抽象的
IFN-α通过血浆骨质树突e乐彩下载（PDC）的产生在抗病毒免疫中至关重要。在本研究中，我们评估了治疗幼稚，持续响应者和非反应对患者慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染患者PDC的IFN-α-产生的能力。在TLR9刺激后，IFN-α在PBMCS或分离的PDC中测试。由于凋亡增加，慢性HCV感染患者慢性HCV感染的患者减少了循环PDC的频率，并且用TLR9配体刺激后产生的IFN-α产生减少。这些PDC缺陷与HCV的存在相关，与持续响应者的正常PDC功能相反。 HCV核心蛋白在感染患者的血浆中可检测到，降低TLR9触发的IFN-α并增加了PBMC中的TNF-α和IL-10产生，但不包括在分离的PDC中，表明HCV核心诱导的PDC缺陷。实际上，添加RTNF-α和IL-10诱导的e乐彩下载凋亡并抑制PDC中的IFN-α产生。中和TNF-α和/或IL-10预防HCV核心诱导的IFN-α产生的抑制。我们确定了CD14.+单核e乐彩下载作为TNF-α和IL-10的来源在HCV核心诱导的PDC IFN-α产生的抑制中。抗TLR2-，而不是抗TLR4-，阻断AB阻止了HCV核心诱导的IFN-α产生的抑制。总之，我们的研究结果表明，HCV通过通过HCV核心蛋白触发的TLR2介导的单核e乐彩下载活化来干扰抗病毒免疫，诱导e乐彩下载因子，又导致PDC凋亡并抑制IFN-α的产生。这些机制可能有助于HCV病毒逃离免疫反应。
用丙型肝炎病毒感染（HCV）3 在大多数情况下（50-80％）变得慢性，并导致肝脏损伤从轻度炎症到肝硬化（1）。 IFN-α与利巴韦林组合是目前最有效的丙型肝炎感染患者的治疗方法（1, 2）。 IFN-α的生物学效应的广泛曲目包括但不限于直接抑制感染e乐彩下载中的病毒复制，增强巨噬e乐彩下载和NKe乐彩下载的e乐彩下载毒性活性，促进Te乐彩下载的存活率，并通过Be乐彩下载（3）。虽然IFN治疗的剂量，持续时间和有效性存在很大的争议，但它可以导致病毒消除和全身炎症的分辨率（1, 2, 4）。在体内，IFN-α的主要生产商是血浆骨质树枝状e乐彩下载（PDC）。人类PDC是谱系（CD3，CD8，CD11c，CD14，CD19和CD56） - 表达CD4，CD123和BDCA-2标记物的阴茎e乐彩下载，并在暴露时产生高水平的I型IFNS（IFN-Aβ）用某些TLR配体刺激病毒或刺激。 PDCS表达TLR1，TLR6，TLR7和TLR9，其中TLR9是最突出的（5, 6, 7）。目前关于HCV感染患者的IFN-α的产能的报告是有争议的。在HCV感染患者中报告了降低和增加的IFN-α产量（8, 9, 10, 11）。
本研究的目的是分析慢性HCV感染患者的PDC功能。我们的结果表明，由于HCV感染患者中的IFN-α产生的e乐彩下载凋亡，循环PDC的丧失。我们鉴定了HCV核心蛋白可以通过单核e乐彩下载衍生的IL-10和TNF-α诱导受到PDC的IFN-α产生。我们的研究结果揭示了一种用于PDC损失的新型HCV驱动机制，可为免疫监测提供HCV的逃逸机制。
材料和方法
献血者和e乐彩下载
健康个体（控制， n = 46），治疗 - 幼稚患者慢性感染（HCV患者， n = 41），清除HCV的患者（持续响应者， n = 16），那些未能清除HCV的人（无回复者， n = 14）在研究中注册治疗后（表I⇓）。响应者，12次接受Pegasus Plus利巴韦林治疗24-48Mo，1个接受的Pegasus Plus利巴韦林加血管素36mO，2具有聚乙二醇 - 内部载子加氢肽48Mo，用术后15℃处理1次62 mo 。响应者在最后一剂治疗剂后4月份注册了9月份，并且均已自由。在完成治疗时，术前均在类似的治疗方案上进行了非反应者，并未清除病毒;在治疗完成后，它们在研究中注册了至少6个Mo，并在招聘中进行了可检测的病毒计数。招募了一种具有肝脏炎症特征的非酒精性肝病（非酒精性脂肪肝炎（NASH））的HCV-NAIVIVE患者（肝脏升高（丙氨酸氨基转移酶），缺乏病毒感染和肝脏活组织检查验证的炎症）（n = 6）。该研究由委员会通过保护马萨诸塞大学的人类受试者核准，并获得了知情同意。
