼠的祖先结合PRP（FI.g. 4C），但用PK消化脑样品时，信号消失了。当RML感染的脑匀浆在与PK的有限消化后用4M GDNHCL进行变性时（FI.g. 4C）或不消化，F4-31 MAB具有类似的ELISA信号。类似于免疫沉淀和组织表发现，ELISA结果表明F4-31 MAB与天然PRP结合C，变性的prp.C和变性的prpSC.，但不是原生prpSC.，在RML感染的小鼠脑匀浆中。使用具有SCJD脑匀浆的抗HupRP特异性F20-29 mAb获得可比较的发现（FI.g. 4D）。当ScJD脑匀浆在用PK的有限消化后用4米GDNHCL变性时（FI.g. 4D）或不消化，F20-29 mAb具有类似的ELISA信号。此外，F20-29结合人类PRPC 在未消化的，不确定的scjd脑匀浆（FI.g. 4D），但用PK消化脑样品时，信号消失了。
二硫键的破坏干扰AB结合
PRP含有单分子内二硫键（36）。在RBPRP（102-241）中，该二硫键位于Cys190和Cys225之间，连接α螺旋B和C.我们研究了在AB结合上还原RBOPRP（102-241）中二硫化物的效果。在不存在或存在10mM DTT的情况下，将PrP Ag吸收到微量滴定板上。然后阻断板并立即用于确定ELISA的AB结合（FI.g. 5）。虽然F20-89A和F20-49与氧化和还原的RBOPRP（102-241）的结合相似，但F20-29和F4-31 MAb不能结合还原的rhuprp（90-231）和RBOPRP（102- 241）分别（ FI.g. 5A, 5B）。将AB与氧化和降低的PRP（O / R）的比率用于八种mAb（表I.）。
图5。
MAB F20-29的结合减少（□) and nonreduced (○) rPrP(90–231) (A）和混合mabs f4-31（B），f20-89a（C）和f20-49（D) to reduced (□) and nonreduced (○) rBoPrP(102–241），由ELISA测量。将将还原的样品用10mM DTT温育过夜，4°C. E，蛋白质印迹减少（奇数通道）和未更长的（偶数通道）RBOPRP（102-241），用RFAB HUM-P探测（车道 3, 4），mab f4-31（车道 5, 6）和f10-26（车道 7, 8）。 PRP是银染成一种对照（车道 1, 2）。基于蛋白质标准迁移的表观分子量显示在KDA中。
通过电泳分析证实了这些观察结果。银染色显示，减少的RBPRP（102-241）在SDS-PAGE上迁移得比未重复的多肽（FI.g. 5E, 车道 1, 2）。 ABS F4-31，F10-26和RFAB HUM-P用于Western印迹。 rhum-p fab认可减少和未更新的rbopp（FI.g. 5E, 车道 3, 4），预期是因为其线性表位远离二硫键;因此，它不应受其减少的影响。 F4-31 MAB结合的无痕量的RBOPRP（102-241）但不减少BOPHP（FI.g. 5E, 车道 5, 6）。相反，F10-26 mAb检测到氧化和减少的BoPRP（FI.g. 5E, 车道 7, 8），反映其O / R绑定比为1.2（表I.）。 F20-29和F4-31 mAb的无法染成低化的Huprp和BoPrap，认为这两个ABS与依赖于构象的不连续表位。
进一步的证据表明，F20-29和F4-31 MAbs与依赖依赖性表位结合来自组织斑层分析（37）。冠状部分是从未感染的牛，人和Fvb，Tg的大脑中取出（Bopro+ / +）4092和Tg（huprp）440只小鼠。这些冷冻的脑切片是用F4-31或F20-29 MAb开发的。 F4-31 MAb与牛，FVB小鼠和TG的部分绑定（BoPRP + / +）4092只小鼠，而F20-29仅限于来自人和TG（HUPRP）440只小鼠的部分。将脑切片暴露于10％2-ME以减少PRP二硫化物废除AB结合（图。 6., 7，补充图1）。
