B和T淋巴细胞衰减器在NKT细胞介导的实验性肝炎中的保护作用

arifumi. iwata.; 诺里希科瓦拜亚贝; Yoshihiro Oya.; Takayoshi. Owada; kei ikeda; Akira. Suto.; 胫-Ichiro Kagami; koichi. Hirose.; Hiroko. Kanari.; Saki. Kawashima; Toshinori. Nakayama.; Masaru. taniguchi.; itsuo iwamoto.; Hiroshi. Nakajima

doi:10.4049 / jimmunol.0900389.

抽象的

尽管B和T淋巴细胞衰减器（BTLA）最初被鉴定为在Th1细胞和B细胞上选择性地表达的抑制核心体，但最近的研究表明BTLA在各种细胞上表达，包括巨噬细胞，树突细胞和NK细胞，和调制其功能。然而，BTLA在NKT细胞功能调节中的作用仍然未知。在这项研究中，我们发现BTLA在与T细胞和BTLA缺陷的水平相似的NKT细胞上表达，（BTLA^{- / -}通过与野生型（WT）NKT细胞相比，NKT细胞在α-贫晶酰胺刺激上产生了较大量的IL-4和IFN-γ。在Vivo，BTLA^{- / -}小鼠在注射时产生了较大量的IL-4和IFN-γ，并且更容易受到诱导的肝炎而不是WT小鼠。此外，BTLA在BTLA诱导的肝炎的增强^{- / -}在BTLA / NKT - 双缺陷小鼠中未观察到小鼠。而且，NKT.^{- / -}小鼠与btla重建^{- / -}与NKT相比，NKT细胞显着更容易被诱导的肝炎诱导的肝炎^{- / -}小鼠用WT NKT细胞重构。这些结果表明，BTLA作为NKT细胞的抑制作用，在预防NKT细胞介导的肝损伤中起着关键作用。

通过刺激和抑制核心传递的信号调节与初级ARR信号合作的淋巴细胞活化。刺激的团体包括CD28和诱导型T细胞共刺激器（ICOS），而抑制因子包括CTLA-4，编程的细胞死亡1（PD-1）和B和T淋巴细胞衰减器（BTLA）（1, 2）。累积证据表明刺激和抑制性辅助人之间的平衡对于对病原体的有效免疫应答和自我容忍的维持至关重要（1, 2）。

BTLA.最初已被识别为在Th1细胞和B细胞上选择性地表达的抑制核心体（3）。此后，使用单克隆ABS对抗BTLA的流式细胞术分析表明，BTLA在某些淋巴细胞亚群中表达，包括γδT细胞和调节性T细胞以及一些APC，例如巨噬细胞和树突细胞（DC）（DC）（4, 5）。据报道，BTLA在NK细胞上以低水平表达（4, 6）。最近，已经表明，TNFR家族成员Herpesvirus进入介质（HVEM）是BTLA的配体（5, 7, 8）与HVEM的BTLA结扎转换抑制性辅助人（5）。

最近使用BTLA缺陷的BTLA的体内功能（BTLA^{- / -}）老鼠。最初，我们已经表明，BTLA在BTLA增加了对实验性自身免疫性脑脊髓炎以及T细胞依赖性AB反应的敏感性^{- / -} 老鼠 (3）。还有据报道，BTLA^{- / -} 小鼠表现出迅速抑制部分MHC - 不匹配的心脏移植物（9），AG挑战后持续过敏气道炎症（10, 11）和实验性结肠炎的加速度（12）。这些发现表明BTLA对于受T细胞介导的免疫应答是至关重要的。此外，我们最近显示了老年BTLA^{- / -} 小鼠自发地发展自身免疫性肝炎样疾病，随着肝脏中的NKT细胞增加（13），表明BTLA可以通过抑制NKT细胞功能来预防自身免疫性肝炎。

