抽象的
通过激活受体NKG2D识别靶细胞表面上的MHC类I相关链（MIC）分子通过免疫效应细胞导致它们的裂解。 NKG2D配体的上调与应力大致相关，尽管控制质膜在血浆膜上存在这些分子存在的详细分子机制尚不清楚。为了探讨控制人NKG2D配体MICB表面表达的后期后期机制，我们研究了亚细胞定位和贩运该分子。我们发现在几种细胞系统中，细胞表面上MICB分子的表达伴随着分子的细胞内积聚trans-GOLGI网络和晚期内组合相关的隔间。令人惊讶的是，MICB在质膜上具有比MHC分子更短的半衰期，这取决于回收到内隔室并脱落到细胞外培养基。 MICB的内化部分依赖于克拉汀，但重要的是，膜的脂质环境在该过程中也起到了至关重要的作用。我们建议，至少部分地，MICB在血浆膜在免疫系统中调节该分子的功能。
主要的组织相容性复杂的I相关链（MIC）4 A和B是在人MHC内编码的两个MHC样分子，但与经典HLA类I蛋白不同，因为它们既不结合β2-microglobulin也没有抗原肽（1, 2, 3, 4）。 MIC蛋白质结合，在所有NK细胞和CD8上形成组成型表达的活化受体NKG2D+ T细胞亚群并在CD4上激活后上调+ T cells (5）。 NKG2D对其配体的接合导致NK细胞和T细胞直接或作为共刺激因子的裂解和细胞因子分泌（用于审查，参见参考文献。 6）。因此，必须紧密调节推定靶细胞表面的MIC的存在，以便不会触发或隐藏免疫应答（这将导致第一例中的自身免疫和后者的免疫逃避）。事实上，除了胃肠性上皮外，绝大多数正常细胞在细胞表面不表达麦克风分子;相反，这些蛋白质的表达在许多病理情况下令人上调，主要是癌症和自身免疫（用于审查，参见参考文献。 7 and 8）。例如，在各种起源的肿瘤中发现了MIC表达以及病原体的存在 结核分枝杆菌 已被证明是上调其表达（9）。最近，已经显示了许多外部刺激，例如DNA损伤剂和蛋白酶体抑制剂，以诱导NKG2D配体的表达（10, 11）。因此，尽管调节MIC表达的精确机制仍然是未知的，但是在质膜膜处的MIC的存在可以广泛地与应力宽，并且这与MIC启动子中的热冲击元件的存在一致（3）。在许多非转化的细胞类型中，包括角质形成细胞，内皮细胞和单核细胞的蛋白质印迹检测到MIC的事实，尽管它们未发现它们在所有这些中的细胞表面（2, 12, 13, 14）除了转录调节之外，还表明在调节MIC表达的后术后和后期机制的存在。 NKG2D配体也可以从细胞中脱落，因为可溶性分子表示该系统中的额外复杂程度（15, 16, 17）。
MICB是由涉及免疫逃避的病原体表达的几种蛋白质的靶标。有趣的是，他们中的许多人对MICB有选择性，并且它们不会影响相关的蛋白质云母（ 18）。仍有许多关于大量NKG2D配体的问题以及这种多样性是否反映了功能差异（用于审查，请参阅参考文献。 19）。
目的是研究在后期后期控制MICB分子的表面表达的机制，我们研究了亚细胞本地化和贩运MICB。在本研究中，我们在几种细胞系中显示，细胞表面上MICB分子的表达伴随着分子的细胞内积聚 trans-GOLGI网络（TGN）和晚期与内剂相关的隔间。我们进一步表明，MICB在血浆膜上具有短的半衰期，这取决于脱落和克拉仑依赖性内吞作用，尽管血浆膜中胆固醇的完整性也影响MICB蛋白的内化。
材料和方法
细胞，试剂和ABS
Hela，U373和CV1细胞维持在补充10％FCS和抗生素（DMEM / 10％FCS）的DMEM中。 721.221和HCT116在RPMI 1640培养基中培养10％FCS和抗生素。
流式细胞仪
用于流式细胞仪，105 将细胞与小鼠mAb孵育，并使用PE-或FITC标记的F（AB'）可视化AB。2 山羊抗小鼠Ig（达科葡萄球菌）。使用FACScan II流式细胞仪（BD Biosciences）分析样品。
共聚焦显微镜
用4％固定细胞 p22）。
使用共聚焦显微镜（Leica DM IRE2或IRBE共聚焦激光扫描显微镜）获得所有荧光图像。激发波长和过滤器组由制造商提供（分别为Alexa Fluor 488和Alexa Fluor 568的488和568nm的线）。为了减少Förster共振能量转移，将第一荧光染料的发射光谱不同于第二的激发光谱，即，光谱的设置缩小至500-560和580-660nm，用于Alexa Fluor 488和Alexa荧光568分别。使用63×1.32个孔径物镜采用固定电池的图像，将共焦针孔设定为1airy单元。
图像采集。
