抽象的
盲肠结扎和穿刺（CLP）引起野生型（WT）小鼠的脓毒症腹膜炎，在手术后7天内的死亡率约为33％。同时，腹膜内CX3Cl1 / reachine的蛋白质水平增加，CX3CR1表达巨噬细胞渗透到腹膜中。 CLP在CX3CR1缺陷中诱发了75％的死亡率（CX3CR1 - / - 然而，除了WT小鼠的情况下表现出类似程度的腹膜白细胞浸润。尽管如此，CX3CR1 - / - 与WT小鼠相比，小鼠在腹膜内细菌间隙中表现出腹膜内细菌间隙的损伤，以及腹膜内诱导型没有合酶（INOS）和杀菌促炎细胞因子，包括IL-1β，TNF-α，IFN-γ和IL-12 。腹膜吞噬细胞如中性粒细胞和巨噬细胞的杀菌能力在CX3CR1中始终衰减 - / - 与WT小鼠相比。此外，当用Cx3Cl1体外刺激WT巨噬细胞时，它们的杀菌活性以剂量依赖性方式增强，具有增强的InOS基因表达和随后的不产生。此外，CX3Cl1通过WT巨噬细胞增强IL-1β，TNF-α，IFN-γ和IL-12的基因表达。因此，CX3Cl1-CX3CR1相互作用对于通过激活吞噬细胞的细菌感染而对细菌感染的最佳宿主防御，并且通过以NF-κB信号途径增强INOS介导的没有产生和杀菌促炎细胞因子产生，对巨噬细胞产生很少的影响浸润。
脓毒症是一种严重的全身细菌感染，无论最初感染的器官如何，都是由复杂的宿主免疫，炎症和凝血反应引起传染微生物，常见导致致命休克与凝血病和多器官衰竭（1, 2）。仅在美国，每年大约750,000个败血症案例，其频率正在增加，由于严重受伤，年龄，免疫压制和终末患者的数量增加，（3）。尽管最近的治疗方法组成，但在广谱抗生素，充足的液体补充和器官功能的人工支持中，其总体死亡率仍高达35％。3）。
在肠道中的多发性植物群感染导致脓毒症腹膜炎，死亡率较高60-80％（4）。化脓性腹膜炎的特征在于将中性粒细胞和巨噬细胞的大规模渗透到腹膜腔中。它们的浸润对于来自腹膜的细菌来渗透是必不可少的，但它们的夸张激活可以进一步增加全身炎症，导致多个器官受到严重损害。促炎细胞因子调节白细胞的招生和激活（2, 3）。因此，TNF-α拮抗剂（5, 6, 7）或IL-1受体拮抗剂（8）已被施用以减少在败血症中经常观察到的严重炎症反应，包括脓毒症腹膜炎，但成功少。
在与七个跨膜部分的特定G蛋白偶联的受体结合后，趋化因子在白细胞上具有有效的趋化活性，具有七个跨膜部分（9, 10[基于其半胱氨酸基序，它们分为CXC，CC，CX3C和C趋化因子的四个亚组。 CX3Cl1 / Fractalkine是CX3C系列的独特成员，由发炎的内皮细胞，巨噬细胞，神经元和胶质细胞表示（11）。 CX3Cl1存在于可溶性和膜结合的形式中（12），它结合其唯一的特异性受体，CX3CR1（13），其由单核细胞，淋巴细胞和NK细胞表达。可溶性形式的CX3Cl1表现出与其他趋化因子类似的白细胞趋化活性。除了其趋化活性之外，膜结合的CX3Cl1可以通过独立于Selectin或整联蛋白结合CX3CR1而充当粘附分子（11, 12, 13）。
CX3CL1和CX3CR1缺乏小鼠（CX3CR1 - / - 小鼠在未充电的条件下没有表现出明显的表型（14, 15），但cx3cr1 - / - 小鼠在心脏异种移植抑制模型中表现出同种异体移植物的存活率增加，减少了NK细胞浸润（16）。弗鲁奇和他的同事们展示了CX3CR1在缺血再灌注损伤后促进了肾间质纤维化（17）。此外，为了支持CX3Cl1-CX3CR1轴对于动脉粥样硬化的发展至关重要（18, 19, 20, 21, 22），CX3CR1的遗传破坏导致具有降低巨噬细胞积累的载脂蛋白蛋白E缺陷小鼠的主动脉中的动脉粥样硬化病变（18, 19）。在人类中，几个突变 CX3CR1 如CX3CR1-I249（位于249的异亮氨酸）或CX3CR1-M280（位于280时的甲硫氨酸）的基因可导致CX3CR1表达降低（23）与艾滋病的快速进展相关，艾滋病和免受心脏葡萄糖疾病的保护有关（23, 24）。
盲肠结扎和穿刺（CLP）6 通常被用作脓毒症腹膜炎的模型，并导致巨大的中性粒细胞和巨噬细胞渗透（25, 26, 27, 28, 29, 30）。 CX3CR1通过渗透巨噬细胞的表达促使我们检查CX3Cl1-CX3CR1轴在CLP诱导的败血症中的病理生理作用。在此，我们提供明确的证据表明，通过损害巨噬细胞衍生的促炎细胞因子产生，并且诱导不含合酶（INOS）表达，并且不产生诱导的酶（INOS）表达，并且这占据了对CLP的夸张敏感性的诱导态在CX3CR1中的致死性 - / - mice.