NKT.. cells are characterized by coexpression of T cell markers such as TCR and NK cell markers such as NK1.1 (14）。在小鼠中，大多数NKT细胞表达了一种不变的Vα14TCR，这对于他们的发展至关重要（14），并识别在CD1D分子上呈现的特定配体，α-半乳糖基胺（α-脂基）（14, 15）。 NKT细胞在激活上迅速产生IL-4和IFN-γ（15, 16）在各种免疫应答中发挥至关重要的作用，包括抗肿瘤免疫，过敏反应和自身免疫疾病（ 14）。尽管已经解决了NKT细胞功能中刺激的团簇在NKT细胞功能中的作用（17, 18），包括BTLA在NKT细胞功能中包括BTLA的抑制核心的作用仍然很大程度上是未知的。

在这项研究中，我们研究了BTLA在NKT细胞功能调节中的作用。我们发现BTLA在与T细胞类似的水平的NKT细胞上表达。 BTLA.^{- / -}NKT... cells produced larger amounts of IL-4 and IFN-γ on α-GalCer stimulation as compared with wild-type (WT) NKT cells. Importantly, BTLA^{- / -} 小鼠高易受诱导的肝炎的影响，其中据报道了NKT细胞发挥病原作用（19, 20）。实际上，在BTLA的CON A诱导的肝炎增强^{- / -} 在BTLA / NKT - 双缺陷小鼠中未观察到小鼠。此外，我们发现NKT细胞缺陷（NKT^{- / -})小鼠与btla重建^{- / -}与NKT相比，NKT细胞显着更容易被诱导的肝炎诱导的肝炎^{- / -} 小鼠用WT NKT细胞重构。我们的结果表明，BTLA用作NKT细胞中的抑制核心体，从而防止NKT细胞介导的组织损伤。

材料和方法

老鼠

BTLA.^{- / -} 老鼠 (3）在C57BL / 6只小鼠（Charles River Laboratories，Kanagawa，Japan）上被回交。 NKT.^{- / -}小鼠（J.α281^{- / -} 在C57 / BL6背景上描述了MICE（21）。 NKT. ^{- / -} 小鼠与btla交叉^{- / -} 小鼠，后代与之交互以获得btla^{- / -}NKT... ^{- / -} 老鼠。将所有小鼠在比例无病原体条件下饲养在微透光器笼中，并且小鼠用于6-12倍的年龄的实验。本研究中的动物程序被千叶大学动物护理和使用委员会批准。

流式细胞仪

从BD Biosciences（San Diego，CA）购买以下ABS：抗CD3εFITC，PE（145-2C11），抗NK1.1 PE（PK136），抗CD45R / B220 FITC，PE（RA3-6B2），抗TCRβ-链FITC，PE（H57-597），抗CD8αFITC（53-6.7），抗CD11B FITC（M1 / 70），抗CD11C FITC（HL3），抗CD25 FITC（7d4 ），抗CD69 FITC（[¹H] .2F3），抗CD122 FITC（TM-β1），抗FAS生物素（JO2），抗Fas配体生物素（MFL3），链霉抗生物素蛋白-PE和链霉抗生物素蛋白 - 联合粘蛋白。抗BTLA PE（6F7）和抗BTLA Alexa Fluor 647（8F4）购自埃比科（圣地亚哥，加州）。在用抗CD16 / 32mab（BD Biosciences）封闭FCR后，用指示的ABS染色细胞，并使用CellQuestPro软件（BD Biosciences）对Facscalibur（BD Biosciences）进行分析。

聚苯键素缀合的制备 α-Galcer / CD1D–dimer

如前所述制备联苯基键素蛋白 - 缀合的α-高铝/ CD1D二聚体（22）。简而言之，2.75mlα-高压运动（200mg / ml; kirin pharma，东京，日本）和6ml小鼠Cd1d-Ig融合蛋白（0.5mg / ml; Bd Biosciences）在37℃下缀合过夜。然后将α-戈尔甘肉/ CD1D-Ig缀合物与联苯基粘蛋白 - 缀合的抗小鼠IgG1（X56; BD Biosciences）孵育60分钟。通过在室温下加入过量的对照小鼠IgG1 mAb（A111-3; BD Biosciences），将混合物中的游离联合蛋白蛋白 - 缀合的抗小鼠IgG1阻断30分钟。