通过使用Leica TCS软件扫描单个焦平面或一系列焦平面或一系列焦平面来获得图像。对于分层化实验，通过连续扫描488（绿色）和568（红色）通道进行图像的获取，一次通过独立地扫描绿色和红色通道的时间激发一个荧光染料。探索整个细胞内区域，系列部分（总间隔 z 获得=2-4μm）。在所用光学系统的分辨率范围内进行后续部分的图像获取，即良好分析分层化的最佳分辨率：1024×1024像素 z 间隔为0.1221μm，放大率为3-4次。图中所示的颜色和覆盖层由显微镜软件收集，并且没有进行进一步的阈值调整。 Adobe Photoshop软件用于数字的组成。
埃莉莎
2O2 在甘氨酸/柠檬酸缓冲液中;罗氏）。在410nm下测量吸光度，参考波长为490.以重复分析样品。
内化实验
ab吸收。
如前所述进行AB摄取实验（23）。将细胞在4℃下与AB孵育10分钟，然后转移至37℃以进行不同的时间长度。为了检测内化蛋白质，将细胞固定，透化，用次级染色，并通过共聚焦显微镜分析。
可切割的生物素化。
对于可切割的生物素化实验，用冰冷的PBS洗涤细胞三次。然后用0.25mg / ml磺琥珀酰亚胺酰亚胺-2-（Biotinamido）乙基-1,3-二丙烯酸（EZ-Link磺酰胺-NHS-Biotin; Pierce）孵育30分钟，含有1mM MgCl的冰冷PBS2 和 0.1 mM CaCl2 （PBS +）。通过用含有0.1％BSA的冰冷的血清培养基洗涤细胞三次，用冰冷的PBS +洗涤细胞三次淬灭反应。预先用（至37℃）加入血清培养基，用于所需的时间段以允许生物素化的表面组分的内化，然后将它们返回到4℃。在用PBS +用PBS +漂洗后，用50mM Tris-HCl（pH8.6），100mM NaCl，1mM EDTA和1mM），将生物素剥去320分钟的冰冷100mM钠2-巯基甲烷磺酸（MESNA）。 0.2％BSA。用PBS +快速冲洗细胞两次，并通过在PBS +中与冰冷的120mM碘乙酰胺进行10分钟孵育残留的mesna。在用冰冷的PBS另外两个冲洗后，裂解细胞，MICB被免疫沉淀。在SDS-PAGE和通过蛋白质印迹检测的生物素化蛋白质中溶解，用链霉蛋白-HRP或MICB特异性AB检测。
流式细胞术估计MICB内化。
使用先前描述的流式细胞术测定的变体定量MICB分子的内化，用于估计受体内化（24）。简而言之，用麦克风稳定转染的细胞瞬时转染，用编码AP180 C末端，EPSIN1 R63L + H731和EPSINR（LMB，LMB，LMB，LMB，LMB，剑桥，U.K）和EH29的ePSINR（Polyplus Transfection SA），用质粒转染。二十四小时后，通过在PBS / 0.2％BSA / 10mM EDTA中孵育来分离细胞，洗涤两次（PBS / BSA），并重悬于结合缓冲液（Ham的F12培养基中，0.2％BSA，10μmGM6001，和1 mm hepes）。将转染的细胞分成两种等分试样，而在37℃下保持，则将另一个冷却至4℃。然后将云母/ B特异性mAb（2.5μg/ ml）加入每个等分等分等分状态，将细胞在37℃或冰上温育30分钟。此后，将细胞洗涤到PBS / 0.2％BSA / 0.1％叠氮化物中并置于冰上，然后用PE缀合的二次山羊抗小鼠Ig染色。对各种构建体过表达各种构建体的细胞在GFP荧光上壁，并且针对每种条件测定在具有特异性mAb的表面标记后残留在质膜中的MICB分子的量。复制样品（5×10 4 在每个实验中分析细胞/样品）。与4℃相比，在37℃温育后表面受体荧光的还原代表受体的内化。
脉冲追踪实验
将细胞洗涤并仅在单独或用100μM氯喹或对照中重悬于无任一甲硫氨酸 - 半胱氨酸的培养基中。在37℃下孵育30分钟后，细胞被旋转并重新悬浮在107 具有pro-mix的细胞/ ml l- [35S]在0.3mci / ml的体外细胞标记混合物（Amersham Biosciences）。将细胞在37℃下孵育15分钟，然后使用10％FCS的完整培养基进行追加。每次将样品在冷PBS中洗涤，并重悬于裂解缓冲液（50mM Tris（pH 7.6），150mM NaCl，5mM EDTA，1％（v / v）Nonidet p-40,1μg/ ml Leupeptin，1 μg/ ml胃蛋白酶和5mM碘乙酰胺）。在冰上孵育30分钟后，通过培养，首先用Pansorbin（Calbiochem）进行样品，然后是蛋白质A-Sepharose珠（Pharmacia）。通过用适当的AB孵育冰并使用蛋白质珠子回收MICB。将样品洗涤三次并重新悬浮在SDS-PACE-LANGINAL缓冲液中。蛋白质在SDS-PAGE中得到解决。在BioMax MR膜（柯达）上染色并暴露凝胶。
免疫沉淀
