增加了CD4.⁺Foxp3..⁺ Baff-Transcanic小鼠中的Te乐彩下载抑制Te乐彩下载效应响应

老鼠

C57BL / 6和BALB / C小鼠购自动物资源中心（澳大利亚珀斯）。 Baff-TG小鼠（11）来自S. Kalled博士（Bieon Idec）和Be乐彩下载缺陷μmt的礼物 ^{- / -} 小鼠（JAX实验室）被培育并居住在我们的设施中。进行的所有程序和实验符合机构动物伦理委员会指导方针。

胰岛移植

诱导糖尿病，受体小鼠（H-2^b）用180mg / kg链脲酰基（Sigma-Chemical）注射在10mM柠檬酸盐缓冲液（pH4.2）中，使用血糖仪DEX（Bayer）测定血糖水平。血糖值≥360mg/ dl的小鼠和20-25g的体重作为移植受体。在移植日，胰岛由供体的胰腺（H-2）制备^d）每个受体的三个胰腺的比例。对于移植，通过左侧切口进入肾脏并通过轻微的钝切口进入伤口。在肾脏杆上在肾囊中制造一个小缺口，胰岛沉积在肾脏的上极杆上。在术后第1,2和5天分析血糖水平，然后每天进行分析直至排斥。肾切除术在术后第100天进行。

胰岛移植物的免疫组织化学分析

肾脏接枝区域的位置标有印度油墨（Eberhard Faber），肾脏固定在60％甲醇/ 10％乙酸中，30％氯仿24小时。使用标准方案将组织加工并嵌入石蜡中。整个移植区域被串联切割，并且通过H检查常规区域（跨越~75μm）的一般形态&E.

皮肤移植

准备移植物床，受体小鼠（H-2^b）用2.5％的冰水（200μl/ 100g; sigma-Aldrich）和浅表，方形切口麻醉地麻醉，露出左胸部制成panniculus carnosus。供体尾皮（H-2^d用Superglue（Superglue）制备并固定到移植物床上。

收养实验

抹布 ^{- / -} 用胰岛移植物移植小鼠。通过用1×PBS的磨砂玻璃载玻片（Menzel-Glaser）的机械破坏来制备脾e乐彩下载。通过过滤通过70μm尼龙过滤器（Falcon，BD Biosciences）来获得单e乐彩下载悬浮液。用无菌RBC裂解溶液通过渗透裂解除去红e乐彩下载。使用FACSVANTAGE SEe乐彩下载分选仪分离Te乐彩下载（具有Facsdiva选项; BD Biosciences），运行BD Facsdiva软件版本4.1.2（BD Biosciences）和激光激光线：蓝二极管（488nm）和HENE（633nm） ;喷嘴尺寸：70μm;温度：4°C。脾e乐彩下载（2×10⁷）和Te乐彩下载（2×10⁶）通过尾静脉注射养殖。

混合淋巴e乐彩下载反应

MLRS以2×10的标准浓度进行⁵ 在96孔板中的每个孔的刺激器和响应者e乐彩下载。在使用γ辐射（250 rad）接种之前，刺激e乐彩下载灭活。对应于最大增殖的最佳测定持续时间为4-5天。

体外Te乐彩下载测定

对于体外Te乐彩下载增殖反应，使用MACS Pan-Te乐彩下载分离试剂盒（Miltenyi Biotec）纯化脾脏Te乐彩下载。然后以2×10的密度在0.2ml标准培养基中培养Te乐彩下载⁵ e乐彩下载/孔在96孔板（Costar）中并用抗CD3（0.1-10μg/ ml）或抗CD3（0.1-10μg/ ml）加上抗CD28（2μg/ ml）的抗CD3（0.1-10μg/ ml）72小时。e乐彩下载脉冲 ³H对最后6小时和数据表示三份培养的增殖（CPM）。