使用Ficoll-Paque Plus梯度（Amersham Biosciences）的离心分离PBMCs与外周血分离，如前所述（12）。e乐彩下载在1×10培养6/ ml在RPMI 1640介质（Invitrogen Life Technologies）中的96孔板中，具有10％FBS（Hyclone）和1％非氨基酸（Sigma-Aldrich）。 ODN2216（CPG-A）来自于invivoLON;单纯疱疹病毒（HSV KOS-1 Strand，UV辐照）是马萨诸塞大学R.威尔士博士（伍斯特，MA）的一份礼物; RIL-10和TNF-α都来自PEPROTECH。 ELISA试剂盒（IL-10和TNF-α）来自BIOSource International的BD Bioscience和IFN-α。 HCV核心蛋白购自生物寡核蛋白。使用Ortho HCV核心AG ELISA测试试剂盒（Wako Chemicals）量化患者血浆中的RHCV核心蛋白和核心蛋白质含量。基于HCV核心ELISA中测定的结果来表明RHCV核心蛋白的浓度。用β-半乳糖苷酶稳定RHCV核心蛋白制剂;因此，用β-半乳糖苷酶与HCV蛋白（生物阶段）相同的表达和纯化，用作阴性对照。 LPS重组蛋白的污染是<0.01 EU/ml (by 雷米 Amebocyte测定; Biowhittaker）。抗TNF-α，同种型对照和抗TLR2和抗TLR4 ABS购自高沸腾;反IL-10 AB来自BioSource International。
根据制造商的建议（Miltenyi Biotec），使用抗BDCA2 ABS与PBMC分离PDC。简而言之，PBMCS（108 将e乐彩下载/100μL分离缓冲液（冰冷PBS，0.5％BSA和2mM EDTA）与FCR阻断试剂一起温育（50μL/ 10.8 e乐彩下载）和抗BDCA-2-BIOTIN AB（100μl/ 108 e乐彩下载）在+ 4℃下10分钟，然后加入400μl分离缓冲液/ 108 e乐彩下载，FCR阻断剂（150μl/ 108 e乐彩下载）和抗生物素微珠（200μl/ 108 e乐彩下载）在+ 4℃下15分钟。温育后，用20体积的冷分离缓冲液洗涤PBMC，并通过磁柱过滤。增加BDCA2的纯度+ PDC，使用新鲜柱重复磁性分离。通过用链霉抗生物素蛋白-PE和抗CD123-苯并键合ABS染色后，通过流式e乐彩下载术分析测定的分离的PDC的纯度是>95％（数据未显示）。对于IFN-α产生和凋亡研究，在没有10％FBS和5ng / ml RIL-3（PEPROTECH）的RPMI 1640培养基中培养48小时，在不存在或存在TLR9配体的情况下，在RPMI 1640培养基中培养48小时。
CD14+ 随着制造商推荐的，使用抗CD14 ABS涂覆的磁珠（MiteNyi Biotec）与PBMC分离e乐彩下载。简而言之，107 将PBMCS /80μL与20μL抗CD14 ABS涂覆的微珠孵育15分钟，然后用20体积的分离缓冲液洗涤，并如对PDC的描述纯化。
根据制造商的说明，使用“Te乐彩下载阴性隔离试剂盒”（Dynal Biotech）纯化T淋巴e乐彩下载。简而言之，PBMCS（1×107/200μl10％FBS-PBS）与20μlB混合物（含有抗CD14，CD16，CD56，HLA-DR / DP和CD235A）温育10分钟，洗涤，并与之孵育在室温下100μL耗尽Dynabeads 15分钟。在磁场中分离非Te乐彩下载，而Te乐彩下载被洗涤并用PDC用于共培养。
流式e乐彩下载仪分析
对于表型化，PBMC用标记的抗谱系ABS（CD3，CD8，CD11c，CD14，CD20和CD56）和抗CD4，或抗CD123（来自BD Biosciences的CD20）和抗BDCA-2（Miltenyi）染色（Miltenyi Biotec）或匹配同种型控制ABS（BD Biosciences和Miltenyi Biotec），用PBS中的2％多聚甲醛固定，并通过流式e乐彩下载术分析。使用FACSCalibur流式e乐彩下载仪收集来自对应于单核e乐彩下载的栅极的十万个事件，并用CellQuest软件（BD Biosciences）分析。