在50mM Tris（pH7.6），150mM NaCl，5mM EDTA，1％Nonidet P-40,11μg/ ml Leupeptin和1μg/ ml胃蛋白酶中，在50mM Tris（pH7.6）中裂解细胞。在冰上孵育30分钟后，通过与Pansorbin（Calbiochem）孵育来预选样品。 MICB通过用MICB特异性ABS BMO2和6D4的混合物孵育并在冰上孵育并使用蛋白G珠（Pharmacia）回收来免疫沉淀。洗涤样品三次，并加入SDS-PACE-LANDUCAD BUFF液。蛋白质在SDS-PAGE中得到解决。
西部和小点污点
细胞裂解物在12％SDS-PAGE凝胶上运行并转移到Immobilon-P（Millipore）。使用含有0.1％吐温20（PBS-T）和5％非脱脂干乳的PBS封闭膜。通过将膜与生物素化的山羊多克隆抗MIDB AB一起孵育，然后进行HRP缀合的二次试剂来进行MICB的检测。使用ECL系统（Amersham Pharmacia）可视化蛋白质。通过将5μl上述级分固定在硝酸纤维素膜中，与霍乱毒素 - HRP（Sigma-Aldrich）一起孵育并用ECL检测来进行神经节苷脂GM1的检测。
防污膜（DRM）分馏
将细胞在含有1％Brij-58和蛋白酶抑制剂的TNE缓冲液（20mM Tris（pH7.5），150mM NaCl和5mM EDTA）中裂解并使用常规均化器均化。在TNE中，用相等体积的85％蔗糖稀释样品，然后置于步长蔗糖梯度的底部，并在200,000×以200,000×离心18-20小时分馏 g (25）。从上到下收集一毫升馏分，并达到0.2％脱氧胆酸盐的终浓度。蛋白质在SDS-PAGE上分离。如上使用ABS针对云母/ B和Caveolin-1所述进行蛋白质印迹。
通过使用霍乱毒素-HRP检测神经节苷脂GM1来评估分馏效率。
结果
细胞表面上的MIC表达伴随着晚期内组/ TGN相关隔室中分子的细胞内积累
在实验中，探讨人CMV（HCMV）使用的免疫逃逸机制，我们以前表明HCMV感染细胞损失了MICB的表面表达和细胞内累积的MIC。然而，有趣的是，我们观察到未感染的细胞也表达了大量细胞内蛋白质（23）。为了进一步研究该观察，我们分析了许多细胞系中这些分子的分布：Hela和结肠癌HCT116天然表达云母和MICB;用MIC分子（U373 / CV1-MICA和-MICB）稳定地转染胶质瘤细胞系U373和猴细胞系CV1。通过流式细胞术研究云母和MICB的表面表达（图1⇓A）。通常，血浆膜的MICB表达低于云母，但在比云母的比例较大的比例较大的HCT116细胞内发现MICB（图1⇓B;整个细胞内面积补充图15）。通过共聚焦显微镜检查U373和CV1转染剂还显示出细胞内比例的大部分MICB（图1⇓C）。由于肿瘤细胞系HCT116和HeLa表达云母和MICB，因此难以自信地区分这些分子，特别是因为针对云母或MICB的ABS可以具有不同的交叉反应性，这取决于每个细胞系中存在的等位基因。由于这些原因，我们决定专注于在以下实验中的转染剂的研究。
大部分MIC是细胞内的。 A，表面MIC分子的流式细胞术分析。 HCT116，Hela，U373-MICA和U373-MICB用抗云母（AMO1）和抗MICB（BMO2）ABS染色，如所示或同种型对照。 B, Confocal microscopy of intracellular MICA and MICB in HCT116 cells. Cells were stained with anti-MICA (AMO1) and anti-MICB (BMO2) Abs and processed for confocal microscopy. Images show a single focal plane across the cell (depth of the plane 0.2849 μm) using the ×63 objective with a ×4放大率。对应于同一单元的中心部分的图像的一系列图像显示在补充图1中。比例栏，4μm. C, Confocal microscopy of intracellular MICB in U373- and CV1-MICB transfectants. Cells were stained with anti-MICA/B Ab and processed for confocal microscopy. Images were obtained by scanning a single focal plane across the cell using the ×63无放大的目标。秤栏，20μm.