DTH回应

用CFA中的小鼠BSA（MBSA）免疫小鼠（12）然后在7天后挑战一个S.C.注射MBSA;通过分析攻击后8和24攻击后8和24来确定第dth响应的产生。

流式e乐彩下载仪

根据标准方案制备脾e乐彩下载和淋巴结和胸腺的e乐彩下载悬浮液，并使用以下ABS（除非另有说明）染色含有0.5％BSA，2mM EDTA和0.02％叠氮化物的PBS的FACS分析（除非另有说明）： PE-，PE-CY5.5，或Alexa Fluor 405缀合的抗CD4（分别为RM4-5; eBioscience和Caltag实验室），FitC-，苯并聚苯吡啶或生物素缀合的抗CD25（PC61.5）， FitC-或嗜键合粘蛋白-CY7-缀合的抗CD8（53-6.7; eBioscience和BD Biosciences），FitC-或联合菌蛋白 - 缀合的抗CD44（IM7），FITC-或生物素 - 缀合的抗CD122（TM-β1 ; BD生物学），PE-或联合蛋白 - 缀合的抗FOXP3（FJK-16S），FITC-缀合的抗CD54（YN1 / 1.7.4），抗CD38（90），抗CD86（GL1），抗 - CD80（16-10A1），PE缀合的抗CD152（CTLA-4，UC10-4B9），抗CD62L（MEL-14），抗CD45RB（16A; BD Biosciences），抗PD1（J43），抗-ICOS（7E.17G9; BD Biosciences），抗CD127（A7R34），抗C. CR5（HM-CCR5（7A4）），生物素 - 缀合的抗CD103（2E7），抗CD69 H1.2F3），抗糖皮质激素诱导的TNFR（GITR; DTA-1），抗CD27（LG.3A10），生物素 - 共轭鸡抗TGFβ（R&D Systems），Fitc-RatIgG2aκ，Fitc-ratIgG2aκ，Pe-RatIgG2aκ，Pe-RatIgG2Bκ，Biotin-Rat IgG2a，Pe-Ar Ham Igg1，生物素 - 共轭鸡Igy（IgG）（杰克逊免疫研究实验室）和太平洋蓝色 - 缀合的链霉抗生物素蛋白（分子探针）。从eBioscience购买了联素键合氨苄蛋白 - 抗药和PE-抗小鼠/大鼠Foxp3染色套，并根据制造商的说明进行议定书。在Facscan（BD Biosciences）上获取样品，并通过Flowjo软件（树星）分析数据。

特雷格斯的消耗

用于耗尽CD4⁺CD25.⁺ Te乐彩下载，用纯化的大鼠抗小鼠CD25 IgG1 mAb（PC61; BioExpress）I.P注入小鼠。 （250μg）。通过流式e乐彩下载术确认CD25耗竭的功效。体外耗尽的CD4⁺CD25.⁺ 使用FACSVANTAGE SEe乐彩下载分选仪分离Te乐彩下载（具有Facsdiva选项; BD Biosciences），运行BD Facsdiva软件版本4.1.2（BD Biosciences）和激光激光线：蓝二极管（488nm）和HENE（633nm） ;喷嘴尺寸：70μm;温度：4°C。

抑制试验

CD4⁺CD25.⁻ 效应器Te乐彩下载和CD4⁺CD25.⁺ 使用FACSVANTAGE SEe乐彩下载分选仪分离Te乐彩下载（具有Facsdiva选项; BD Biosciences），运行BD Facsdiva软件版本4.1.2（BD Biosciences）和激光激光线：蓝二极管（488nm）和HENE（633nm） ;喷嘴尺寸：70μm;温度：4°C。 CD4.⁺CD25.⁻ 效应器Te乐彩下载（2×10⁵）用抗CD3（1μg/ mL）刺激，并随着CD4的数量增加来源⁺CD25.⁺ Te乐彩下载。e乐彩下载脉冲[³H]胸苷过去6小时。 ³H IncorAlation（CPM）在72小时内测定。