使用Abotarget Kit（BioSource International）检测PDCe乐彩下载凋亡，并通过流式e乐彩下载术分析。基于尺寸和粒度栅化PDC，并分析荧光e乐彩下载的存在。
RNA分离和实时PCR
根据制造商的说明，使用Qiagen的RNEasy MicroKit从冷冻肝脏组织中分离出总RNA。根据制造商的说明，使用第一链cDNA合成试剂盒（Promega）进行逆转录。将一个微图谱的总RNA转录为20-μl反应体积的cDNA。对于通过实时PCR的转录物定量目的，根据制造商的说明（Eurogentec）使用含有热启动DNA聚合酶的SYBR绿色混合物。 CD123的引物（前进5'-CGA ACC TAA GGA TGA AAG CAA AGG-3'和反向5'-TCG GAC GGT GTA GTT GGT CAC TTC-3'）和BDCA-2（前进5'-TTG AAA GaA CCA Cac CCC GaA AGT-3'和反向5'-Tag CTT TCT ACA ACG GTG GOT GCC-3'）来自IDT。 18岁的底漆是从AMACION购买的。使用1μLcDNA的PCR在Icycler热循环仪（Bio-rad）中进行。在95℃下施加热开始相10分钟，均为所有引物。在95℃下扩增cDNA（CD123和BDCA-2的32个循环为32个循环，18℃），10s，60℃，72℃，25 s。在每个循环中，通过监测DSDNA结合SYBR绿色的荧光增加来检测PCR产物的积累。 PCR产物的解离/熔化曲线在55℃至95℃的范围内构成。使用下式的Bio-rad Icycler软件和比较阈值（CT）方法分析数据：ΔCt= CT（靶，CD123或BDCA-2） - CT（标准化器，18秒）。与中等对照相比，在实验组中折叠CD123和BDCA-2MRNA表达的增加，计算为2 - （ΔΔct）.
统计分析
使用了Wilcoxon非参数测试，Bartlett在MACG4计算机（Apple）上的STITVIEW（SSS Institute）程序中的相关性Z分数分析。
结果
低IFN-α产生与慢性HCV感染患者外周血的PDC减少的频率相关
IFN-α是一种天然存在的蛋白质，具有不同的抗病毒和免疫调节效果（13）。健康的个体响应于AG或丝分裂原的感染和刺激而产生IFN-α。我们测试了慢性HCV感染患者的PBMC可能有损害生产IFN-α的能力。来自治疗 - 幼稚慢性HCV感染患者的PBMC中IFN-α的基线水平和正常对照均低且可比较（图1⇓A）。由于TLR9的独特表达和PDC产生IFN-α的能力，在用TLR9配体，CPGA或HSV刺激PBMC后，评估IFN-α水平的IFN-α水平是PDC功能的反射性（5, 6, 7, 14, 15）。在用TLR9配体进行体外刺激后，我们发现在HCV感染患者中的IFN-α的产生显着降低了（CPG-A， p < 0.004; HSV, p < 0.003) (Fig 1⇓A）。可以通过功能损伤或PDC丧失来解释IFN-α生产中的这种深刻缺陷。为了识别循环的PDC群体，我们利用了在PDC上表达的不同表面标记，BDCA-2和CD123（6, 7, 8）。使用流式e乐彩下载术，我们发现慢性HCV感染的患者具有显着的PDC循环群的丧失（被确定为BDCA2+/CD123+），与对照相比（图1⇓B）。在HCV感染患者中循环PDC的平均频率降至0.12±0.0.04％，从对照中看到的平均值0.28±0.11％（p < 0.0003) (Fig. 1⇓C）。
慢性HCV感染患者显示IFN-α production and reduced frequency of PDCs in peripheral blood. A，PBMCS（1×107/ ml）对照（n = 14）和治疗 - 幼稚的HCV感染患者（n = 18）在体外用CpG-A（5mM）或UV辐照的HSV（1PFU / Cell）刺激48小时，ELISA分析IFN-α的产生。 B，通过流式e乐彩下载仪用所示的ABS，固定的ABS，固定和分析，如下所述，新鲜分离的PBMC染色 材料和方法。显示了一种代表性控制和一个HCV感染患者的荧光强度点迹。 C，基于BDCA2的个体对照组和HCV感染患者的PDC的频率+/CD123+ 显示染色。水平杆表示手段。