为了研究MICB分子的细胞内分布，细胞用细胞内隔室的标记进行了成本，并分析在共聚焦显微镜下。分层化的可视化被呈现为对应于MICB的通道的覆盖物和不同隔室的标记物（图2 ⇓）。发现更多MICB染色的细胞区域被放大以进行细胞内分析，也包括在图2中。2⇓。为了探索整个细胞内区域，通过细胞获得系列部分（补充图2⇓）进行定性评估和定量用于分层化目的的数据（见 材料和方法）。具有不同标记的分层化系数如表I所示⇑.
麦克风与TGN和内体的标志物分析。 CV1-MICB转染子固定，透氧和耗材为MICB（绿色板）细胞内隔室的标记（CI-M6PR（TGN），KDEL（ER），CD63（晚期内剂组，MVB），EEA1（早期内部组），灯1（溶酶体，晚期内组）和GM130内侧GOLGI）]（红色面板， 如..所示）。通过连续扫描绿色和红色荧光染色来获得图像（参见 材料和方法）。前三列显示了中央区域的单个焦平面 z-axis of the series of focal planes acquired (full series shown in supplemental Fig. 2) using the ×63目标。并行地，用a获得相同细胞的图像×4放大率（在最后一列中显示），以优化用于分层分析的光学参数。该实验进行了五次，每次实验分析了每次标记的平均四个细胞。用U373-MICB转染剂获得类似的结果。尺度条：合并，20μm; zoom, 5 μm.
MICB部分地用TGN标记TGN46（未示出）和阳离子甘露糖-6-磷酸受体（CI-M6PR）部分覆盖，以及部分用内质网（ER）标记，KDEL，早期胚胎（EEA1），和晚期内体标记CD63。使用的其他标记（PDI，ERP72;数据未示出），内侧GOLGI（GM130）和LAMP-1，发现了一点分致原样CI-M6PR参与新合成的溶酶体水解酶的分选和运输，其含有甘露糖-6-磷酸盐部分 N-Glycan链条，其用作TGN-odosome运输和稳定状态的分类信号可以用作TGN的标记物（26）。灯是溶酶体整体膜糖蛋白，灯-1通常用作溶酶体标记物，而CD63（LIMP-I，LAMP-3）是富含鳞状内囊泡的鳞片内囊泡的成员，可从中出发tgn到溶酶体（27）。最近已经表明，灯-1和灯-2以单独的TGN衍生的囊泡存在于含有甘露糖磷酸盐受体和适配器蛋白AP-1（28）。
为了确认MICB的TGN定位，进行细胞亚离子分布，分析级分麦布和细胞器标记物（补充图3）。在富含TGN标记的级分中检测MICB，以及发现ER和早期胚胎标志物的级分。共聚焦显微镜和蜂窝分布数据将与TGN和晚期内体系统之间的MICB一致。
MICB在质膜上有一个短的半衰期
晚期内剂组/ TGN型细胞器中的MICB分子的存在表明，分子可能在内吞途径的各个隔间内行进，并且一些观察到的细胞内分子可以是从质膜下调的结果。在达到蛋白质到达蛋白质的命运后，通过共聚焦显微镜进行并分析AB吸收实验。在与AB孵育30分钟后，细胞内发现预先存在于质膜上的大部分MICB。然后将内化MICB用腔内隔室的标记进行了耗地（补充图4， A 和 B）。在短暂的培养时间下，在与CI-M6PR结合的囊泡中观察到MISB，尽管在孵育时间较长时间后，注意到MICB和CI-M6PR之间的一些分致化。
在流式细胞术实验中还研究了MICB内吞作用的动力学。用MICB转染的721.221细胞用PE标记的MICB特异性AB染色并孵育不同的时间次化以允许内化。在指示时间后，通过酸性洗涤除去血浆膜的AB（29）通过流式细胞术检测残留在内部隔室中的AB。通过酸性洗涤有效地除去表面约定的AB，而不会影响细胞的存活率（在0分钟，94％的细胞损失酸洗后的所有染色，仍然可行），孵育后允许内化，内吞发麦克风仍然观察到染色（补充图4c）。