免疫印迹

通过e乐彩下载分选对Facsvantage或Facsariae乐彩下载分选仪（BD Biosciences）分离e乐彩下载群。用放射免疫沉淀测定法制备（25mM HEPES，250mM NaCl，2mM EDTA，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS，1％Nonidet P-40,100μg/ mL AeBSF，10μg/ ml leapeptin，制备全e乐彩下载裂解物，1mM钙钠钠和10mM氟化钠）。在Xcell Surelock Minicell设备（Invitrogen）中，将所有裂解物在4-12％梯度腹腹BIS-TRIS凝胶（Invitrogen）上进行页，并用Xcell II印迹模块（Invitrogen）转移到Immobilon-P聚偏二氟乙烯二氟化乙烯膜（Millipore）上。膜被封闭，并且在5％BSA / 0.2％Tween 20 / TBS中稀释ABS。

骨髓嵌合体

用950 rad和24小时核心辐照，以后用5×10重构⁶ bone marrow cells.

统计数据

使用学生进行Te乐彩下载亚群的统计分析 t Instat（版本2.01）软件（GraphPad软件）测试。接枝存活被绘制为Kaplan-Meier曲线并使用Statview软件（SAS Institute）上的日志等级测试分析。

BAFF-TG小鼠具有改变的同种异体反应，有利于同种异体移植耐受性

为了确定BAFF在调节Te乐彩下载免疫反应中的作用，我们检查了BAFF-TG小鼠拒绝异种移植物的能力。对同种异体移植物的抑制取决于宿主和供体APCS呈递的供体MHC测定仪的Te乐彩下载响应，因此它是研究Te乐彩下载活化和功能的优异模型。 Baff-Tg小鼠在肝脏特异性α1抗抗核蛋白启动子和Apolipo-inder e增强剂的控制下表达全长鼠BAFF（11）。这导致血清中的高循环水平;实际上，在C57BL / 6（WT）小鼠中，发现平均BAFF浓度为〜〜4-5ng / ml，由ELISA测定（ p < 0.05, n ≥ 5/group).

完全不匹配的BALB / C（H-2^d）将胰岛同种异体移植物移植成两组（H-2^b）糖尿病受体：wt和baff-tg小鼠（图1⇓A）。 WT小鼠被拒绝接枝，平均存活时间（MST）为20±3.8天（n = 12）。在标记对比中，大多数（〜60％， n = 15）Baff-Tg小鼠（H-2^b）未能敏锐地拒绝他们的胰岛同种异体移植物，而是表现出巨大和长期的同种异体移植物存活≥100天（p = 0.001）。通过移植移除后通过重新血糖重新血糖检测来测试长期移植物的功能。存活移植物的组织学分析显示正常胰岛素形态（图1⇓B）;然而，存在周围的单核e乐彩下载的显着积累，但不渗透，胰岛移植物没有明显排斥的证据。

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图1。

BAFF-TG小鼠是对同种异体移植物的耐受性。 A，异种胰岛移植物存活在BAFF-TG（n = 15) vs WT mice (n = 12; p = 0.001）。 B，代表性组织学部分的显微照片通过含有肾上腺的肾上腺部分在移植后100天从BAFF-TG小鼠收获的肾上腺部分。部分用h染色&E. I，胰岛移植物; MNC，单核e乐彩下载积累; K，肾脏薄壁。 C，异种皮肤移植存活在BAFF-TG（n = 7) vs WT (n = 9; p = 0.0058).

皮肤移植代表比胰岛移植更严格的同种异体移植模型。因此，我们接下来检查了Baff-TG小鼠拒绝H-2的能力 ^d skin grafts (Fig. 1⇑C）。我们发现wt收件人拒绝了H-2^d 皮肤同种异体移植物〜12天。类似于它们对胰岛同种异体移植物的改变的反应，Baff-Tg小鼠在表现出〜20天的MST的皮肤同种异体移植物中表现出显着的延迟（n = 7; p = 0.0058）。因此，与Baff对Be乐彩下载活化的明确定义促炎作用不同，过量的BAFF改变了Te乐彩下载依赖性的同种疫反应，有利于胰岛同种异体移植的长期存活和延迟抑制皮肤同种异体移植物。