从肝脏中制备单核细胞

通过PBS灌注灌注后从小鼠中除去肝脏，用PBS灌注。将每个肝脏切成小块，通过不锈钢网，并悬浮在RPMI 1640培养基中3分钟。然后根据制造商的指示从上清液中收获单核细胞并通过Percoll（GE Healthcare UK，Little Chalfont，英国）梯度离心。

通过磁性活性细胞分选制备肝内NKT细胞

将肝单核细胞与抗CD16 / 32一起培养，以阻断非特异性结合，然后用FITC-缀合的ABS的混合物染色，针对B220，CD8α，CD11b和CD11c，以及联合蛋白蛋白 - 缀合的α-高压运动/ CD1D二聚体。根据制造商的协议，使用抗FITC Microbeads（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，Bergand）耗尽Fitc阳性细胞。然后将剩余的细胞与抗聚苯键菌素微珠（Miltenyi Biotec）一起温育，并且通过磁体细胞分选呈阳性收集过卵素阳性细胞。通过流式细胞术测定收集细胞的纯度，并且常规测定>95% of TCR-β⁺ α-GalCer⁺ cells.

NKT.细胞和α-高压粉丝的细胞共培养

如别处所述制备α-高压运动型电池（22）有微小的修改。照射脾细胞的单细胞悬浮液（30灰色），并用完全RPMI 1640培养基（补充10％热灭活Fcs的RPMI 1640培养基，5.5μmβ-巯基乙醇，2中孵育毫米 l - 谷氨酰胺，非源性氨基酸和抗生素）12小时。肝脏NKT细胞（5×10⁴）如上所述富集MAC，并用α-高压杆装载细胞（5×10）⁴）在96孔圆底板中完整的RPMI1640培养基，36小时。

增殖试验

根据制造商的指导（Promega，Madison，Wi），使用Celltiter-Glo试剂测量NKT细胞的增殖。

CON诱导的肝炎

将A（Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo）溶解在无热原PBS中并注入小鼠（10或20mg / kg I.v.）中。在浸渍后的指示时间从个体小鼠收集血清。通过标准方案（SRL，Tokyo，Japan）测量血清中丙氨酸氨基转移酶（AST）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）的水平。

通过酶联免疫吸附测定测量细胞因子水平

根据制造商的方案（TNF-α，IL-4和IL-10套件，通过ELISA试剂盒测量血清中TNF-α，IL-4，IFN-γ和IL-10的水平。来自BD Biosciences;和IFN-γ套件来自 R&D Systems，明尼阿波利斯，Mn）。测定的最小显着值为15pg / ml TNF-α和IL-4，30 pg / ml IFN-γ和IL-10。

采用NKT细胞的转移

来自WT小鼠或BTLA的纯化的肝内NKT细胞^{- / -}将小鼠注射到NKT的肝脏中 ^{- / -}小鼠（1× 10⁶ 细胞/鼠标）如前所述（19）。一小时后，将小鼠注射I.V.符合A（10 mg / kg）。在注射后在12和24小时获得血清。

统计分析

数据总结为平均值±SD。结果的统计分析由未配对进行 t 测试。 p 价值<0.05被认为是显着的。

结果

BTLA.在NKT细胞上表达，但可分配用于开发和维持NKT细胞

To determine whether BTLA is involved in the development and function of NKT cells, we first examined the expression of BTLA on NKT cells. Mononuclear cells from thymus, spleen, and liver in C57BL/6用抗体染色小鼠-BTLA mAb (6F7), and the expression levels of BTLA on each cell type were evaluated by flow cytometry. As shown in Fig. 1，在NKT细胞上检测到BTLA的表达，其定义为CD3⁺ α-GalCer/CD1d-dimer⁺ 细胞，在与CD3上类似的水平⁺ T细胞。与以前的报告一致（3, 6），BTLA在B220的更高水平上表达⁺ B细胞和NK细胞的较低水平（Fig. 1）。