图6。
组织表达F4-31和F20-29 MAB。 FVB，TG的海马冠状切片（BoPRP+ / +）4092，使用Tg（HuprP）440只小鼠。减少10％2 - 我废除了信号。 Am，Amygdala; CC，语料库胼callosum; fi，fimbria;惠普，海马; HY，下丘脑; IC，内部胶囊; NC，Neocortex; PU，PUTAMEN; Th，丘脑。
图7。
F4-31检测PRP.C 在牛大脑中的灰色和白质（A）但不在人体组织中（B）。相比之下，F20-29仅检测PRPC 在人类大脑的灰质（D）但不是牛组织（C）。 E–H，使用10％2-Me废除了PRP中的二硫化物废除了AB信号。秤条，0.5厘米，适用于所有面板。
F4-31作为ELISA的捕获AB
为了测试MAb F4-31作为捕获AB的能力，我们将其荧光信号与来自BSE感染的牛的脑匀浆，Scrapie感染的绵羊，CWD感染鹿的脑匀浆将其荧光信号与捕获AB嗡嗡声-D18 RFAb的荧光信号进行比较。 SC237感染的SHA，RML感染的小鼠和SCJD感染人脑（FI.g. 8A）。使用CDI格式（28），我们测量了与天然PrP的差异AB与化学变性的PRP。 CDI使用ABS识别PRP可用的表位C 但埋在原生PRPSC.; PRP的化学变性SC. 揭示表位，从而允许检测PRPSC.，即使在PRP存在下C。格式化为夹心免疫测定，我们询问CDI是否可以通过在BSE和CWD朊病毒的检测中取代F4-31 mAb来改善CDI来改善CDI-D18 RFAB（24）。
图8。
改进了BSE朊病毒的检测。 A，检测PRPSC. 如图所示，使用F4-31 mAb（阴影棒）或嗡嗡声rfab（开口棒）作为CDI中的捕获AB，在不同物种的受感染脑匀浆中。结果呈现为在CPM中测量的时间分辨荧光信号的（D-N）差异。 B，测量BoPRPSC. in BSE-infected bovine brain samples diluted into normal bovine brain homogenate, using HuM-D18 rFab (○) or F4-31 mAb (□）作为CDI中的捕获AB。在两个实验中，欧盟缀合的HUM-P RFAb用作检测AB。 （D.–N) difference is directly proportional to the concentration of PrPSC. 在样品中。数据点和杆分别代表来自三个独立测量的平均值和标准偏差。
在CDI格式中，MAB F4-31显示出较高的荧光信号，用于所有测试的所有物种，除了人类PRP，它不会结合。通过SC237感染的仓鼠大脑，与D18相比，我们观察到F4-31的信号增加4倍。此外，F4-31展示了具有感染牛和绵羊脑匀浆的信号的〜3倍，信号与受感染鹿和小鼠样品的信号增加2倍（FI.g. 8A）。
接下来，我们比较了CDI的敏感性以检测BOPRPSC. 在BSE感染的牛脑中使用D18或F4-31作为捕获AB（FI.g. 8B）。 Bopre.SC. 在BSE感染的牛脑中促进稀释成未感染的脑匀浆，使用HUM-D18 RFAB或F4-31 MAb作为捕获AB。欧盟缀合的HUM-P RFAB用作检测AB。 （D-N）差异与PRP的浓度成正比SC. 在样品中。与HUM-D18 RFAB相比，F4-31 MAb增加了对BSE朊病毒检测的敏感性〜500折。
AB Epitope Mapping.