要排除所观察到的蛋白质的内化是由于与AB交联，在与AB无关的生化测定中研究了现象。细胞是用可切割的生物素标记的表面，并且在37℃温育后允许蛋白质的内化，用mesna（细胞 - 缺乏还原剂）处理细胞以从残留在等离子体上的标记蛋白中除去生物素部分膜，之后只检测到细胞内标记的蛋白质。作为正确消除表面标记的蛋白质的对照，将细胞在4℃下孵育并用mesna处理。未检测到生物素化蛋白质，表明没有内化MIC蛋白（图3⇓A, lane 2）。作为阳性对照，在4℃温育但未用mesna治疗的细胞显示细胞表面生物素化的MIC的总量（图3⇓A, lane 1）。该实验表明，在37℃温育后，在用MESNA处理的细胞中对应于内化蛋白质的条带。该结果证实了MICB内化的能力。在这些实验中观察到的各种尺寸的MICB带可能代表诸如糖基化的后期修饰。然而，从该实验中也是明确的，即在37℃的孵育期间损失大量的MIC蛋白。这可能包括降解和脱落到细胞外培养基。
MICB在质膜上有一个短的半衰期。 A，可切割生物素化。用二硫化物 - 生物素标记U373-MICB细胞。使标记的蛋白质在37℃下将2小时内化，并且在该时间段之后，通过用mesna处理除去表面生物素。生物素化MICB（左侧面板）和总MICB（右侧小组）通过Western印迹（WB）评估。可以在与mesna未处理的4℃对应于4℃的控制器中观察到表面生物素化的总量（ lane 1）;除去所有表面生物素化标记对应于4℃的对照，用MESNA处理（lane 2）。可以在与在37℃温育后对应于用MESNA处理的细胞对应的通道中观察到与内化MICB对应的条带。该实验代表了四个实验。 B，用BFA，BFA和CHX（BFA + CHX）和CHL处理U373-MICB细胞后表面MIDB分子的流式细胞术分析。与所示时间的化合物温育后，用抗云母/ B AB染色U373-MICB细胞。用细胞系721.221获得类似的结果。数据代表三个实验。 C插入 显示使用来自未经缩合的细胞（MED）和U373-MICB转染子组织培养上清液的抗云母/ B AB的SDS-PAGE和Western印迹分析。表示50kDa分子量标记。用CV1-MICB转染剂获得类似的结果。实验重复三次。 D，MICB的成熟在CHL存在下不会改变。脉冲追逐实验，然后是MICB的免疫沉淀（见 材料和方法) from cells either untreated or treated with 100 μm chl（提高溶酶体的pH）。蛋白质在SDS-PAGE中解决。该实验进行了两次。
鉴于已知麦克风蛋白从细胞表面脱落（15, 16），我们接下来研究了这个系统中MIC表达和脱落的动态。为了评估细胞表面上MICB分子的稳定性，使用环己酰亚胺（CHX，阻断蛋白质合成），BREFELDIN A（BFA，囊泡运输抑制剂）和两者的组合进行流式细胞术实验（图3⇑B）。有趣的是，用BFA和CHX治疗在4小时后导致MICB的显着损失，单独用CHX治疗（数据未显示）。表面MICB的显着成分必须参与囊泡运输，因为单独在实验中包含BFA，也引发了表面染色的显着降低。在试验中获得了类似的数据，其中721.221细胞转染MICB（数据未显示）。这些数据表明，MICB与I类MHC蛋白质不同，其在血浆膜保持稳定于18-24小时（30）。在实验中还包括提高晚期内体和溶酶体的pH的蛋白质降解的抑制剂，例如弱碱氯喹（CHL），损害其功能，损害其功能。细胞表面上MICB的稳定性不受该化合物存在的影响。通过ELISA分析MICB对组织培养基的脱落（图3⇑C）。在孵育1小时后观察到MICB的显着脱落，并且该可溶性MIC随时间累积（图3⇑, 插入）。用BFA，CHX或CHL治疗没有抑制脱落。 MICB存在于溶酶体相关的细胞器中的事实，但是当加入CHL时，表面和可溶性蛋白水平不会改变，表明蛋白质必须通过这些隔室贩运，而不是仅在溶酶体中降解。通过CHL处理无法改变在脉冲追踪实验中观察到的MICB的损失来证实了这一点（图3 ⇑D）。追逐3小时的MICB的显着损失证实了BACS实验表明的MICB分子的短半衰期。
所有这些数据都表明，在稳态，MICB仅在血浆膜处留下短时间，并且细胞表面的MICB的量最可能受到内吞炎和蛋白质损失的组合（通过降解和脱落） ）。
MICB内吞作用和克拉林依赖性途径
接下来研究了MICB内吞作用的机制。通常认为，基于克拉辛的依赖性或独立性有两个主要的内吞途径（用于审查，参见参考文献。 31, 32, 33, 34, 35）。通过使用突变体或药物可以探索这两种过程，所述突变体或药物干扰途径正确功能所需的特定组分（在REF中审查。 36）。
因为云母/ B分子的细胞质尾部含有可以结合AP2的偶琥酮基质，所以首先研究了克拉林依赖性内吞作用，这是一种需要各种适配器蛋白质的过程和芽煮成囊泡的涂层坑的产生。