图1。

BTLA.在与CD3类似的水平的NKT细胞上表达⁺ T细胞。 Mononuclear cells from thymus, spleen, and liver in C57BL/6用抗体染色小鼠-BTLA mAb. Representative histograms of BTLA expression (solid line) on NKT cells (CD3⁺ α-GalCer/CD1d–dimer⁺），T细胞（CD3^高的 α-GalCer/CD1d–dimer⁻），B细胞（CD3⁻ B220⁺）和NK细胞（NK1.1⁺ CD3⁻）显示（n = 4只小鼠）。阴影区域表示使用异型匹配AB控制染色。

我们接下来检查了BTLA中NKT细胞的开发和激活状态^{- / -} 老鼠。如前所述（3），BTLA中胸腺细胞和脾细胞的数量^{- / -} 8周龄的小鼠与WT小鼠（数据未显示的数据）相当。流式细胞术分析显示NKT细胞的频率（TCRβ⁺ α-GarCer/CD1d⁺细胞）在BTLA的胸腺和脾脏中^{- / -} 小鼠与wt小鼠的小鼠相当（Fig. 2A）。 BTLA肝脏中NKT细胞的数量^{- / -} 小鼠也与wt小鼠相似（Fig. 2A）。此外，BTLA之间的活化标记如CD25，CD69和CD122等活化标志物如CD25，CD69和CD122的表达水平相似^{- / -} 老鼠 and WT mice (Fig. 2B）。这些结果表明，BTLA可分配用于开发和维持NKT细胞的稳定状态。

图2。

BTLA.中NKT细胞正常发展^{- / -}老鼠。来自胸腺，脾脏和肝脏的单核细胞在wt小鼠和btla中^{- / -}用抗体染色小鼠–TCR-βPe，联合粘土蛋白 - 共轭α-GalCer/CD1d–dimer, and FITC-conjugated Abs against CD25, CD69, or CD122 and analyzed by flow cytometry. A，TCR-β的代表性FACS谱与α-高压运动/ CD1D二聚体染色（左侧面板），TCR-β的百分比⁺ α-GalCer/CD1d–dimer⁺ cells (右图）显示。数据在每种基因型中为4只小鼠的±SD。 B, CD25，CD69和CD122在TCR-β表达的代表性直方图⁺ α-GalCer/CD1d–dimer⁺ cells are shown (n =每种基因型中的4只小鼠）。虚线表明用异型匹配AB控制染色。

BTLA.缺陷的NKT细胞在体外对Ag刺激进行过度反应性

我们接下来检查了BTLA规范的NKT细胞功能。来自WT小鼠的肝脏和BTLA的纯化的NKT细胞^{- / -} 用α-高级剂加载的APC刺激小鼠36小时，并通过ELISA测量培养上清液中IFN-γ，IL-4和TNF-α的水平。响应于α-高压运动刺激（100ng / ml），BTLA^{- / -}NKT... cells secreted significantly larger amounts of IFN-γ and IL-4, compared with WT NKT cells (IFN-γ: BTLA^{- / -} 14.9±7.9与wt 3.7±2.5 ng / ml; n = 6; p < 0.05; IL-4: BTLA^{- / -} 1.8±0.5对WT 1.0±0.4 ng / ml; n = 6; p < 0.05; Fig. 3A）。在WT NKT细胞和BTLA的培养上清液中未检测到TNF-α^{- / -}NKT... cells in the experimental condition (data not shown). In addition, BTLA^{- / -}NKT... cells showed enhanced proliferation in response to α-GalCer stimulation, compared with WT NKT cells (Fig. 3B）。这些结果表明BTLA^{- / -}NKT... cells are hyperreactive to antigenic stimulation, suggesting that BTLA functions as an inhibitory coreceptor in NKT cell activation.