材料和方法
试剂和抗体
动物
从Sankyo实验室获得了特异性病原体8-至10WK-ORG雄性C57BL / 6小鼠并在本研究中指定为野生型（WT）小鼠。 CX3CR1 - / - 小鼠是来自DRS的慷慨礼物。 P. M. Murphy和J.L. Gao（国家过敏和传染病研究所，国家健康机构，Bethesda，MD）（17）。年龄和性别匹配的cx3cr1 - / - 在以下实验中使用了对8-10代的Roscossed至C57BL / 6小鼠的小鼠。所有小鼠在特异性无理体条件下单独饲养在笼子下，所有动物实验均经过动物护理委员会批准，并在Wakayama Medical大学使用。
CLP手术和存活率的评估
进行CLP手术以诱导先前描述的败血症（30）。简而言之，小鼠用I.P深吸出麻醉。戊巴比妥（50mg / kg）注射。在将1厘米长的切口切开到左下腹部后，盲肠露出，用11-0阀阀门紧密结合，并用20尺针刺穿一次。此后，将盲肠恢复到腹膜腔中，切口闭合。然后用1ml无菌PBS皮下注射小鼠以避免脱水，并在加热垫上温热，直至它们从麻醉中回收。评估生存率，WT和CX3CR1 - / - CLP手术后7天监测小鼠。在一些实验中，WT小鼠被施用I.P.在CLP手术后1小时，通过重组CX3Cl1（3μg/小鼠）或相等的量PBS。
血液生化分析
在CLP手术后的表明间隔中，收集全血样品以确定制造商指示的血清转移酶（ALT），血尿尿素（ALT），血尿尿素（BUN）和肌酐（CR）的血清水平（FUJIFILM医疗系统）。
细菌CFU的测定
如前所述，对外周血和腹膜灌洗测定了细菌CFU（ 27）。简而言之，在CLP之后的指示时间间隔，通过深麻在深呼吸下通过放血进行安乐死。用2ml无菌PBS洗涤腹膜腔，在无菌条件下收获腹膜灌洗液。将十微升腹膜灌洗液或外周血置于冰上，并用无菌PBS连续稀释。将每个稀释液的五微升置于具有5％绵羊血液（BD Biosciences）的胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）板上，并在37℃下在潮湿的室中孵育过夜，之后计算有氧细菌菌落的数量。数据表示为CFU /5μL。在另一系列实验中，WT或CX3CR1 - / - 小鼠是I.P.注射1×106 CFU 大肠杆菌 （菌株WME1）。在注射后的指示时间间隔，如上所述确定腹膜腔中的细菌CFU。
免疫细胞化学
来自腹膜灌洗液的涂抹载玻片立即固定在100％甲醇中。将载玻片浸入0.3％H中2O2 在甲醇30分钟以消除内源性过氧化物酶活性。在PBS-0.1％吐温20中再水化后，将载玻片进一步与含有1％适合的正常血清和1％BSA的PBS一起温育1小时，以减少非特异性反应。将载玻片与抗CX3CR1 PAB，抗CD3 mAb或抗-PAN NK细胞MAb一起温育，浓度为1μg/ ml，在4℃下过夜。在生物素化的次级AB孵育之后，使用催化的信号放大系统（Dakocytomation）可视化免疫复合物。
腹膜白细胞计数和细胞差异
在CLP之后的指示间隔，如上所述收集腹膜灌洗液。通过在8500×以8500×离心获得的细胞粒料 g 在4℃下持续1分钟并重新悬浮在PBS中。腹膜白细胞的总数用血细胞计数计计算，表示为白细胞（×106 or 105）每个腔。在使用重血剂制备的Giemsa染色的涂抹载体上进行差异细胞分析。此外，将T细胞和NK细胞分别用抗CD3 AB和抗-PAN NK AB进行免疫细胞检测。基于来自多个高功率场的300个细胞的计数，每个白细胞群的百分比乘以总腹膜细胞计数，以确定每种细胞类型的绝对数量。
埃莉莎
细胞培养
wt或cx3cr1. - / - 小鼠是I.P.注射2ml 3％巯基乙醇酸酯（Sigma-Aldrich），并收获腹膜内巨噬细胞（巨噬细胞纯度>95％）如前所述3天（31）。将细胞悬浮在含有10％FBS的无抗生素RPMI 1640培养基中，并在34℃下在34℃下孵育三个24孔细胞培养板。两小时后，除去非闭孔细胞，更换培养基。用LPS和/或指示的鼠CX3Cl1刺激细胞12小时，然后施用于随后的分析。
体外吞噬作用和杀死活性测定
腹膜巨噬细胞被隔离并感染1×106 CFU 大肠杆菌 （菌株WME1）在24孔培养板中。在37℃下在5％CO中孵育20分钟后2，用新鲜培养基广泛洗涤孔以除去愈合细菌。将一个板中的细胞用无菌0.5％Triton X-100裂解，用于细菌吞噬作用。将另一个板中的孔用预先制定的新鲜培养基取代并孵育另外20分钟，然后用0.5％Triton X-100裂解细胞用于细菌杀伤测定。将连续稀释的细胞裂解物涂覆在TSA血板上，并在37℃下孵育过夜，并计数菌落的数量。在一些实验中，腹膜巨噬细胞（1×106/孔）从WT小鼠用指定的重组鼠CX3Cl1刺激12小时，评价CX3Cl1对吞噬和杀灭活性的影响（31）。在另一系列实验中，从WT和CX3CR1收集中性粒细胞 - / - 注射后6小时的小鼠用2ml 3％巯基乙酸甲酯，也如上所述检查它们的杀菌活性。此外，评估了CX3Cl1刺激巨噬细胞培养基上清液对中性粒细胞杀灭活性的影响。
没有代的测量
腹膜巨噬细胞（1×106/嗯）来自wt和cx3cr1 - / - 将小鼠在含有10％Fcs的RPMI 1640培养基中培养，在37℃下为5％CO2 过夜。然后，将细胞与LPS（10μg/ ml）孵育另外24小时后，通过离心得到上清液。此后，使用商业无测定试剂盒（测定设计），通过测量亚硝酸盐和硝酸盐，硝酸不稳定的封端，没有测定水平。在一些实验中，腹膜巨噬细胞（1×106/孔）与LPS和所示剂量的重组鼠CX3Cl1孵育12小时，在培养上清液中没有水平的情况下孵育。来自WT和CX3CR1也收集了无细胞腹膜灌洗液样品 - / - 小鼠确定没有水平。
提取总RNA和半rT-PCR
如前所述进行半定量RT-PCR分析（32, 33）。简而言之，根据制造商的说明，从腹膜灌洗液的细胞颗粒或腹膜巨噬细胞中提取总RNA或腹膜巨噬细胞中提取。在含有小鼠Moloney白血病病毒逆转录酶（Toyobo）的20μl反应混合物中，在42℃下在42℃下在42℃下在42℃下逆转1小时，用寡核苷酸（DT）引物（DT）引物（美国药片生物技术）。此后，使用cDNA进行扩增 Taq. 聚合酶（Nippon Gene）和特定组，具有由94℃的最佳循环组成1分钟，最佳退火温度1分钟，72℃持续1分钟（表I⇓），然后在72℃温育3分钟。将扩增的PCR产物在2％琼脂糖凝胶上分离并被溴化乙锭染色可视化。使用图像分析软件（SCION图像）测量频带强度，并计算每个带对β-肌动蛋白的比率。
Western Blotting.