BAFF-TG小鼠中的改变的血偶抗原反应是Te乐彩下载内在

未能拒绝胰岛同种异体移植物被显示为e乐彩下载自主（图2⇓A），作为Baff-Tg脾e乐彩下载的通过转移（2×10⁷）进入H-2^b RAG ^{- / -} 接受者以前收到的H-2^d 胰岛同种异体移植，导致〜60％（n = 5; p = 0.0101）长期移植物接受。这种表型是可转移的，因为从BAFF-TG小鼠的脾e乐彩下载普及脾e乐彩下载接受100天接受100天的脾e乐彩下载导致100％移植物验收（n = 4; p = 0.0042）。相比之下，所有抹布 ^{- / -} 从WT供体接受脾e乐彩下载的小鼠迅速拒绝其同种异体移植物（图2⇑B）。转移FACS纯化的Te乐彩下载（2×10⁶ 总共来自WT小鼠足以促进快速排斥胰岛同种异体移植物。然而，来自Baff-TG小鼠的Te乐彩下载无法拒绝其同种异体移植物; rag〜80％ ^{- / -} 接受BAFF-TG Te乐彩下载的接受者接受了他们的同种异体移植物>100 days (n ≥ 5; p = 0.0025）。然后我们检查了纯化的Baff-TG Te乐彩下载对H-2的能力^d 在MLR中的AlloAntigen（图2⇓C）。与来自WT小鼠的Te乐彩下载相比，来自Baff-TG的Te乐彩下载没有将可检测的MLR响应安装到H-2^d BALB / C刺激器。总的来说，这些数据表明，Baff-Tg小鼠无法拒绝同种异体移植物涉及一种内在变化的内在变化。

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图2。

同种异体移植耐受性是Te乐彩下载依赖。 A，rag. ^{- / -} 小鼠接受了胰岛同种异体移植物和7–14 days later were reconstituted with BAFF-Tg (n = 5）或wt脾e乐彩下载（n = 3; p = 0.0101). Splenocytes from BAFF-Tg mice that were tolerant of their allografts (≥100天的生存）被转移到抹布 ^{- / -} 接受者移植同种异体胰岛移植物（n = 4; p = 0.0042）。 B，rag. ^{- / -} 小鼠接受了胰岛同种异体移植物和7–14 days later were reconstituted with BAFF-Tg (n = 6) or WT T cells (n = 5; p = 0.0025）。 C，来自Baff-Tg和Wt小鼠的Te乐彩下载的MLR响应刺激48和72小时，BALB / C脾e乐彩下载（刺激器）。所示的数据代表五个实验。

Baff-TG Te乐彩下载的增殖反应

研究了Baff-Tg小鼠改变能力以安装同种异体移植或MLR响应的机制。我们检查了从Baff-Tg小鼠中分离的纯化脾脏Te乐彩下载的体外增殖反应（图3⇓A）。与MLR中的不良反应相反，我们发现纯化的BAFF-TG Te乐彩下载与从WT小鼠分离的Te乐彩下载相比，对抗CD3或抗CD3加抗CD28的等效增殖响应。接下来，通过观察DTH反应，检查Baff-TG Te乐彩下载响应于抗原攻击而增殖的能力（图3⇓B）。我们发现，就像Wt小鼠一样，Baff-TG小鼠可以安装快速和强大的DTH响应。这些实验一起表明，BAFF-TG Te乐彩下载可以正常对TCR刺激进行响应，它们不仅仅是完全的干燥剂，而且它们不会涉及Te乐彩下载功能的任何总异常。

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图3。

BAFF-TG Te乐彩下载不是白蛋白。 A，来自Baff-Tg和wt小鼠的Te乐彩下载的增殖测定（CPM）用抗CD3或抗CD3加抗CD28刺激72小时。数据代表了来自进行的三个独立实验中的一个的平均值±SEM。组分之间的增殖反应在统计学上并不不同。 B，体内Te乐彩下载增殖反应（DTH）。 baff-tg（n = 5) and WT (n = 5）用MBSA在CFA中免疫小鼠，并在7天后用MBSA攻击。在挑战后确定了脚垫肿胀8和24小时。数据代表平均值±SEM Footpad膨胀。组分之间的增殖反应在统计学上并不不同。 C，rag. ^{- / -} 小鼠接受了胰岛同种异体移植物和7–14 days later were reconstituted with BAFF-Tg (n = 5) or WT CD4⁺CD25.⁻ effector T cells (n = 5）。拒绝响应在组之间没有统计学不同。