EPS15是一种适配器蛋白，其在克拉林依赖性内吞作用的早期步骤所需的克拉棘涂层凹坑中。 EPS15的eH29显性阴性突变体影响克拉林涂层坑的组装，强烈抑制转移素受体内化（37, 38）。在AB吸收实验中研究了该构建体对MICB内吞作用的影响，其中EPS15（DIIIδ2）的无活性变体用作对照。为了鉴定转染的细胞，通过GFP标记EPS15的这些变体（图4A⇓）。在AB吸收20分钟后，我们可以观察MICB在模拟转染的细胞中的积累和表达无活性突变体的细胞，而在用EH29转染的细胞中，相当大比例的MICB仍然在质膜上。在补充图中。如图5和6所示，描绘了通过整个细胞内区域执行一系列部分的并行实验。在这些实验中，仍然可以在抑制EH29突变体中抑制克拉汀后观察一些细胞内MIDB，但不如在无活性突变体DIIIIδ2中那样多。由于Clathrin封锁未完全消除MIC内吞作用，因此这些数据表明可能涉及另一个内化机制。
MICB内吞作用和克拉仑介导的途径。 A, U373-MICB cells were transfected with the indicated dominant-negative mutants. EH29 affects the generation of coated pits by inhibiting Eps15; the inactive variant of Eps15 (DIIIΔ2）用作对照。所有显性阴性突变体都表示为GFP的融合，以允许转染的细胞的可视化。将细胞与抗MIC AB孵育4°c，然后在37岁的上摄取ab°C持续20分钟。之后，将细胞固定，透透化并用仲腺染色，偶联至Alexa氟568（红色）并通过共聚焦显微镜分析。用CV1-MICB转染剂获得类似的结果。秤栏，20μm. This experiment was performed four times. B, Flow cytometric estimation of MICB internalization. U373-MICB cells were transiently transfected with plasmids to disrupt endocytosis by overexpression of AP180 C terminus, epsin1 R63L + H73L, epsinR, and EH29. The reduction of MICB at the plasma membrane produced by incubation of cells at 37°通过流式细胞术确定C持续30分钟。条形条表示表面受体荧光的减少（相对于在4中持有的对照U373-MICB细胞°C). ∗∗, p < 0.05 in a t 与模拟相比。在GM6001的存在下培养细胞以抑制30分钟的孵育期间的金属蛋白酶介导的脱落。数据是重复获得的，并且代表两个实验。 C，将U373-MICB细胞用8μg/ ml CHL预孵育30分钟。治疗后，将AB上的实验如下进行 A. Scale bar, 40 μm。该实验重复三次。
为了估计通过克拉肽内化的MICB的量，进行流式细胞术实验。用编码AP180 C末端的质粒瞬时转染U373-MICB细胞（抑制Clathrin依赖性萌芽事件），EPSIN1 R63L + H731（抑制AP2萌芽事件），EPSINR（抑制AP1萌芽事件）和EH29（图4⇑B）。我们观察到用AP180，EPSIN1 R63L + H731和EH29转染细胞中细胞表面MICB内化的显着降低。
同时，还进行了使用其他方法干扰克拉仑介导的内吞作用的实验。高渗培养基通过防止克拉汀与内吞作用所需的适配器的相互作用来促进克拉仑涂层囊泡和血浆膜涂层坑的消失。39）。 Clathrin依赖性内吞作用也可以通过使用氯丙嗪（40）。因此，在氯丙嗪存在下也进行AB吸收实验（图4⇑C）和0.32米蔗糖（补充图7A）。这些药物的存在损害了MICB的摄取，确认先前获得的数据。
MICB内吞作用和克拉辛无关的途径