来自腹膜灌洗液或分离的巨噬细胞的细胞粒料用裂解缓冲液（20mM Tris-HCl（pH7.6），150mM NaCl，1％Triton X-100,1mM EDTA）均化均化含有完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche ）和磷酸酶抑制剂用于丝氨酸/苏蛋白磷酸酶和酪氨酸蛋白磷酸酶（P2850和P5726; Sigma-Aldrich）并离心以获得裂解物。将裂解物（相当于30μg蛋白质）在10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶中电泳，并转移到尼龙膜上。在用最佳稀释的初级ABS和HRP缀合的二次ABS依次反应后，使用ECL系统（Amersham Biosciences）可视化免疫复合物。
NF-κBP65DNA结合活性的测量
如前所述，使用Ne-per-perfice（Pierce）从分离的巨噬细胞中提取核蛋白（33）。随后，使用EZ检测转录因子试剂盒（Pierce）根据制造商的说明检测多孔化学发光测定以检测NF-κBP65蛋白。 P65含量表示为相对光单元除以每个样品的总蛋白质含量。
双色免疫荧光分析
来自腹膜灌洗液的涂抹载玻片立即固定在100％甲醇中。在PBS-0.1％吐温20中再水化后，将载玻片与含有1％正常甜血清和1％BSA的PBS一起温育，以减少非特异性反应。此后，将载玻片在4℃下在4℃下孵育过夜，对抗CX3CR1 PAB和抗F4 / 80mAb，或抗CX3Cl1 PAB和抗F4 / 80mAb。洗涤后，将载玻片加入室温下与荧光染色的副粘液孵育1小时。然后在荧光显微镜下观察载玻片。
统计分析
计算本研究中确定的所有参数的方法和SEM。使用单人的单人检测与Scheffé的单一性能进行评估统计学意义 F 多重比较测试或Mann-Whitney U 测试。通过日志秩检验分析了Kaplan-Meier程序的生存曲线。 p <0.05被接受为统计学意义。
结果
CLP后WT小鼠中的腹膜内CX3Cl1和CX3CR1表达
在WT小鼠的腹膜灌洗液中勉强可检测到CX3Cl1（图1⇓a）。 CLP程序六小时后，CX3Cl1水平显着增加，24小时进一步增强（图1⇓a）。此外，在募集到腹膜腔中的F4 / 80阳性巨噬细胞中检测CX3Cl1蛋白（图1⇓B-D.）。类似地，在所使用的实验条件下，在来自未处理的WT小鼠的腹膜细胞中，CX3CR1 mRNA几乎可以检测到（图1⇓e）。 CLP程序以6小时开始增强CX3CR1的基因表达（图1⇓, e 和 f）。免疫细胞化学分析表明，CLP手术后的单核细胞表达了CX3CR1蛋白24小时（图1⇓g）。此外，双色免疫荧光分析显示，腹膜中的大部分F4 / 80阳性巨噬细胞表达CX3CR1（图1⇓H-J.）。这些观察结果表明，在CLP诱导的败血症过程中，产生CX3Cl1，可以诱导累积并可能激活CX3CR1阳性巨噬细胞。
图1。
a，在CLP后WT小鼠的腹膜内CX3Cl1 /裂缝水平。以所示的间隔，收获2ml腹膜灌洗液，并如所述测量灌洗液中的CX3Cl1 /抗乳蛋白蛋白水平 材料和方法。所有值表示平均值±SEM（n = 6）。 **， p <0.01 Vs未经处理的wt。 B-D.CLP手术后24小时从WT小鼠腹膜灌洗液的涂抹污垢分析。六个独立实验的代表结果在此显示：（b）抗CX3Cl1 PAB和（c）抗F4 / 80 mAb。信号被数字化合并 d。原始放大倍数，×400。 e 和 f，如下所述，通过RT-PCR检查腹膜内细胞中的CX3CR1基因表达 材料和方法。六个独立实验的代表结果显示在 e。计算CX3CR1至β-肌动蛋白的比率并显示在 f。所有值表示平均值±SEM（n = 6）。 **， p <0.01 Vs未经处理的wt。 g24小时CLP手术后24小时从WT小鼠腹膜灌洗液中涂抹湿液的免疫细胞化学分析。这里显示了六个独立实验的代表性结果（原始放大率，×400）。 h–jCLP手术后24小时从WT小鼠腹膜灌洗液的涂抹污垢分析。六个独立实验的代表结果在此显示：（h）抗CX3CR1 PAB和（i）抗F4 / 80 mAb。信号被数字化合并 j。原始放大倍数，×400。
增加对CLP诱导的败血症的易感性与CX3CR1中的夸张的器官损伤和全身炎症有关 - / - mice
为了确定CLP诱导的败血症中CX3Cl1-CX3CR1相互作用的致病作用，我们在WT和CX3CR1上进行了CLP程序 - / - 老鼠。在CLP手术后7天内存活了18只WT小鼠（66.7％），而只有25％的CX3CR1 - / - 幸存下来的小鼠（24只小鼠的6只）（图2⇓a）。由于CLP诱导的SEPSIS导致多种器官衰竭和增强的全身炎症（25, 26, 27, 28, 29, 30），通过分别测量血清ALT，BUN和CR水平来评估肝脏和肾损伤。未经治疗的WT和CX3CR1之间没有显着差异 - / - 在血清ALT，BUN和CR水平方面的小鼠（图2⇓, b–d）。 WT和CX3CR1两者和CX3CR1都明显升高了这些标志物的血清水平 - / - CLP手术后晚些时候小鼠。在CX3CR1中CLP手术后24小时，血清化学水平的增加在6小时内显着更大 - / - 小鼠比在Wt小鼠中，表明CX3CR1在CX3CR1中患者和肾脏更受损 - / - 小鼠比在wt小鼠中（图2⇓, b–d）。因此，没有CX3CR1增加了对CLP诱导的败血症的敏感性，伴随着夸张的器官损伤。当CLP手术后用CX3Cl1（3μg/小鼠）给予WT小鼠时，7天的存活率显着改善（图2⇓e; CX3Cl1对照，每15只小鼠的1例死亡，每15只小鼠6人死亡， p <0.05）。因此，这些观察结果暗示CX3Cl1-CX3CR1轴用于CLP诱导的败血症。