BAFF-TG效应器Te乐彩下载可以介导同种异体移植物破坏

测试BAFF-TG效应器Te乐彩下载的能力，将同种异体移植物破坏颠簸，抹布 ^{- / -} 先前已经用同种异体胰岛移植移植的小鼠用2×10进行了用2×10⁶ BAFF-Tg or WT CD4⁺ CD25⁻ 效应器Te乐彩下载（图3⇑C）。 WT效应器Te乐彩下载迅速拒绝胰岛同种异体移植物。 BAFF-TG CD4⁺CD25.⁻ 效应器Te乐彩下载在介导的同种异体移植排出中作为WT效应Te乐彩下载同样有效;实际上，所有接受BAFF-TG CD4的小鼠⁺CD25.⁻ 效应器Te乐彩下载迅速拒绝他们的同种异体移植物（n = 5; p = 0.8984），证明Baff-Tg效应器Te乐彩下载在功能上能够拒绝同种异体移植物。因此，Baff-Tg小鼠无法拒绝同种异体移植物的不可能是由于效应Te乐彩下载的相对缺乏或缺陷。

增加周边Foxp3数量⁺ Baff-Tg小鼠中的Te乐彩下载

为了阐明BAFF调节Te乐彩下载功能的机制，我们检查了BAFF-TG小鼠的外周Te乐彩下载盒（图4⇓A）。外围CD4的绝对数量没有更改⁺ (n ≥ 6; p = 0.8362) and CD8⁺ (n ≥ 6; p 与WT小鼠相比，Baff-Tg小鼠中的= 0.8085）。但是，与之前的报告相同（6, 13）（图4⇓, B 和 C），我们发现BAFF-TG小鼠表现出成熟Be乐彩下载的频率增加以及周边中的幼稚和内存Te乐彩下载的改变比率。

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图4。

Baff-Tg小鼠中的膨胀频率和Treg数。 A，e乐彩下载编号CD4⁺ (左侧面板）和CD8⁺ (右侧面板）来自BAFF-TG和WT小鼠的Te乐彩下载。计算的绝对数字在组之间没有统计学不同。 B，与WT小鼠相比，Baff-Tg小鼠在周边的成熟Be乐彩下载的频率增加。 C，与WT小鼠相比，Baff-Tg小鼠表现出周边的幼稚和内存Te乐彩下载的改变比。 D， 频率 （p = 0.0004）并计算绝对数字（p 脾脏CD4的= 0.029⁺CD25.⁺ 来自WT和Baff-Tg小鼠的Te乐彩下载。 E， 频率 （p = 0.0009）并计算绝对数字（p 脾脏CD4的= 0.029⁺Foxp3..⁺ 来自WT和Baff-Tg小鼠的Te乐彩下载。 F，WT和BAFF-TG CD25上Treg标记的流式e乐彩下载术分析⁺Foxp3..⁺ T cells.

令人惊讶的是，我们对脾脏Te乐彩下载种群的分析（图4⇑D）揭示了Baff-Tg小鼠的增加〜2.5倍（n ≥ 6; p CD4的频率= 0.0004）⁺CD25.⁺ 与WT小鼠相比，Te乐彩下载相比，Baff-Tg小鼠中位数为17％，与WT小鼠的〜7％相比。这种增加也反映在绝对数量，作为CD4的数量⁺CD25.⁺ Te乐彩下载在Baff-Tg小鼠中〜2倍（n ≥ 6; p 与WT小鼠相比，= 0.029），中位数是〜0.77×10⁶ vs ∼0.35 × 10⁶， 分别。因此，Baff-Tg小鼠具有膨胀数量的Te乐彩下载，具有表面表型让Centcencencecencencencence联系。

Tregs可以通过它们表达T调节谱规范规范Foxp3（12）。我们发现了（图4⇑E）在Baff-Tg小鼠中表达Te乐彩下载的脾foxp3的频率增加〜3倍（n ≥ 6; p = 0.0009），中位数在WT小鼠中的BAFF-TG小鼠中的〜30％。同样，Foxp3的绝对数量⁺ Te乐彩下载增加〜3倍（n ≥ 6; p = 0.028）从〜0.46×10的中间⁶ 在wt小鼠到〜2×10⁶ in BAFF-Tg mice.