Clathrin-Informy ogocytosis包括一组仍然不具备很好的途径，但通常与称为脂质筏/ Caveolae的血浆膜结构域相关。这些微氮瘤富集胆固醇，鞘脂和Caveolin（参见Refs。 41 and 42）。通过脂质筏/ caveolae的内吞作用经常使用破坏或耗尽胆固醇在质膜上的试剂来定义。
要了解“Caveolin介导的”内吞作用涉及MICB的下吞作用，我们研究了蛋白质在甲基-β-环糊精（MβCD）存在下从质膜中再循环的能力。 MβCd与胆固醇结合，并选择性地从质膜的外叶片中提取。我们观察到，用MβCD累积MIDB在质膜上预孵育的细胞（图5⇓A），表明胆固醇在贩运MICB中的作用。作为对照，荧光标记的转移素和霍乱毒素被包括在实验中。如预期的那样，当存在MβCD时，大部分霍乱毒素保留在质膜处，表明其摄取的效率较低。然而，转化素，通过克拉棘涂层凹坑内化的蛋白质，确实被内化，尽管效率低于对照细胞。先前已经表明，急性耗竭胆固醇也降低了转铁蛋白的内化率（43, 44）。在补充图7中B，描绘了通过整个细胞内区域执行一系列部分的平行实验。流式细胞术分析证实，用MβCD处理减少了MICA / B特异性的MAb的摄取（图5⇓B）。
MICB内吞作用和克拉林无关的途径。 A，将U373-MICB细胞预孵育30分钟，用10mM M 4 Cd预孵育。对于标记，如图所示，在预孵育期间加入荧光菊芋或荧光转移素。如图4所示进行了AB吸收实验。4A. B, Flow cytometric estimation of MICB internalization. U373-MICB cells were treated with either MβCd或蔗糖。通过在37时孵育细胞产生的血浆膜的MICB的减少°通过流式细胞术确定C持续30分钟。条形条表示表面受体荧光的减少（相对于在4中持有的对照U373-MICB细胞°C）。在GM6001的存在下培养细胞以抑制30分钟的孵育期间的金属蛋白酶介导的脱落。∗∗, p < 0.05 and ∗∗∗, p < 0.005 in a t 与模拟相比。数据是重复获得的，并且代表两个实验。秤杆，40μm。
这些结果表明MICB通过Clathrin介导的胆固醇依赖性途径内化。先前已经描述了这种机制用于进入细胞中的病毒和细菌毒素（45, 46）。
MICB与DRMS关联
发现贩运MICB可能受到脂质环境影响的发现导致我们探讨该蛋白质与DRM结构域的关联。 DRM是富含胆固醇和鞘脂的微滴，尤其是GM1神经节苷脂（41, 42）。在使用洗涤剂如Triton X-100或Brij-58（以下）后，可以通过蔗糖梯度超速离心通过蔗糖梯度超速离心分离DRMS。47）。 Caveolin-1，Caveolae的组分通常在DRM中发现，可用作分馏效率的标记。如图6所示⇓，在富含GM1鞘脂和Caveolin-1的洗涤剂 - 不溶性级分中发现了比例的MICB。该发现证实了至少一些MICB分子在富含胆固醇的膜的结构域中的位置。
MICB与DRMS的关联。在含有1％Brij-58的缓冲液中裂解U373-MICB细胞，并使用常规均化器均化。样品在不连续的蔗糖梯度中分离。收集级分，并在SDS-PAGE上分离蛋白质。使用ABS针对云母/ B和Caveolin-1（Cav-1）进行蛋白质印迹。通过在点污点上检测Cholera毒素-HRP对神经节苷脂GM1进行分馏的效率。该结果代表至少五个独立的实验，并用CV1-MICB转染剂获得类似的结果。
讨论
考虑到通过其受体在细胞表面处的NKG2D-L识别导致靶细胞杀死，必须存在非常紧张的这些蛋白质表达的调节。在表达mRNA的细胞的文献中有一个或多个NKG2D-L的细胞的实例，但不显示血浆膜在蛋白质中的任何表达（48）。涉及NKG2D-L RNA降解的后期改性机制是作为调节细胞中这些蛋白质的量的方式（14）。在该研究中，我们提出了在细胞表面存在的MICB的量也可以通过蛋白质的贩运的特定特征来调节。实际上，该研究的主要发现是MICB在细胞表面的近时段的时间，通过蛋白质合成抑制剂孵育时，通过血浆膜的快速损失证实。几种细胞过程似乎参与了来自细胞表面的MICB的损失，包括对细胞内隔室的内化并脱落到细胞外培养基。