图2。
a，wt的生存率（n = 18) and CX3CR1 - / - 老鼠 (n = 24）在CLP后7天评估7天。 B-D.，夸张的器官损坏在CX3CR1中 - / - 老鼠。在CLP后的指定时间间隔，收集全血样品，并血清ALT（b），小圆面包（c）和cr（d）如所述确定 材料和方法。所有值表示平均值±SEM（n = 8）。 **， p < 0.01 and ∗, p < 0.05 CX3CR1 - / - vs wt。 e外源CX3Cl1对CLP手术后WT小鼠存活率的影响。
CX3CR1中的细菌间隙受损 - / - mice
CLP诱导的败血症由肠道多发性植物植物植物腹腔传播。因此，我们接下来检查了WT和CX3CR1的腹膜液和血液中的细菌负荷 - / - CLP手术后的小鼠。没有细菌从未处理的WT和CX3CR1的腹膜腔和全血中回收 - / - 小鼠（数据未显示）。 CX3CR1中的平均腹膜CFU计数较高 - / - 在CLP手术后6和24小时的小鼠比在WT小鼠中（图3⇓, a 和 b，wt vs cx3cr1 - / - mice: 0.65 × 102 vs 3.2 × 102 at 6 h; 3.3 × 102 vs 4.3 × 104 在24小时）。在CLP程序之后，在25％的WT小鼠（2只小鼠中的2只小鼠中的2只小鼠中的2只小鼠中的2只小鼠中的2只小鼠中的2个）24小时（图3⇓d）。相比之下，同时，从75％的CX3CR1中回收细菌 - / - 小鼠（6个小鼠），平均值为7.0×102 CFU计数/5μL血液（图3⇓, c 和 d）。而且，什么时候 大肠杆菌 (1 × 106 CFU）被注射I.P.，CX3CR1 - / - 与WT小鼠相比，小鼠表现出从腹膜腔的细菌间隙损伤的显着损害（图3⇓, e 和 f; wt vs cx3cr1. - / - (n 每个应变中= 8）：1.1×102 vs 2.7 × 103 在6小时， p <0.01; 1.1×10 Vs 1.0×103 在24小时， p <0.01）。总的来说，这些观察结果表明，在没有CX3CR1的情况下，来自腹膜腔的细菌间隙受损，最终导致更大的菌血症和全身炎症的发展。
图3。
CX3CR1中的细菌间隙受损 - / - 老鼠。在CLP，腹膜液（a 和 b）和外周血（c 和 d）从WT和CX3CR1中收集 - / - 老鼠。 e 和 f，腹膜腔中的细菌CFU也在WT和CX3CR1中测定 - / - 在I.P之后的指示间隔的小鼠。注射1× 106 CFU E。大肠杆菌（菌株WME1）。在连续稀释后，将5μL每种稀释液涂覆在TSA血液上，并如上所述测定每个样品中的细菌CFU 材料和方法。水平杆表示每组的平均值（n 每组= 8）。 **， p < 0.01 and ∗, p < 0.05 for CX3CR1 - / - vs wt。
CX3CR1介导的信号途径基本上并非基本上参与CLP诱导的败血症期间的白细胞募集
白细胞募集被认为对细菌间隙至关重要。因此，我们研究了CX3CR1缺乏对白细胞腹腔贩运的影响。 CLP在WT和CX3CR1中引起了类似程度的巨大白细胞募集到腹膜腔中 - / - 老鼠 (Fig. 4⇓a）。 WT和CX3CR1之间的腹膜内嗜中性粒细胞数无显着差异 - / - 小鼠直到CLP后48小时（图4⇓b）。与以前的报告一致（25, 27, 28, 30），在CLP手术后，腹膜内巨噬细胞数瞬时减少，然后在WT小鼠中逐渐增加（图4⇓c）。这些发现可能会镜像观察（25, 27）CLP手术激活腹膜巨噬细胞，以提高其瞬时粘附到腹膜的能力。虽然CX3CR1中巨噬细胞数量略微低下 - / - 小鼠比在24小时的WT小鼠中，在这两个菌株之间没有观察到48小时的显着差异（图4⇓c）。此外，将T细胞和NK细胞均被募集到腹膜腔中以WT和CX3CR1的相似范围 - / - CLP手术后的小鼠（图4⇓, d 和 e）。这些观察结果暗示CX3Cl1-CX3CR1轴对CLP诱导的败血症中的白细胞募集不可缺少。
图4。
CLP后腹膜内白细胞数的变化。在CLP之后以指定的间隔，从WT和CX3CR1收集腹膜内细胞 - / - 小鼠，以及总白细胞的数量（a），中性粒细胞（b），巨噬细胞（c），CD3阳性T细胞（d）和NK细胞（e）被描述为 材料和方法。所有值表示平均值±SEM（n = 8).