Baff-TG Tregs的表型剖面

我们接下来将与Treg函数相关的e乐彩下载表面分子的表达与CD25进行了比较⁺Foxp3..⁺ 来自Baff-Tg vs Wt小鼠的Te乐彩下载（图4⇑F）。我们发现BAFF-TG CD25⁺FoxP3⁺ Te乐彩下载表达与Treg表型的分子，例如CTLA4，GITR，CD122和CD45RB^低的。除此之外，BAFF-TG CD25⁺Foxp3..⁺ Te乐彩下载显示出许多功能重要分子的标记标记。与WTe乐彩下载相比，较大的频率显示ICAM-1，CD38，CD103，GITR，PD-1和CD44的高水平表达，其指示激活状态增加。符合此解释，CD62L的频率^低的CD69^高的CD25.⁺Foxp3..⁺ 与WT小鼠相比，Baff-Tg小鼠中的Te乐彩下载大大增加。

消除CD25⁺ Te乐彩下载将正常的同种异体移植响应恢复为BAFF-TG小鼠

在体内检查了Baff-TG小鼠中扩增Treg群的显着性和功能。为了实现这一点，将Baff-Tg小鼠施用抗CD25mAb PC61（250μgi.p.）以消耗CD25⁺ cells (Fig. 5⇓A[遵循接枝存活（图5⇓B）。我们发现〜60％的控制未经治疗的BAFF-TG小鼠展示了其胰岛同种异体移植物的长期存活。相比之下，所有PC61治疗，BAFF-TG小鼠迅速拒绝了他们的同种异体移植物（n = 5; p = 0.0001）与具有或没有PC61处理的WT小鼠观察到的动力学相似。这些数据表明CD4的扩展数量⁺CD25.⁺ 由Baff-Tg小鼠覆盖的e乐彩下载可以防止同种异体移植物排斥。

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图5。

BAFF扩大的TREG控制偶开性。 A，消除外围CD4⁺CD25.⁺ 施用抗CD25 mAb PC61后Te乐彩下载。 B，同种异体胰岛移植物存活;在baff-tg小鼠（n = 5）用PC61处理的VS BAFF-TG小鼠（n = 5; p = 0.0001）。同种异体胰岛移植物存活;在wt小鼠（n = 5）用PC61处理的vs WT小鼠（n = 5）没有统计学不同。 C，在抹布中的胰岛异种移植物生存 ^{- / -} 用Baff-TG Te乐彩下载重构的小鼠（n = 6) vs CD4⁺CD25.⁺ - 浸润的BAFF-TG Te乐彩下载（n = 4; p = 0.0167）或WT Te乐彩下载（n = 4) vs CD4⁺CD25.⁺-dlepleted wt te乐彩下载（n = 4）没有统计学不同。 D, CD4⁺CD25.⁺ 通过固定数量的抗CD3处理的CD4孵育来自Baff-Tg或Wt小鼠的Te乐彩下载⁺CD25.⁻ Te乐彩下载加上辐照的脾e乐彩下载作为APCs 72小时。过去6小时和培养物脉冲 ³H incorporation (cpm) was assayed. Data represent mean ±来自三种独立实验中的一个三份培养的SEM。