我们表明MICB是通过TGN和内体/溶酶体系统的内吞和贩运，但大多数可能回收回到质膜，因为囊泡行动的抑制剂会影响细胞表面上MICB的量（图2⇑B）。很明显，MICB不存在于溶酶体中（含有成熟的酸依赖性水解酶和灯的膜结合的酸性细胞器，但缺乏甘露糖-6-磷酸盐受体），因为它与CI-M6PR结合并且溶酶体pH的增加没有影响MICB的表达和脱落。因此，MICB可以存在于专用隔室中，该专用隔室共享晚期内体/溶酶体的特征，但在功能上和形态上是不同的，例如MHC II类隔室或其他分泌细胞器（49, 50）。然而，多条路线在TGN中收敛，重要的是进一步表征途径后跟这些分子。
调用靶细胞血浆膜的MICB的短半衰期可能对免疫系统识别的功能直接影响。鉴于NKG2D-L是细胞应激的指示，它们在细胞表面的短暂持续性表明持续的表达需要持续的应力。这可能是在细胞损伤的瞬态局势期间最小化细胞免疫消除的机制。此外，MICB蛋白的快速丧失可能对识别影响转录/翻译细胞机制的病原体至关重要。例如，已经知道Herpesviruses关闭细胞蛋白的合成（51）。在这种情况下，即使在诱导MIC转录后，MICB的短半衰期也意味着表面蛋白的快速丧失。
关于NKG2D识别的大量配体的突出问题以及几种病原体已经进化以影响特定配体的方式（18, 19）。例如，虽然只发现了一个HCMV产品向下调制云母（52），几种机制靶向MICB，包括UL16（21, 53）最近发现了病毒编码的微RNA（54）。这里描述的MICB贩运的特征可能有利于细胞质隔室内的劫持器UL16蛋白，或者可选地，病毒蛋白可以简单地增强已经发生在未感染的细胞中的过程。
这项工作的另一个发现是，MICB内吞作用的机制依赖于克拉汀，但也受到胆固醇的影响。先前已经报道了脂质在Clathrin介导的途径中的参与，特别是对于毒素和病毒对细胞质的吸收（45, 46）。此外，载脂蛋白E受体2的内化通过与Caveolar和Noncovolar脂筏相关后的克拉仑介导的途径内化（55）。因此，最近的数据支持存在“杂种”内吞作用和贩运细胞中的贩运途径，其机制和功能意义仍然不清楚。已经提出了云母与膜脂质结合的可能性（56）;然而，DRM中的MIC蛋白的存在未表明生物化学上。在这项研究中，我们可以观察到DRM中的MICB比例，未来的工作将侧重于探索这一发现的程度和意义。还需要进一步的研究来充分了解MICB与脂质联系的机制以及对贩运和组织在血浆膜中的影响。
致谢
我们感谢N. Miller援助细胞分类; P. Luzio用于CI-M6PR特异性AB; E.Veiga，R.Cassady-Cain，P.Roda-Navarro，以及C. Chan乐于助听的讨论; J. Trowsdale和A. Kelly对此稿件的批判性阅读; J. Skepper辅助定量分析;和T. Fischer有用的讨论。
披露
作者没有财务利益冲突。
脚注
本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此，本文必须明白 广告 按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
↵1 这项工作由白血病研究基金项目补助金（H.T.R.和M.V.G.）资助。 M.V.G.是来自医学研究委员会的新调查员授权的受援人员和皇家社会的国际联合项目。 S.A.来自FundaciónCaja马德里和Ibercaja的团契支持。 P.B.由牛顿信任部分得到支持。
↵2 s.a.-g.和p.b.贡献与所呈现的工作相同。
↵3 地址通信和转载对MarValés-Gómez，剑桥大学，网球场路，剑桥大学CB2 1QP，联合王国
↵4 本文中使用的缩写：MICA / B，MHC I类链链相关基因A / B; Mesna，2，巯基乙烷磺酸; DRM，防污性膜; HCMV，人体CMV; TGN， trans-GOLGI网络; CI-M6PR，阳离子无关的甘露糖-6-磷酸盐受体; ER，内质网; EEA1，早期内剂组A1;灯-1，溶酶体活化膜蛋白1; CHX，环己酰亚胺; BFA，Brefeldin A; chl，氯喹; MβCd，甲基-β-环糊精。
↵5 本文的在线版本中包含补充材料。
- 已收到 2008年3月4日。
- 公认 2009年2月4日。
- 版权所有©2009由美国免疫学家，Inc。