CX3Cr1在巨噬细胞和中性粒细胞的细菌杀伤活性的基本累积
但是，CX3CR1. - / - 与WT巨噬细胞相比，鼠标衍生的腹膜巨噬细胞表现出杀灭细菌的能力，而不会在吞噬作用的任何损伤（图5⇓, a 和 b）。此外，CX3Cl1以剂量依赖的方式增强了吞咽的细菌杀伤，但不是吞噬能力（图5⇓, c 和 d）。然而，CX3Cl1未能增强CX3CR1的细菌杀伤活性 - / - 鼠标衍生的腹膜巨噬细胞（未显示数据）。因此，这些观察结果暗示CX3Cl1-CX3Cr1相互作用在维持巨噬细胞的细菌杀伤能力方面具有重要作用，但对其贩运和吞噬能力没有影响。累积证据暗示I.P.-浸润中性粒细胞作为细菌间隙中的主要效应细胞（34, 35, 36）。实际上，来自CX3CR1的中性粒细胞的细菌杀死活性 - / - 与WT小鼠的比较有显着抑制小鼠（图5⇓e）。此外，当通过重组CX3Cl1刺激WT巨噬细胞时，培养上清液从WT小鼠增强细菌杀死中性粒细胞的活性（图5⇓f）。然而，来自CX3CR1的培养上清液 - / - CX3Cl1刺激的巨噬细胞未能增强WT中性粒细胞的杀菌活性（数据未显示）。因此，CX3Cl1-CX3CR1相互作用可以通过作用于巨噬细胞直接和间接地增强细菌杀死中性粒细胞的活性。
图5。
吞噬噬菌体和细菌杀灭巨噬细胞活动。 a 和 b，吞噬（a）和细菌杀害活动（b）在WT-或CX3CR1上测定 - / - 如上所述，小鼠衍生的腹膜巨噬细胞 材料和方法. All values represent means ±SEM（八个独立实验）。∗∗, p < 0.01 for CX3CR1 - / - vs wt。 c 和 d，吞噬（c）和细菌杀害活动（d在培养物在表明浓度的CXC3Cl1持续12小时内，在WT小鼠衍生的腹膜巨噬细胞上测定，如下所述 材料和方法。 **， p < 0.01 vs control; #, p <CX3Cl1在10ng / ml的Cx3Cl1下为100ng / ml 0.05。 e，在WT和CX3CR1中测定中性粒细胞的细菌杀灭活性 - / - 如上所述的小鼠 材料和方法. All values represent means ±SEM（八个独立实验）。∗, p < 0.05 for CX3CR1 - / - vs wt。 f，上清液从CX3Cl1氧化的WT巨噬细胞的培养基对WT衍生中性粒细胞的细菌杀伤活性的影响。 **， p < 0.01 and ∗, p < 0.05 vs control; #, p <CX3Cl1在10ng / ml的Cx3Cl1下为100ng / ml 0.05。
CX3CL1-CX3CR1轴在INOS表达中的基本作用，也不发电
NO，主要由INOS产生，具有有效的杀菌活性，因此据报道，据据报道免于脓毒症（37）。在未经处理的WT和CX3CR1的腹膜细胞中微弱地表达了Inos mRNA - / - 小鼠在类似的程度上。 CLP在WT小鼠中增强Inos mRNA表达，但在CX3CR1中显着较小 - / - 老鼠 (Fig. 6⇓, a 和 b）。伴随着，在CLP之后的WT小鼠的腹膜细胞颗粒中比CX3CR1的腹膜细胞颗粒更增强INOS蛋白水平 - / - 老鼠 (Fig. 6⇓c）。此外，在CLP之后，WT小鼠腹膜腔中硝酸盐（NO）浓度浓度的浓度明显升高，但在CX3CR1中再次衰减 - / - 老鼠 (Fig. 6⇓d）。 LPS刺激在WT小鼠衍生的腹膜巨噬细胞中增强INOS基因表达，但在CX3CR1中的程度较小 - / - 鼠标衍生的巨噬细胞（图7⇓, a 和 b）。因此，CX3CR1的培养基中硝酸盐浓度显着较低 - / - 巨噬细胞与WT巨噬细胞相比（图7⇓c）。但是，wt和cx3cr1 - / - 巨噬细胞表达TLR-4 mRNA到类似的范围（数据未显示）。外源性Cx3Cl1，以剂量依赖性方式，增强的LPS诱导的InOS mRNA表达和由WT巨噬细胞产生的结果（图7⇓D-F.）但不是cx3cr1 - / - 巨噬细胞（数据未显示）。 LPS诱导CX3Cl1 mRNA表达在WT和CX3CR1中的相似范围 - / - 巨噬细胞（数据未显示），与上一个报告一致（38）。因此，CX3CR1 - / - 巨噬细胞对LPS表现出较低的响应性，可能是因为它们未能在用LPS刺激后局部产生的CX3CL1。这些观察结果表明CX3Cl1-CX3CR1相互作用通过诱导INOS基因表达和随后的NO，一种至关重要的细菌杀伤效应分子来保护来自CLP引起的腹膜细菌散发。
图6。