图3。

增加了BTLA的激活^{- / -}NKT... cells on AgR stimulation in vitro. NKT cells (5 × 10⁴）从WT和BTLA的肝脏纯化^{- / -}小鼠和与...共养α-GalCer–装载辐照脾细胞（5× 10⁴）APCS 36小时。 A, The levels of IFN-γ通过ELISA测量培养上清液中的IL-4。数据是手段± SD for 6 mice in each group. *p < 0.05. B，使用Celltiter-Glo试剂测定NKT细胞的增殖。数据是每组6只小鼠的±SD。 *p < 0.05.

BTLA.^{- / -} 小鼠高易感诱导的肝炎

CON A引起的肝炎是一种广泛使用的小鼠模型，在许多方面的人类中类似于自身免疫性肝炎（23）。在缺乏NKT细胞的小鼠中显示出肝炎后的肝炎发生肝炎（19, 20），表明NKT细胞参与导致CON诱导的肝炎。因此，我们选择该模型来测试BTLA在体内NKT细胞上表达的功能。当wt小鼠和btla^{- / -} 小鼠注射了I.v.符合AN（20 mg / kg），所有btla^{- / -} 注射后24小时死亡，而所有wt小鼠在48小时内幸存下来（Fig. 4A）。这些结果表明BTLA^{- / -} 小鼠高度易受诱发的肝炎。

图4。

增加了对BTLA诱导肝炎的易感性^{- / -} 老鼠。 A，btla.^{- / -} 注射小鼠（实线）和Wt小鼠（虚线）I.v.通过Con A（20mg / kg），并评估小鼠的存活率48小时（n 每组= 5只小鼠）。 BTLA.^{- / -} 注射了小鼠和Wt小鼠。含有亚麻剂量的锥体（10mg / kg）。 B，在注射后24小时在24小时内切除肝脏。代表性显微照片（H&BTLA肝脏染色）^{- / -} 显示了小鼠和WT小鼠（n =每组6只小鼠）。 C在注射后在12和24小时收集血清，并确定ALT和AST的水平。数据是指±SD（n =每组6只小鼠; *p < 0.05; * *p < 0.01). D, Sera were collected at 1, 3, 8, and 24 h after Con A injection, and the levels of TNF-α, IFN-γ，确定IL-4和IL-10。数据是手段± SD (n =每组4只小鼠; *p < 0.05). E，在注射后1小时，分离肝单核细胞，通过流式细胞术分析Fas配体（FASL）的表达水平。显示是在T细胞上的FasL表达的代表性直方图（CD3ε⁺ α-GalCer/CD1d–dimer⁻），NKT细胞（CD3ε⁺ α-GalCer/CD1d–dimer⁺）和NK细胞（CD3ε⁻ NK1.1⁺）在肝脏（n =每组4只小鼠）。

检查BTLA中的免疫应答^{- / -} 小鼠详细介绍，我们使用了一种对BTLA的亚致致死剂量的Con A（10mg / kg）^{- / -} 在以下实验中的小鼠。首先，我们对肝脏肝脏进行了组织学检查^{- / -} 小鼠和wt小鼠。如图所示 Fig. 4B，来自肝脏的肝脏切片^{- / -} 小鼠在门户面积上显示出大量的坏死和单核细胞浸润。此外，BTLA血清中ALT和AST的水平^{- / -} 与注射后12和24小时的WT小鼠相比，小鼠显着升高（n = 6; *p < 0.05; **p < 0.01; Fig. 4C），确认在BTLA诱导肝炎的易感性增加^{- / -} mice.

许多研究表明TNF-α，IFN-γ和IL-4的促炎作用以及IL-10在CON诱导的肝炎中的保护作用（24–26）。还证明了NKT细胞产生的IL-4与CON诱导的肝炎中的肝损伤有关（19, 27）。因此，我们测量了Con A注入的BTLA血清中的细胞因子水平^{- / -} 小鼠和wt小鼠。 TNF-α和IFN-γ的水平显示CON A-REETED BTLA的急剧增加^{- / -} 小鼠，峰值高于WT小鼠的峰值（Fig. 4D）。在WT小鼠注射后24小时将TNF-α和IFN-γ的水平恢复到基线，但在BTLA仍然升高^{- / -} 老鼠 (Fig. 4D）。 CON A-REETED BTLA^{- / -} 与WT小鼠相比，小鼠还表现出延长的IL-4生产（Fig. 4D）。或者，IL-10的水平在CON A注入的BTLA之间具有可比性^{- / -} 老鼠 and WT mice (Fig. 4D）。