增加PDC凋亡和IFN-α的损伤与活性HCV感染相关
e乐彩下载凋亡的e乐彩下载死亡，其特征在于整体e乐彩下载膜对磷脂酰丝氨酸的表达，或坏死可能涉及丧失e乐彩下载群（16）。 annexin V.菲特/碘化丙啶（PI）染色显示，从健康对照中分离的PDC表现出低基线凋亡，其在用TLR9配体体外刺激后增加（图2⇓, A 和 B）。相比之下，来自HCV感染患者的新鲜分离的PDC显示annexin v频率增加+ PDC与表明基线凋亡增加的对照相比。我们发现在用TLR9配体体外刺激后，从HCV感染患者中发现了较高的凋亡PDC频率（图2⇓, A 和 B）。新鲜分离的PDC与台盼蓝的染色显示出HCV感染患者和对照之间的膜完整性没有差异（未显示数据），表明e乐彩下载坏死不太可能考虑循环PDC的丧失。总体而言，HCV患者的PDC在基线上的对照时显着更高的凋亡（p <0.026）和TLR9刺激后（p < 0.032) (Fig. 2⇓B）。这些数据表明，来自HCV患者的PDC在体内进行凋亡。
来自HCV感染患者的纯化的PDC是凋亡的，产生低IFN- α. PDCs were purified by MACS, based on BDCA-2 expression, as described in 材料和方法，来自正常对照和治疗 - 幼稚HCV患者。 A，用Annexin V染色用TLR9配体（UV辐照的HSV，1PSV，1PFU / Cell）刺激的新鲜分离的PDC或PDCs染色Annexin V.菲特 和pi并通过流式e乐彩下载术分析。 左上象限 代表坏死e乐彩下载， 右上方 代表晚期凋亡， 右下 代表早期凋亡，和 左下方 是可行的e乐彩下载。荧光强度点迹显示出从一个代表性控制（最佳）和一名患有慢性HCV感染的患者（底部）。 B，Pdcs被培养，染色和分析 A。数据显示为annexin v的频率+ 来自14个正常和18个HCV感染个体的PDC的e乐彩下载（*表示 p <在培养基和HSV刺激（TLR9）中的对照中0.05次; ＃表示 p <在HCV患者中培养基和TLR9刺激样品之间0.05）。 C，来自对照和HCV患者的PDC（1×105/well) were stimulated in vitro with CpG-A (5 mM) or UV-irradiated HSV (1 PFU/cell) for 48 h, and IFN-αELISA分析了生产（∗ indicates p <中等和CPG-A和CPG-A之间0.005 p <中培养基和HSV之间的0.001; ＃表示 p <中等和CPG-A和CPG-A之间0.025 p <HCV患者中培养基和HSV之间的0.032）。
为了评估PDC的功能能力，我们纯化了BDCA2+ 使用磁性电池分选的e乐彩下载。尽管从PBMC的PDC的回收与通过流式e乐彩下载术确定的PDC的低频率成比例，但是在从HCV患者和对照中分离的PDCs之间的CD123和BDCA2标记的表达水平没有差异（数据未显示数据）。从HCV患者纯化的相同数量的PDCs在与对照相比，用TLR9配体的体外刺激产生了IFN-α的显着较低的IFN-α（图2 ⇑C）。这些结果导致我们得出的结论是，通过HCV感染患者的PDC存在两种组分降低IFN-α产生：首先，循环PDC的频率降低，第二，功能容量额外缺陷PDC生产IFN-α。
要确定是否与正在进行的HCV感染相关的PDC功能障碍，我们测试了在基于IFN-α的治疗后清除HCV病毒的患者，并且没有可检测的病毒水平（持续响应者），并与治疗后未能清除HCV的人（无回复者） 。与无响应者具有可检测的HCV载荷的患者相比，持续响应者与HCV-Naive对照相比，IFN-α的产生没有差异（图3⇓A）。此外，循环PDC的频率在持续响应者（0.3±0.22％）和对照（0.28±0.15％）之间相当，但在无应答者（0.19±0.09％）中减少（图3⇓B）。我们认为PDC频率与慢性HCV感染患者血浆中HCV核心蛋白的水平相关的PDC频率（图3⇓C）并且与患者年龄，病毒数或肝酶（数据未显示）无关。这些结果表明，正在进行的病毒复制和/或病毒诱导的机制可能是患者中PDC的损失。