a 和 b，来自WT小鼠（开放条）和CX3CR1的腹膜内细胞中INOS的CLP诱导的基因表达 - / - 小鼠（填充条）。如所述进行RT-PCR 材料和方法。六个独立实验的代表结果显示在 a。计算inoS对β-肌动蛋白的比率并显示 b。所有值表示平均值±SEM（n = 6）。 **， p < 0.01 for CX3CR1 - / - vs wt。 c，腹膜细胞中Inos表达的蛋白质印迹分析。在CLP之后，收集腹膜内细胞并进行腹膜细胞，并进行Western印迹分析以检测InOS蛋白，如下所述 材料和方法。这里显示了六个独立实验的代表结果。 d，在WT小鼠（开放条）和CX3CR1上测定腹膜灌洗液中的硝酸盐浓度 - / - 在CLP之后的指示间隔的小鼠（填充条）。所有值代表手段± SEM (n = 6）。 **， p < 0.01 for CX3CR1 - / - vs wt。
图7。
A-C.，巨噬细胞（1×106）来自wt和/或cx3cr1 - / - 将小鼠在LPS存在下培养（10μg/ml) for 24 h. a 和 b，巨噬细胞中的INOS基因表达通过RT-PCR确定如下所述 材料和方法。六个独立实验的代表结果显示在 a。计算inoS对β-肌动蛋白的比率并显示 b. All values represent means ±SEM（六个独立实验）。∗∗, p < 0.01 for CX3CR1 - / - vs wt。 c，如上所述确定上清液中没有上清液中的内容物 材料和方法. All values represent means ±SEM（六个独立实验）。∗∗, p < 0.01 for CX3CR1 - / - vs wt。 （d）（f）Cx3Cl1对LPS诱导的InOS基因表达的影响，WT巨噬细胞中没有发电。 WT鼠标衍生的巨噬细胞在LPS存在下培养（10μg/ml), together with the indicated concentrations of CX3CL1 for 24 h. d 和 e，巨噬细胞中的INOS基因表达通过RT-PCR确定如下所述 材料和方法。六个独立实验的代表结果显示在 d。计算inoS对β-肌动蛋白的比率并显示 e. All values represent means ±SEM（六个独立实验）。∗∗, p <0.01 VS控制; ##， p < 0.01 vs LPS alone. f，如上所述确定上清液中没有上清液中的内容物 材料和方法. All values represent means ±SEM（六个独立实验）。∗∗, p <0.01 VS控制; ##， p < 0.01 and #, p < 0.05 vs LPS alone.
在没有CX3CR1的情况下，细胞因子产生受损
累积证据表明，抗菌活性可以通过细胞因子增加，例如IL-1，TNF-α，IFN-γ和IL-12（39, 40, 41, 42）。鉴于巨噬细胞产生这些细胞因子的能力，我们检查了CX3CR1缺乏对这些细胞因子的产生的影响。未经处理的WT和CX3CR1的这些细胞因子的腹膜内容物没有显着差异 - / - 老鼠 (Fig. 8⇓）。然而，CLP在WT小鼠中显着增加了这些细胞因子的腹膜内容物，但在CX3CR1中较少 - / - 老鼠 (Fig. 8⇓）。 CX3CR1 - / - 与WT小鼠相比，腹膜巨噬细胞表现出这些细胞因子的LPS刺激的mRNA表达的降低（数据未显示）。此外，外源CX3Cl1以剂量依赖性方式增强了这些细胞因子的基因表达，通过WT腹膜巨噬细胞（图9⇓）但不是cx3cr1 - / - 腹膜巨噬细胞（数据未显示）。这些观察结果表明CX3Cl1-CX3CR1相互作用通过巨噬细胞和细菌杀伤活性增加了不产生的和细胞因子。
图8。
WT和CX3CR1中肾炎细胞因子的腹膜内水平 - / - 老鼠。在CLP后的表明间隔，收集无细胞腹膜灌洗液以确定IL-1β (a），TNF-α（b），IFN-γ（c）和IL-12P70水平（d），如上所述 材料和方法。所有值表示平均值±SEM（n = 8）。 **， p < 0.01 and ∗, p < 0.05 for CX3CR1 - / - vs wt。
图9。
在LPS的存在或不存在的情况下孵育WT小鼠衍生的腹膜巨噬细胞（10μg/ml), together with the indicated concentrations of CX3CL1 for 24 h. RT-PCR was performed on macrophages as described in 材料和方法。六个独立实验的代表结果显示在 a。 IL-1β的比率（b），TNF-α（c），IFN-γ（d），IL-12P35（e）和IL-12P40（f) to β计算和显示。所有值代表手段±SEM（六个独立实验）。∗∗, p <0.01 VS控制; ##， p < 0.01 and #, p < 0.05 vs LPS alone.