据报道，肝脏NKT细胞迅速上调表面上的FasL表达，并在刺激时诱导肝细胞的凋亡（ 19, 20）。因此，我们在CON A-REETED BTLA中检查了对肝脏NKT细胞的FASL表达 ^{- / -} 小鼠和wt小鼠。如图所示 Fig. 4E，FasL在NKT细胞上上调，但在BTLA中注射后1小时，在1小时内没有在T细胞或NK细胞上进行^{- / -} 小鼠和wt小鼠。 BTLA之间的NKT细胞上的FASL水平相似^{- / -} 小鼠和WT小鼠，表明NKT细胞表达的FASL无法考虑增强易受BTLA肝炎的易感性^{- / -} mice.

对于BTLA的Con A诱导的肝炎增强，需要NKT细胞^{- / -} mice

判断BTLA中是否增强了CON A诱导的肝炎^{- / -} 小鼠取决于NKT细胞，我们检查了在缺乏BTLA和NKT细胞的小鼠中诱导肝炎的易感性（BTLA^{- / -}NKT... ^{- / -} 老鼠）。我们首先在BTLA检查淋巴细胞发育^{- / -}NKT... ^{- / -} 小鼠并发现BTLA^{- / -}NKT... ^{- / -} 小鼠缺乏NKT细胞，但具有正常数量的其他淋巴群（数据未显示）。然后我们比较了BTLA的Alt和Ast的水平^{- / -}NKT... ^{- / -} mice, BTLA^{- / -}小鼠，NKT. ^{- / -} 小鼠，并在注射时的WT小鼠。与以前的研究一致（19），CON诱导的肝炎在NKT中显着减弱 ^{- / -} 小鼠与wt小鼠相比（Fig. 5A），表明NKT细胞在导致CON诱导的肝炎方面发挥着重要作用。重要的是，在BTLA中增强CON诱导的肝炎^{- / -} 在BTLA未观察到小鼠 ^{- / -}NKT... ^{- / -} 老鼠 (Fig. 5A）。组织学分析证实了Con A-Reeted BTLA中的肝脏损伤降低^{- / -}NKT... ^{- / -} 与btla相比的小鼠^{- / -} 老鼠 (Fig. 5B）。此外，BTLA在BTLA中显着降低了TNF-α，IFN-γ和IL-4的血清水平显着降低^{- / -}NKT... ^{- / -} 与btla相比的小鼠^{- / -} 老鼠 (Fig. 5C）。这些结果表明，NKT细胞对于BTLA的CON A诱导的肝炎增强至关重要 ^{- / -} mice.

图5。

对于BTLA的Con A诱导的肝炎增强，需要NKT细胞^{- / -}老鼠。 Wt小鼠，BTLA^{- / -}小鼠，NKT.^{- / -}小鼠（J.α281^{- / -}小鼠）和BTLA^{- / -}NKT... ^{- / -} 小鼠注射了I.v.具有亚致死剂量的锥体（10mg / kg）。 A，在注射后在12小时内收集血清，并确定ALT和AST的水平。数据是指±SD（n = 6; *p < 0.05; **p < 0.01). B，肝脏从WT小鼠，BTLA切除^{- / -}小鼠，NKT.^{- / -}小鼠和BTLA^{- / -}NKT... ^{- / -}在注射后24小时的小鼠。显示是代表性的显微照片（H.&肝脏染色（n =每组4只小鼠）。 C，从BTLA的WT小鼠收集血清^{- / -}小鼠，NKT.^{- / -}小鼠和BTLA^{- / -}NKT... ^{- / -}在注射后3和8小时的小鼠，以及TNF的水平α, IFN-γ并且通过ELISA确定了IL-4。数据是手段± SD (n = 4; *p < 0.05).