IFN-αPDC的生产和频率在清除抗病毒治疗后清除HCV感染的患者中标准化。 PBMC（1× 107/ ml）对照（n = 26）清除的HCV患者（持续响应者， n = 16）或在治疗后未能清除病毒（无回复者， n = 14）用TLR9配体（CPG-A，5mm）刺激48小时，以评估ELISA的IFN-α（A）或用抗CD123和抗BDCA-2 ABS染色并通过流式e乐彩下载术分析（B）。观察到控制和响应者之间没有重大变化。 C，使用Ortho HCV核心Ag ELISA量化HCV患者血浆中的HCV核心蛋白。绘制外围循环中的PDC的频率针对相应的血浆HCV核心蛋白的值。相关性z得分= -3.402， p <0.026（Bartlett测试）。这 插入 显示HCV核心值的放大图像<1000 fMol/L.
HCV核心蛋白在PBMC中抑制IFN-α产生，但不含孤立的PDC
基于观察结果，PDC损失与持续的HCV感染和慢性感染患者中可检测的HCV核心蛋白有关，我们专注于可能考虑PDC缺陷的病毒因素。在由HCV基因组编码的10种不同蛋白质中，核心蛋白质具有多种免疫调节效应（17）。此外，HCV核心蛋白在外周血中可检测到（图3⇑C），让它与肝脏之外的免疫e乐彩下载相互作用（18）。因此，我们假设HCV核心蛋白可能会损害IFN-α的生产。如图4所示⇓A，添加RHCV核心蛋白未能诱导IFN-α产生或影响TLR9刺激的纯化PDC中的IFN-α产生。相比之下，我们发现在HCV核心蛋白存在下PBMC中的TLR9触发IFN-α的显着降低了（图4⇓B）。我们的重组核心蛋白含有β-半乳糖苷酶作为稳定剂;因此，为了控制核心蛋白的生物活性，我们在测定中包括β-半乳糖苷酶对照。如图4所示⇓B，β-半乳糖苷酶未激活PBMC，并且未能影响TLR9触发的IFN-α产生。这表明HCV核心蛋白间接抑制PDC的IFN-α产生的可能性，并且可能影响除PDC之外的e乐彩下载群。
HCV核心抑制TLR9触发的IFN-α production in PBMCs but not in purified PDC population. Purified PDCs (A）（1×106/ ml）或pbmcs（B）（1×107/ml) were stimulated with TLR9 ligand (HSV, 1 PFU/cell), HCV core (22,500 fM), β-galactosidase (5 μ如图所示，g / ml）或它们的组合。四十八小时后，生产IFN-α使用ELISA测定无e乐彩下载培养上清液。意思是± SE from five controls and six HCV-infected treatment-naive patients are shown as nanograms per milliliter. C 和 D，如上所述刺激PBMC。分析培养上清液对IL-10（C）和tnf-α（D）ELISA的生产。从五种对照和六个HCV感染患者的平均值±SE显示出来。 （C，*表示 p <培养基和HCV芯之间0.023; ＃表示 p <TLR9配体和TLR9之间的0.031+ 控制中的HCV核心; ¶表示 p <培养基和HCV芯之间0.021;和§ indicates p <TLR9配体和TLR9之间0.028+ HCV感染患者中的HCV核心）。 （D，*表示 p <介质和HCV核心和＃表示0.016表示 p <TLR9配体和TLR9之间的0.036+ 控制中的HCV核心; ¶表示 p <培养基和HCV芯之间0.028;和§ indicates p <TLR9配体和TLR9之间0.038+ HCV患者中的HCV核心）。