CX3CL1对NF-κB，P38 MAPK，JNK和ERK信号通路的影响
因为CX3CL1激活了几种信令路径（43, 44, 45, 46, 47），我们最终检查了CX3CL1对WT衍生巨噬细胞中的NF-κB，P38 MAPK，JNK和ERK信号传导途径的影响。 CX3Cl1以剂量依赖性方式显着提高了WT巨噬细胞中NF-κB的DNA结合活性（图10 ⇓a）。 P38 MAPK和JNK仅在我们检查的最高剂量的CX3CL1存在下磷酸化（图10⇓B-D.），而ERK磷酸化未得到增强（图10⇓, b 和 e）。这些观察结果暗示CX3Cl1-CX3CR1相互作用主要激活NF-κB信号通路，导致靶基因表达的增强。
图10。
a, DNA binding activity of the nuclear NF-κCX3Cl1治疗后腹膜巨噬细胞B P65。所有值代表手段±SEM（每组六个实验）。∗∗, p < 0.01 vs vehicle. b，P38 MAPK的免疫化学检测，CX3CL1处理后腹膜巨噬细胞的磷酸化P38 MAPK（P-P38 MAPK），JNK，P-JNK，ERK，P-ERK和α-微管蛋白，如下所述 材料和方法。使用抗α-微管蛋白AB的蛋白质印迹分析证实，将相同量的蛋白质加载到每条泳道上。六个独立实验的代表结果显示在 b。 P-P38 MAPK / P38 MAPK比率（c），P-JNK / JNK（d）和P-ERK / ERK比率（e) obtained by densitometry are shown here. All values represent means ±SEM（六个独立实验）。∗∗, p < 0.01 vs control.
讨论
消除细菌需要杀死吞噬细胞等噬菌体和巨噬细胞的活性。 CLP诱导的腹膜细胞感染和所得吞噬细胞浸润到腹膜腔中，其随后的活化对于微生物的间隙和预防CLP诱导的败血症的关键是至关重要的（25, 26, 27, 28, 29, 30）。与粘附分子合作的趋化因子可以调节吞噬吞噬细胞的贩运。实际上，几种趋化因子导致CLP诱导的败血症的发病机制，不同方式（25, 26, 27, 28, 29, 30）。 CXCR2-，CCR1-或CCR8缺陷小鼠对CLP诱导的败血症更耐药（25, 26, 27）。没有CCR1或CCR8在巨噬细胞中增强抗菌反应（26, 27）。相反，MIP-1α/ CCL3缺乏或用抗MCP-1 / CCL2或抗巨噬细胞衍生的趋化因子（MDC）/ CCL22Ab的治疗减少了CLP诱导的败血症后的存活率，并伴随着增强的恢复来自腹膜的活细菌（48）。 CCL2，CCL3和CCL22的受体在巨噬细胞上表达。镜像在巨噬细胞，CCl2，CCl3和CCL22上增强巨噬细胞的抗菌反应的表达（29, 30, 31, 48, 49）。这些观察结果表明，各种趋化因子可以以不同的方式调节巨噬细胞杀菌活动。
CX3Cl1在内皮细胞上表示为膜结合形式，通过TNF-α转换酶处理以产生可溶性形式（50）。通过用LPS，TNF-α，IL-1和IFN-γ的刺激进一步提高其表达（12）。因为Cx3Cl1在细胞结合的粘液样茎的顶部含有其趋化因子域，所以它也可以用作粘附分子。因此，表达CX3CR1的细胞，CX3Cl1的独特受体，快速结合，并在静态和生理流动条件下对CX3Cl1表达内皮细胞具有高亲和力（13）。因此，在活化的内皮细胞上表达的CX3Cl1可能介导从血液中培养有效的白细胞募集到间质组织空间。 CX3CR1表达仅限于淋巴细胞，NK细胞和单核细胞。在CLP诱导的腹膜炎期间，CX3CR1及其特异性配体CX3Cl1由腹膜内巨噬细胞表达，促使我们评估CX3CR1中的CLP诱导的腹膜炎 - / - 与WT小鼠相比。在此，我们观察到CX3CR1 - / - 小鼠从腹膜中表现出降低的细菌间隙，因中性粒细胞和巨噬细胞的抑制细菌杀伤活性而导致的死亡率增加。因此，CX3CR1表达巨噬细胞对细菌感染具有重要的保护作用，类似于CCR2-或CCR4表达巨噬细胞。这种保护效果不依赖于巨噬细胞招生，而是依赖于噬菌体功能。
Geissmann和同事（51）提出，基于CX3CR1和CCR2：CX3CR1的表达水平，可以将鼠外周血单核细胞分为两种亚组高的CCR2− 居住在组织中的单核细胞和CX3CR1低的CCR2+ 单核细胞在炎症时募集到组织中。相反，ancuta和同事报告说，在人类中，CX3CR1由CD16表示+ 单核细胞，其在正常条件下代表5-10％的外周血单核细胞，在几种病理条件下显着扩增，包括败血症和癌症（52）。根据后一种观察，未处理小鼠的腹膜巨噬细胞表达了低水平的CX3CR1，但CLP通过巨噬细胞显着增强了其表达（Y.Ishida和Kando，未发表的数据）。虽然CX3CR1的基因破坏或免疫功率下放减少了动脉粥样硬化和肾病中的巨噬细胞募集（17, 18, 19, 53, 54），缺乏CX3CR1对硫代葡萄醇诱导的腹膜炎的巨噬细胞浸润影响很少（14, 15）或者，在本研究中，对CLP诱导的腹膜炎。累积证据表明，CCL2-CCR2相互作用可以在包括CLP诱导的败血症的各种疾病模型中强调巨噬细胞浸润（28, 30, 55, 56, 57, 58）。实际上，CLP将CCL2的腹腔内含量增加到WT和CX3CR1中的相似程度 - / - 小鼠（Y.Ishida和T. Kando，未发表的数据）。因此，CCL2-CCR2相互作用主要可以将CLP诱导的巨噬细胞浸润调节到腹膜中。大多数腹膜巨噬细胞强烈表达CX3CR1和CCR2，即使在CLP手术（Y.Ishida和T. Kando，未发表的数据）之后，均外为24小时。因为CCL2-CCR2相互作用可以快速上调巨噬细胞的CX3CR1表达（59），这些观察可能表明渗透CCR2+ 炎症巨噬细胞获得CX3CR1表达。但是，CCR2的快速外观高的CX3CR1高的 巨噬细胞的假设是浸润的巨噬细胞可能与所谓的居民和炎症巨噬细胞不同。