作为一种替代方法，2×10 ⁶ Baff-TG Te乐彩下载或没有内源CD4⁺CD25.⁺ 养殖Te乐彩下载被用入抹布 ^{- / -} 预先用同种异体胰岛移植移植的小鼠（图5⇑C）。在这个实验中，〜80％的抹布 ^{- / -} 接受BAFF-TG Te乐彩下载的小鼠用它们的内源CD4⁺CD25.⁺ Te乐彩下载接受了移植物。相比之下，所有的抹布 ^{- / -} mice receiving CD4⁺CD25.⁺-dlepleted baff-tg te乐彩下载迅速拒绝他们的同种异体移植物（n ≥ 4; p = 0.0167）。正如预期的那样，所有抹布 ^{- / -} 接受WT Te乐彩下载的接受者，有或没有内源性CD4⁺CD25.⁺ Te乐彩下载，拒绝了他们的同种异体移植物（n = 4; p = 0.8984）。因此，我们证明了依赖于受损的Te乐彩下载依赖性免疫的潜在机制是CD4的抑制活性的直接结果⁺CD25.⁺ 周边的Te乐彩下载。

BAFF-TG CD4的体外抑制功能⁺CD25.⁺ T cells

接下来，通过纯粹与内源Treg数量增加的BAFF-TG小鼠中的同种异体移植物的耐受性，或者是否基于每种e乐彩下载的过度增强Treg抑制功能。我们比较了净化CD4的能力⁺CD25.⁺ 来自Baff-Tg或Wt小鼠的Te乐彩下载抑制抗CD3刺激的WT CD4⁺CD25.⁻ 体外Te乐彩下载增殖（图5⇑D）。我们发现Baff-TG CD4的抑制活动⁺CD25.⁺ Te乐彩下载相当于WTe乐彩下载的e乐彩下载。该结果证明来自Baff-Tg小鼠的Treg在体外不比WT Treg更有效，并且表明对Baff-Tg小鼠观察到的T受损的Te乐彩下载依赖性免疫力最可能与内源Treg的增加的频率和数量直接相关。

BAFF-TG小鼠Treg扩张的动力学

为了直接评估外源性的BAFF将如何影响体内的Tregs，C57BL / 6小鼠用市售的重组BAFF处理。施用BAFF（10μg/小鼠I.v.每日7天; n = 4）对Treg Hoyostasis没有影响（数据未描述）。这些数据表明，长期暴露于高水平的BAFF，以便参加Tregs的增加。为了测试这一点，我们产生了辐射骨髓嵌合体，其中用WT骨髓重构Baff-Tg小鼠（图6⇓A）。 CD4频率分析⁺CD25.⁺ WT→Baff-Tg嵌合小鼠的Te乐彩下载显示出〜2.5倍（n = 4; p 与WT→WT小鼠相比，Tregs的扩增分别为34％，分别为34％，分别为34％。测试这些扩展CD4的功能⁺CD25.⁺ Te乐彩下载，WT→Baff-Tg和Wt→WT小鼠用H-2移植^d 胰岛异种移植物（图6⇓B）。我们发现WT→WT小鼠表现出剧烈的同种异性反应;然而，W→Baff-TG小鼠的〜50％未能拒绝其同种异体移植物，而是表现出长期接枝验收（n = 4; p = 0.007）。这些数据表明BAFF可以提高TREG数字;然而，这种效果需要慢性接触BAFF。

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图6。

BAFF-TG小鼠Treg扩张的动力学。 A，脾脏CD4的频率⁺CD25.⁺ 骨髓嵌合体中的Treg; wt→wt（n = 4) vs WT→BAFF-Tg (n = 4; p = 0.0009）。 B，异种胰岛移植物存活中WT→WT（n = 4）与WT→BAFF-TG相比（n = 4) mice (p = 0.007).