在NKT细胞上表达的BTLA参与抑制Con诱导的肝炎

为了确定在NKT细胞上表达的BTLA是否对抑制CON诱导的肝炎至关重要，我们进行了采用的转移实验，其中来自WT或BTLA的纯化的NKT细胞^{- / -} 小鼠转移到NKT ^{- / -} 老鼠。如图所示 Fig. 6，NKT.^{- / -}小鼠与btla重建^{- / -}NKT... cells were significantly more susceptible to CON诱导的肝炎, compared with NKT ^{- / -} 用WT NKT细胞重构的小鼠（n =每组12只小鼠; p <0.05）。这些结果表明，在NKT细胞上表达的BTLA涉及抑制Con诱导的肝炎。

图6。

NKT..^{- / -}小鼠与btla重建^{- / -}NKT... cells tended to be susceptible to CON诱导的肝炎. 来自WT小鼠或BTLA的纯化的肝内NKT细胞^{- / -}将小鼠注射到NKT的肝脏中^{- / -}小鼠（1× 10⁶ 细胞/小鼠），1小时后，将小鼠注射锥体I.v.在注射剂后，从小鼠中从小鼠获得血清，并测定血清ALT和AST水平。数据是指±SD（ n =每组12只小鼠; *p < 0.05).

讨论

在这项研究中，我们表明BTLA在NKT细胞上表达（Fig. 1）那个btla^{- / -}NKT... cells produce larger amounts of cytokines on Ag stimulation than WT NKT cells do (Fig. 3），表明BTLA对NKT细胞产生抑制作用。此外，它最近已经证明PD-1 / PD-1配体1相互作用对于NKT细胞的诱导和维持诱导和维持基因（28）。它还证明了刺激的团簇如CD28（17）和ICOS（18）在NKT细胞诱导细胞因子生产中发挥重要作用。这些发现表明，与T细胞类似，NKT细胞的激活受到刺激性辅助物质和抑制性辅助物之间的平衡，包括BTLA。

我们还表明BTLA^{- / -} 小鼠高易受癌症肝炎（Fig. 4），其中已显示NKT细胞发挥重要作用（19, 20）。实际上，虽然CON诱导的肝炎在NKT中显着衰减^{- / -} 与WT小鼠相比，BTLA在BTLA诱导肝炎的增强^{- / -} 在BTLA未观察到小鼠 ^{- / -}NKT... ^{- / -} 老鼠 (Fig. 5A-C.）。最近，Miller等人。（29）还报告说BTLA^{- / -} 小鼠易于诱发肝炎，并且增加了BTLA的易感性^{- / -} 在BTLA中，将小鼠进行诱发的肝炎减少^{- / -} CD1d^{- / -} 小鼠，缺乏大多数NKT细胞（14）。重要的是，我们还表明了NKT^{- / -}小鼠与btla重建^{- / -}NKT... cells are significantly more susceptible to CON诱导的肝炎, compared with NKT^{- / -} 用WT NKT细胞重构的小鼠（Fig. 6），表明在NKT细胞上表达的BTLA参与调节对诱导的肝炎的敏感性。

最近，已经证明缺乏HVEM的小鼠，BTLA的配体（5, 7, 8），也非常易于对注射进行注射以诱导增加的CD4⁺ T细胞活化，但表现出没有显着的肝损伤（30）。因为HVEM是BTLA的配体和用于与HSV糖蛋白D用于HVEM的淋巴氧化丁蛋白（可诱导表达）的共刺激受体（在T淋巴细胞上表达的受体）（5），NKT细胞活化可能不足以诱导HVEM缺陷小鼠中的肝炎。