活化的巨噬细胞表达INOS，可以合成NO的酶，对病原体复制的抑制作用（ 37）。它们同时产生TNF-α和IFN-γ，两者也施加有效的抗菌活性（39, 40, 41, 42）。 CLP增强的InOS表达，随后的没有产生和TNF-α和IFN-γ产生在腹膜腔中，并且在CX3CR1中抑制了这些增加 - / - 小鼠，伴随着细菌间隙的损害。因此，INOS，TNF-α和IFN-γ表达也可能在CLP诱导的腹膜炎中具有保护作用。静脉内感染 李斯特菌 诱导CCL2的肾包翻钙产生，吸引了表达CCL2的单核细胞（60）。渗透含有单核细胞 L.单核细胞增生 通过表达INOS，TNF-α和IFN-γ感染，如CLP诱导的腹膜炎中类似地观察到。然而，依然研究这些分子表达的分子机制仍有待研究。我们观察到，来自未感染的WT小鼠的腹膜巨噬细胞表达了低水平的CX3CR1，但仍然保留表达INOS，TNF-α和IFN-γ的能力响应于CX3Cl1。因此，推测CCL2在CCL2的引导下，CX3Cl 1在CCL 2的引导下，CX3Cl 1可以激活单核细胞/巨噬细胞渗透到腹膜中以表达这些效应分子。
尽管在中性粒细胞上缺乏CX3CR1表达，但它们在CX3CR1中的杀菌活性 - / - 比较鼠比例明显减少了与WT小鼠相比。因此，我们假设CX3Cl1-CX3Cr1轴在巨噬细胞上可能间接调节中性粒细胞功能。实际上，通过添加CX3Cl1刺激的WT巨噬细胞的培养基而不是CX3Cl1刺激的CX3CR1来提高WT衍生中性粒细胞的细菌杀伤活性。 - / - 巨噬细胞（Y.Ishida和T. Kando，未发表的数据）。支持地，莫雷诺和同事（36）证明IL-12增强了中性粒细胞的杀菌活性。符合这一点，向CX3Cl1刺激巨噬细胞的上清液中添加抗IL-12废除了中性粒细胞的杀菌活性的增强（Y.Ishida和Kando，未发表的数据）。因此，CX3CR1中杀菌活性的损害 - / - 小鼠至少应归因于CX3CR1中的IL-12生产减少 - / - macrophages.
微生物感染后，巨噬细胞识别病原体相关的分子模式，并被激活以表达INOS，并产生各种细胞因子，包括IL-1β，TNF-α，IFN-γ和IL-12（ 61）。这些细胞因子在自分泌和帕拉卡碱的方式上作用于巨噬细胞，以增加巨噬细胞杀菌功能（39, 40, 41, 42）。大多数病原菌相关的分子模式受体可以激活NF-κB，p38 mapk和/或JNK信号传导途径，并且网络结果是InOS和细胞因子基因表达的诱导（62, 63）。 CX3CR1与其他趋化因子受体分享普通的信号通路，包括刺激细胞内钙动员（13），MAPK激活（43）和pi3k激活（44）。此外，CX3Cl1可以在人肠上皮细胞中激活NF-κB（45）和主动脉平滑肌细胞（46）。实际上，外源CX3Cl1显着夸大了腹膜巨噬细胞NF-κB的激活。仅通过高剂量的CX3Cl1激活P38 MAPK和JNK的信号传导途径。因此，CX3Cl1可以通过巨噬细胞诱导酰胺和杀菌细胞因子表达，主要是通过激活NF-κB信号途径，这是关键参与这些基因的表达。
在此，我们提供了第一证据表明小鼠的CX3CR1缺乏增强了对腹膜感染的易感性。具有CX3CR1 M280或I249等位基因的人在PBMC上表达了较低的CX3Cl1结合能力，并且更容易迅速进展，以发展艾滋病毒感染（23）。因此，可能减少CX3CR1表达可以增强对感染的易感性。因此，随着常规治疗，CX3CR1介导的信号的操纵可能证明有利于治疗微生物感染，特别是败血症。
致谢
我们感谢Drs。 Philip M. Muphy和Ji-Liang Gao（国家过敏和传染病研究所，国家健康机构，Bethesda，MD）为我们提供CX3CR1 - / - 老鼠。我们欣赏Joost J. Oppenheim博士对这项工作的深思熟虑的建议。
披露
作者没有财务利益冲突。
脚注
本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此，本文必须明白 广告 按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
↵1 这项工作得到了来自日本政府的教育，文化，科学和技术部的助资助剂。 T.H.是来自日本科学学会的年轻科学家研究奖学金的受援人员。
↵2 义。和t.h.对这项工作同样贡献。
↵3 现任地址：鹿儿岛大学医学与牙科学院学习科学系，日本鹿儿岛890-8544。
↵4 当前地址：岐阜大学生命科学研究中心厌氧研究中心，岐阜501-1194，日本。
↵5 地址通信和转载对佛塔山医科大学法医院，811-1 Kimiidera，Wakayama 641-8509，Wakayama 641-8509。电子邮件地址： kondot {at} wakayama-med.ac.jp
↵6 本文使用的缩写：CLP，CECEL连接和穿刺; Inos，诱导无合成酶; PAB，多克隆AB; wt，野生型; alt，丙氨酸转芽;小圆面包，血尿尿素氮; Cr，肌酐; TSA，胰蛋白酶大豆琼脂。
- 已收到 2007年4月27日。
- 公认 2008年7月8日。
- 版权© 2008 by The 美国免疫学家协会