为了鉴定F4-31 mAb的表位，我们评估了AB与ELISA重叠残留物的一系列肽的结合。对于BoPRP，我们合成12-残基肽，具有7-AA重叠，跨越BoPRP（95-241）（补充表I）。 RFAB HUM-P与这些肽的结合用作阳性对照。未观察到F4-31的结合对这些肽中的任何一种，而在完整的RBOPRP（102-241）多肽（补充表I）上观察到强结合。然而，F4-31与牛肽的结合（BoPRP序列102-190,1186-212,1110-242,205-237,222-241,186-212,206-237和222-241）是阴性的（数据未显示）。相比之下，MAB F10-26，在DSDELCIA和CDI中失败了（表I.），通过ELISA证明了强烈的结合牛肽（补充表I）。这些数据在一起，在BoPRP（107-116）内的线性表位的结合，对应于表位MOTIF HSQWNKPSKP，类似于HUM-P的表位（24）。该发现解释了MAB F10-26的失败，当使用HUM-P RFAB作为检测（夹心）AB时，当使用HUM-P RFAb时，MAB F10-26在Dsdelfia和Cdi中捕获BoPRP。在这些测定中，检测和捕获ABS必须与PRP上的不同表位结合，得到正反应。在竞争结合实验（未示出的数据）中，RBOPRP（102-241）与MAB F10-26的预孵育抑制RFAB HUM-P的后续结合，再次表明这些ABS共享相同或重叠的表位。
我们进行了类似的实验以确定Huprp上F20-89A的表位。我们合成了10-残基肽，重叠通过7AA，跨越HUPRP（88-226）（补充表II）。 AB 3F4的结合用作阳性对照。使用RHUPRP免疫原产生的MAb，仅F20-49（未显示）和F20-89A（补充表II）结合的特异性肽。这些数据表明F20-49的Huprp（108-115）（Mkhmaga）的表位基序和用于F20-89A的HUPRP（97-100）（SQWN）。
当在单个肽上测试MAB F20-29，F20-108A，F20-130A和F20-80时，未观察到任何结合，这表明这些mAb的非线性表位（表I.）。
讨论
一旦发现了PRP 27-30（38, 39），大量努力导致了多克隆ABS的生产（40, 41），后来，mabs（42）。 Western Blotting和免疫组化开启了新的研究途径，包括朊病毒疾病淀粉样蛋白斑块含有PRP的示范（40）根据早期的研究，将PRP 27-30的研究显示为聚合成棒状结构，其与淀粉样蛋白（43）。 PRP的本地化SC. 在大脑切片中，通过发展组织斑点技术（37在本研究中使用的是，证明PRP的二硫键减少SC. 原位与依赖于依赖性F20-29和F4-31 mAb的免疫染色（图。 6., 7，补充图1）。
虽然反PRP ABS在推进朊病毒研究方面至关重要，但啮齿动物和培养细胞的生物测量仍然是必需的（25, 44, 45）。在控制胶质纤维酸性蛋白质启动子的控制下，使用表达荧光素酶的转基因小鼠，有可能与PRP的生产相关联的生物发光的增加SC. 和朊病毒感染性长在临床迹象中出现神经系统功能障碍（46）。使用PRP的淀粉样液性能开发了基于非免疫的过程SC. 并且能够检测PRP的抗蛋白酶抗性和敏感形式SC. (47）。
通过用重组多肽Rhuprp（90-231）和RBOPRP（102-241）的序列，分别通过将小鼠免疫小鼠生成MAB，分别对应于人和牛朊病毒术的PK抗性核心的序列。我们使用了识别的分层筛选策略，早期在筛查过程中，MABS作为捕获试剂具有高活性。初始融合实验导致数百个正信号。然而，仅确定六个候选者在用作捕获试剂时始终如一地给出了高信号。随后克隆了这些ABS，得到MABS F4-31，F20-29，F20-49，F20-89A，F20-108A和F20-130A。选择了两种额外的mAb（F10-26和F20-80），其在ELISA中产生了强烈的信号，但在DSDERCIA中被捕获ABS失败。使用朊病毒感染的牛，人，绵羊，小鼠和叙利亚仓鼠的脑匀浆西部免疫印迹证明了所有八种MAB的原生PRPC 和 denatured PrPSC. but not native PrPSC. (FI.g. 4）。每个MAb都表现出不同的能力来识别所检查的五种物种的PRP。 MAB F20-29仅识别HUPRP，而AB F4-31从所有经过测试的所有物种中结合的PRP，除了人类。