PDC功能由e乐彩下载因子微环境密切调节（19）;因此，我们试图评估HCV核心蛋白诱导的TLR9刺激的PBMCSe乐彩下载因子Milieu的变化是否受影响IFN-α的生产。我们以前表明HCV核心蛋白在单核e乐彩下载中触发e乐彩下载因子产生（12, 20）。与该HCV核心蛋白单独或与TLR9配体组合一致，诱导IL-10（图4⇑C）和TNF-α（图4⇑D）来自对照和HCV感染患者的PBMC。 TLR9刺激单独诱导最小的IL-10或TNF-α与未刺激的e乐彩下载相比，并未改变HCV核心诱导的这些e乐彩下载因子的产生。与对照相比，HCV感染患者的IL-10和TNF-α的水平始终如一。与我们以前的研究一致（12, 20），β-半乳糖苷酶对照在单核e乐彩下载中没有诱导IL-10或TNF-α（图4⇑, C 和 D）。连同，这些数据暗示在PBMC群中，HCV核心蛋白没有直接影响PDC;然而，它触发了IL-10和TNF-α的产生，又可能影响PDC的IFN-α。
IL-10和TNF-α inhibit TLR9-induced IFN-α production and induce PDC apoptosis
为了探讨HCV核心蛋白诱导的IL-10和/或TNF-α可以影响IFN-α产生的可能性，在存在或不存在TLR9刺激的情况下，在存在或不存在的情况下刺激PBMC或TNF-α的PBMC或PDC。添加RIL-10显着抑制了PBMC中的TLR9诱导的IFN-α产生（图5⇓A）和PDC（数据未示出）以剂量依赖性方式。具有与HCV感染患者PBMC中诱导的水平相当的IL-10浓度（100pg / mL）的最低剂量（图4⇑C）仍然导致PDC的IFN-α产生抑制。膜蛋白v的流式e乐彩下载术分析菲特/ PI染色的e乐彩下载显示，当RIL-10与TLR9配体一起加入RIL-10时，观察到RIL-10单独诱导PDC中的e乐彩下载凋亡，并且当RIL-10一起加入时，观察到PDCe乐彩下载凋亡的增加（图5⇓B）。 IL-10（10ng / ml）的最高剂量和IL-10的组合都导致了PI的增加+，晚期凋亡e乐彩下载。
IL-10和TNF-α impair IFN-α production and induce PDC apoptosis. A 和 C，PBMCS（1×107/ ml）来自正常对照（n = 4）在体外刺激TLR9配体（HSV，1 PFU / CELL），或没有RIL-10（A）或TNF-α（C), as indicated. After 48 h, IFN-α使用ELISA在培养上清液中分析生产。∗, p <单独的TLR9配体相比，0.05。 B 和 D, PDCs from control donors were cultivated in vitro in the absence (medium) or presence of IL-10 or TNF-α（如所示的浓度），TLR9配体（HSV，1 PFU / CELL），或TLR9配体加IL-10或TNF的组合α (concentrations as indicated) for 48 h. PDCs were stained with Annexin V菲特 和pi并通过流式e乐彩下载术分析。来自一个代表性控制的荧光强度点迹 n = 3显示了类似的结果。增加的膜蛋白V染色表明e乐彩下载凋亡。
类似于IL-10，RTNF-α在PBMC中以剂量依赖性方式废除TLR9诱导的IFN-α（图5⇑C）和PDC（数据未显示）。 TNF-α还诱导PDC凋亡和增强TLR9诱导的e乐彩下载死亡（图5⇑D）。这些结果证明IL-10和TNF-α每种抑制IFN-α的产生并诱导PDC的凋亡。
单核e乐彩下载是HCV核心诱导的e乐彩下载因子的来源，可通过PDC抑制IFN-α产生