BAFF TG小鼠中的Tregs的扩张不是Te乐彩下载内在

BAFF受体BR3可以在某些情况下由Te乐彩下载表达（9, 10）。通过触发P100至P52的处理来连接BAFF激活NF-κB2（13）。因此，如果BAFF直接在VIVO的Treg上行动，我们应该推理该事件应该通过增加NF-κB2P100处理来证明（图7⇓A）。在来自WT或BAFF-TG小鼠的FACS样的Be乐彩下载中检查NF-κB2激活的对照实验中，我们观察到BAFF-TG Be乐彩下载中NF-κB2P100的加工显着增加，如与WT Be乐彩下载相比，通过NF-κB2的P52组分的存在增加表示。这些数据与BAFF通过激活NF-κB2促进Be乐彩下载存活的概念（13）。为了确定BAFF是否在Tregs中激活NF-κB2，分析来自WT或BAFF-Tg小鼠的FACS分选Te乐彩下载和Tregs，用于NF-κB2P100-P52加工。与来自WT或BAFF-TG小鼠的Be乐彩下载相反，没有证据纯化的Te乐彩下载中NF-κB2活化，更重要的是没有从BAFF-Tg或WT小鼠中分离的Tregs中NF-κB2活化的证据。

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图7。

BAFF没有信号NF-κB2 activation in T cells. A，纯化脾脏Be乐彩下载，Te乐彩下载和来自WT和Baff-Tg小鼠的免疫斑分析。 B，BR3在脾CD4上的频率⁺CD25.⁺ WT小鼠中的Te乐彩下载。 C，B220上BR3的频率⁺ B cells in WT mice.

我们还通过流式e乐彩下载术检查Tregs上的BAFF受体表达（图7⇑B）。流式e乐彩下载术分析仅显示了CD4上的BAFF受体BR3的低表达水平⁺CD25.⁺ Te乐彩下载;相比之下，大多数脾脏b220⁺ B cells were BR3⁺。我们解释这些数据以指示Tregs依赖性膨胀与Treg上的NF-κB2的信号传导和Treg上的B​​R3受体的表达密度之间没有相关性。

Be乐彩下载依赖于BAFF-TG小鼠的Tregs的膨胀

BAFF是Be乐彩下载的关键调节剂（1）。由于我们的数据不支持Telce固有机制来扩展Tregs，因此我们接下来质疑Be乐彩下载在Tregs的BAFF扩张中的作用。因此，我们首先产生辐射骨髓嵌合体，其中将WT或Baff-Tg小鼠从WT或μMT重构骨髓 ^{- / -} Be乐彩下载缺乏捐助者;重构后大约10周，检查了每组的Tregs的频率（图8⇓A）。我们发现脾脏CD4的频率⁺Foxp3..⁺ WT→WT嵌合体中的Te乐彩下载是~13％，而WT→BAFF TG嵌合体中的Tregs的频率增加〜3-至〜27％（n = 8; p = 0.0007）。相比之下，检查μmt的Tregs的频率 ^{- / -} →BAFF TG嵌合体显示，在没有Be乐彩下载的情况下，BAFF无法扩大Tregs。实际上，Treg的频率为μmt ^{- / -} →BAFF TG Chimeras（n = 4）类似于wt→wt和μmt ^{- / -} →wt嵌合体。此外，我们发现这些嵌合体拒绝与Tregs频率相关的同种异体移植物的能力（图8 ⇓B）。也就是说，虽然~50％的WT→BAFF TG嵌合体接受了他们的胰岛素移植物（n = 4; p = 0.007），所有的wt→wt，μmt ^{- / -} →wt，重要的是，μmt ^{- / -} →BAFF TG Chimeras急剧拒绝了他们的胰岛同种异体移植物。这些数据表明，BAFF-TG小鼠中的Tregs增加是Be乐彩下载依赖性。

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图8。

Treg的BAFF扩张是Be乐彩下载依赖。 A，脾脏CD4的频率⁺Foxp3..⁺ Treg在骨髓嵌合体中：wt→wt（n = 8) vs WT→BAFF-Tg (n = 8; p = 0.0007), μMT ^{- / -} →wt（n = 4; p = 0.3688), μMT ^{- / -} →Baff-TG（n = 4; p = 0.1592）。 B，异种胰岛移植物存活中WT→WT（n = 8）与WT→BAFF-TG相比（n = 8) mice, μMT ^{- / -} →wt（n = 4) mice, μMT ^{- / -} →Baff-TG（n = 4）。只有WT→BAFF-TG小鼠在统计上显着（p = 0.007).