当我们破坏PRP中的单一二硫键时，几乎消除了MAb F20-29A，F4-31，F20-108A，F20-130A和F20-80的结合（图。 5.–7，补充图1， 表I.）。相反，通过除去二硫键而不会降低另外三个ABS的结合。 O / R比的差异争论ABS的线性或不连续表位，后者是依赖的构象（表I.，补充表I，II）。 F10-26，F20-49和F20-89A具有邻近1.0的O / R比，并结合短，重叠的肽，其表示线性表位（表I.）。另外的五个ABS具有≥3.0，并且没有结合任何重叠的肽，争论非线性，构象依赖性表位。二硫桥的还原破坏了构象或不连续的表位，但它不影响线性表位，用于结合。 F4-31，F20-29，F20-108A，F20-130A和F20-80MAb的表位的原子结构仍然待确定。
选择F4-31进行进一步研究，因为其与BoPRP的强烈结合，其繁多的交叉物质反应性，以及其用作捕获AB的能力。 F4-31与本机PRP绑定C 和GDN变性的PRPSC. 但不是原生prpSC. (FI.g. 4A, 4C）。除HUPRP除外，F4-31与HUM-D18 RFAb相比，CDI中的信号更高，除HUPRP除外（FI.g. 8A），展示朊病毒检测的大量改善。将BSE感染的脑匀浆稀释成正常牛脑匀浆的实验证明了a>当F4-31用作CDI中的捕获试剂时，敏感性增加500倍（FI.g. 8B）。似乎可以使用F4-31在CDI中观察到的改善性能，从其对BoPRP的高亲和力及其构象表位，其原子结构仍有待阐明的结果。然而，我们的数据表明F4-31 MAB可以用作优异的捕获MAB，用于PRP的高敏感性检测。
本文报道了一种新颖的依赖依赖性mAb，其活动可以通过减少PRP的单一二硫键来消除。以各种测试格式降低PRP后的极低背景表明这些构象依赖性的MAb可能在各种免疫测定中找到应用。
致谢
披露 作者没有财务利益冲突。
脚注
这项工作得到了美国农业部门（58-5325-3-246）的支持，由国家健康机构（AG02132，AG10770，AG021601，AG031220和AI064709）以及来自G.的礼物的补助金。 Harold和Leila Y.Mathers慈善基金会，谢尔曼·费尔奇尔（Schott Foundation）公共教育基金会和罗伯特·普林匹克。
本文的在线版本中包含补充材料。
本文中使用的缩写：
- 是
- 是ygdala.
- AP
- 碱性磷酸酶
- 博
- 牛
- BSE.
- 牛海绵状脑病
- CC.
- 胼胝体
- CDI.
- 构象依赖性免疫测定
- CJD.
- Creutzfeldt-Jakob疾病
- CWD
- 慢性浪费疾病
- D
- 变性
- 德尔维亚
- 解离增强锰锰荧光免疫测定
- DS.
- 双三明治
- FI.
- FIMBRIA.
- 生命值
- 海马
- 胡
- 人类
- 哼
- 人鼠
- HY.
- 下丘脑
- 我知道了
- 内部胶囊
- m
- 骡鹿
- 莫
- 老鼠
- N
- 本国的
- NC.
- Neocortex.
- nfdm.
- 脱脂奶粉
- O / R比
- AB与氧化和减少朊病毒蛋白结合的比例
- OV.
- 绵羊
- PK.
- 蛋白酶K.
- PNPP.
- 对硝基苯基磷酸二钠盐
- PRNP.0/0
- 朊病毒蛋白烧蚀
- PRP.
- 朊蛋白质
- PRP 27-30.
- 抗朊病毒蛋白质同胞蛋白蛋白质的抗性核心
- PRP.C
- 正常，细胞朊病毒蛋白同种型
- PRP.SC.
- 引起朊病毒蛋白质的疾病
- PU.
- 腐败
- RBPRP.
- 重组牛朊病毒蛋白
- Rhuprp.
- 重组人朊蛋白
- RML.
- 落矶山脉实验室
- RT.
- 室内温度
- SCJD.
- Sporadic Creutzfeldt-Jakob疾病
- 邵
- 叙利亚仓鼠
- 弹簧
- 表面等离子体共鸣
- TH.
- 丘脑
- vcjd.
- 变异克雷斯菲尔特 - 雅各布病
- W
- 弱反应。
- 已收到 2009年9月3日。
- 公认 2010年4月12日。
- 版权所有©2010由美国免疫学家，Inc。