NKT.细胞导致CON诱导的肝炎的效应机制仍然待阐明。以前的研究表明，包括IL-4的NKT细胞衍生的细胞因子对于NKT细胞介导的肝损伤至关重要（19）。与这些发现一致，我们发现在BTLA中增强了来自α-高压糖激活的NKT细胞的IL-4产生的IL-4的IL-4水平^{- / -} 老鼠 (图。 3.A 和 4D）。或者，在BTLA上类似地上调FasL表达^{- / -}NKT... cells and WT NKT cells on Con A injection (Fig. 4E）。有人建议，细胞因子升高而不是FasL表达可能涉及BTLA诱导的肝炎的增强^{- / -} 老鼠。此外，已经提出了与HSV糖蛋白D用于HVEM（T淋巴细胞表达的受体）与NKT细胞释放的HSV糖蛋白D（T淋巴细胞表达的受体）的可溶性淋巴酮（诱导表达）也可以是用于诱导的肝炎的效应分子（31）。

我们发现BTLA^{- / -}NKT... cells produced larger amounts of cytokines on α-GalCer stimulation in vitro (Fig. 3A）。因为BTLA之间的活化标记如CD25，CD69和CD122等活化标志物的表达水平相似^{- / -} 老鼠 and WT mice (Fig. 2B），建议增强了BTLA的细胞因子产生^{- / -}NKT... cells is caused by a lack of BTLA-HVEM interaction during the in vitro Ag stimulation. However, in preliminary experiments, we found that the addition of anti-BTLA Ab (clone 6F7), which is reported to function as a neutralizing Ab (32），没有显着增强来自体外α-高压糖刺激的WT NKT细胞的细胞因子产生。虽然该实验是不确定的，因为6F7至BTLA的结合可以在NKT细胞中转导一些信号，但这种发现提出了BTLA增强细胞因子产生的另一种可能性^{- / -}NKT... cells may be caused by developmental abnormality of BTLA^{- / -}NKT... cells rather than a lack of BTLA-HVEM interaction upon Ag stimulation. Further studies using inducible deletion of the BTLA. 需要NKT细胞中的基因来解决从α-高级剂刺激的BTLA增强细胞因子产生的精确机制^{- / -}NKT... cells.

最近，已经证明了PD-1，另一个抑制因子，在NKT细胞上表达（28）通过PD-1配体1接合PD-1对NKT细胞的接合抑制α-高压运动活化的NKT细胞细胞因子分泌（33）。 CD94 / NKG2a，NK细胞上的抑制受体也在NKT细胞上表达，并且具有拮抗AB增强的NKG2A介导的抑制信号的阻断和α-高压菌诱导的肝损伤（34）。此外，CD4.⁺ CD25⁺ 据报道，调节性T细胞对于通过TGF-β依赖性机制抑制CON诱导的肝损伤是重要的（35）。因此，建议除了BTLA之外，多种抑制途径还参与肝脏中NKT细胞功能的调节。

总之，我们已经表明，BTLA用作NKT细胞中的抑制作用者，并防止NKT细胞介导的实验性肝炎。虽然需要进一步的研究来解决潜在机制，但我们的数据表明，通过激动配体或刺激AB的NKT细胞中BTLA信号传导的增强可能适用于治疗NKT细胞发育致病作用的许多疾病。

致谢

我们感谢K. M. Murphy博士为BTLA^{- / -} 小鼠，Nagashima女士进行动物护理，以及Sugaya女士用于细胞净化的技术支持。

披露作者没有财务利益冲突。

脚注

这些工作是由教育，文化，科学技术部，日本政府和全球COE计划的科学研究的补助金提供支持（全球COE计划（全球免疫系统监管中心和待遇），教育部，文化，体育，科学技术，日本政府，日本。
本文中使用的缩写：
alt.
丙氨酸氨基转移酶
AST.
天冬氨酸氨基转移酶
BTLA.
B和T淋巴细胞衰减器
BTLA.^{- / -}
BTLA.缺陷
DC.
树突细胞
α-高空人
α-半乳糖基胺
HVEM.
Herpesvirus进入调解员
ICOS.
诱导型T细胞共刺激器
PD-1
编程的细胞死亡1
NKT..
细胞缺陷（NKT^{- / -})
WT.
野生型。

已收到 2009年2月6日。
公认 2009年10月21日。

参考

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