由于Ril-10和TNF-α可以模仿HCV核心蛋白对PBMC中的TLR9诱导的IFN-α产生的影响，我们研究了IL-10和TNF-α的中和是否可以消除HCV核心蛋白在IFN上的抑制作用-α生产。如图6所示 ⇓A，抗IL-10-和抗TNF-α-中和ABS各自部分地阻断了HCV核心蛋白对PBMC产生的IFN-α的抑制作用。此外，抗IL-10-和抗TNF-α-中和ABS的组合导致添加剂效果，并通过HCV核心蛋白完全阻断IFN-α抑制。为了确认中和ABS的特异性，通过添加RIL-10，TNF-α和它们的组合来模拟HCV核心作用，并表明抗IL-10-和抗TNF-α-中和ABS可以防止IL-10和TNF-α诱导的IFN-α产生的抑制。这些数据证实，IL-10和TNF-α均涉及HCV核心介导的IFN-α产生的抑制。
单核e乐彩下载衍生的IL-10和TNF-α inhibit IFN-α production by PDCs. A，来自正常个人的PBMC（n = 5）以1×10接种7/ml and preincubated with isotype control (10 μg / ml），抗IL-10（10μg/ml), anti-TNF-α (10 μg / ml），或抗IL-10加抗TNF-的组合α (10 μG / ml各）ABS在室温下保持30分钟。然后用UV辐照的TLR9配体（HSV，1PFU / CELL）或TLR9配体的组合刺激e乐彩下载，与HCV芯（22,500cm），或IL-10（0.1ng / ml）或TNF-α（0.01 ng / ml），或IL-10（0.1 ng / ml）加上TNF-α（0.01 ng / ml），如图所示。培养上清液以后收获48小时，而IFN-α在ELISA分析了生产。这∗ represents p <0.05与TLR9刺激相比。 B，PBMCS（1×107/sample/ml) and corresponding numbers of CD14-depleted PBMCs from four normal controls were stimulated with TLR9 ligand (HSV, 1 PFU/cell) alone or with a combination of TLR9 ligand plus HCV core (22,500 fM) for 48 h. Culture supernatants were analyzed for IFN-α生产;数据显示为均值± SE ng/ml. “ns” indicates no significant changes between controls and HCV-infected patients. C 和 D, CD14+ cells (1 × 106如所描述的，从PBMC纯化/ ml） 材料和方法 并刺激HCV核心（22,500cm）48小时，然后分析IL-10（C）或TNF-α（D) production by ELISA. Stimulation with phenol-purified LPS (LPS, 1 μG / ml）用作单核e乐彩下载功能的阳性对照;β将羟氢酶包含为HCV核心蛋白的阴性对照。显示来自三种对照和五名HCV感染患者的数据，如平均值± SE pg/ml. ns indicates no significant changes between controls and HCV-infected patients. E，用TLR9配体（HSV，1PFU / CELL）刺激人的PBMC，并增加RHCV核心蛋白的浓度，如48小时所示。在ELISA分析无e乐彩下载上清液中的IFN-α（n = 4）。 *表示 p <与TLR9配体相比0.05。
PBMC表示由淋巴e乐彩下载，NKe乐彩下载，单核e乐彩下载和循环DC组成的异质群。其中，淋巴e乐彩下载产生可忽略量的IL-10，而单核e乐彩下载是IL-10和TNF-α的主要生产商，由于其在DCS上的数值流行率。因此，我们测试了单核e乐彩下载是HCV核心诱导的IL-10和TNF-α的来源，其抑制PDC的IFN-α产生。 CD14的磁珠分离+ 来自PBMC的e乐彩下载导致100％纯CD14− population and a >90% pure CD14+ 人口（数据未显示）。 CD14的消耗+ e乐彩下载不影响TLR9诱导的IFN-α的产生，但它完全阻止了HCV核心诱导的TLR9配体刺激的PBMC中IFN-α产生的抑制（图6⇑B）。纯化的CD14+ 来自HCV感染患者的e乐彩下载群和正常对照产生IL-10（图6⇑C）和TNF-α（图6⇑D）响应HCV核和LPS，一种TLR4 / CD14配体，用作单核e乐彩下载活化的阳性对照。这些结果证实了CD14+ 单核e乐彩下载是诱导IL-10和TNF-α的HCV核心蛋白的主要靶标，其通过PDC抑制IFN-α产生。 HCV核心蛋白以剂量依赖的方式抑制TLR9触发的IFN-α产生（图6⇑E）和影响IFN-α（〜4500cm）的最低剂量的HCV核心蛋白质接近慢性HCV感染患者血浆中检测到的HCV核心蛋白水平的范围（图3⇑C）。
单核e乐彩下载在HCV核心诱导的IFN-α产生中抑制的中介的关键作用进一步研究了单核e乐彩下载或T淋巴e乐彩下载的分离PDC的培养中。虽然TLR9刺激在单核e乐彩下载或Te乐彩下载存在下PDC中诱导IFN-α产生的IFN-α产生，但仅当PDC与单核e乐彩下载和不具有Te乐彩下载的PDC与Te乐彩下载一起获得时，才会发生HCV核心蛋白的IFN-α的产生（图7⇓A）。 TNF-α和IL-10都是通过单核e乐彩下载PDC的HCV核心蛋白诱导但不在Te乐彩下载-PDC共培养物中诱导，进一步指向单核e乐彩下载衍生的e乐彩下载因子在抑制IFN-α的抑制中的作用（图。7.⇓, B 和 C）。我们及其其他人报道了HCV核心蛋白触发通过TLRS的单核e乐彩下载活化，特别是通过膜表达的TLR2（20）和tlr4（21）。在本研究中，我们发现抗TLR2但不是抗TLR4可以部分恢复PBMC中TLR9触发IFN-α产生的HCV核心介导的抑制（图7⇓D）。通过抑制蛋白多糖（TLR2配体）和LPS（TLR4配体）和单核e乐彩下载中的LPS（TLR4配体）介导的TNF-α产生的抗TLR2和抗TLR4阻断ABS的比例分别表现出来（图7⇓E）。这些数据表明，TLR2在单核e乐彩下载激活中起重要作用，并涉及HCV芯对PDC产生IFN-α的抑制作用。
HCV核心损害TLR9诱导的IFN-α production in PDCs in the presence of monocytes but not T lymphocytes. BDCA-2+ 来自健康捐赠者的PDC（1×105/嗯）和Syngeneic单核e乐彩下载（1×106/well, ▦）或T淋巴e乐彩下载（1× 106/well, ▪在1:10 PDC：单核e乐彩下载或PDC：Te乐彩下载比中，用或没有HCV核心蛋白（22,500cm）的TLR9配体（CPG-A，5mm）的体外刺激。生产的IFN-α (A），TNF-α（B）和IL-10（C）在ELISA分析（n = 3). D，将人的PBMC在室温下用表示的ABS孵育30分钟，然后用具有或不具有RHCV核心蛋白（22,500cm）的TLR9配体（HSV，1PFU / Cell）刺激，如48小时所示。在ELISA分析无e乐彩下载上清液中的IFN-α（n = 3）。 *表示一个 p <0.05与TLR9配体相比加上相应的控制ABS;这¶ indicates a p <与TLR9配体相比0.05。 E, Human monocytes were incubated with indicated Abs for 30 min at room temperature and then stimulated with TLR2 (proteoglycan (PGN), 1 μg / ml）或tlr4（lps，100μg / ml）配体16小时。 TNF-α production in cell-free supernatants was analyzed in ELISA (n = 3）。 *表示一个 p <0.05与相应的控制ABS相比。
为了检查HCV核心蛋白和e乐彩下载因子Milieu在PDC功能障碍中发挥作用，我们分析了纳什患者的患者，炎症性肝脏病变症（22）。我们发现外围循环中PDC的频率（图8⇓A）和IFN-α的生产（图8⇓B），tnf-α（图8⇓C）和IL-10（图8⇓D）在肿瘤和对照的患者之间，PBMC中的比较。此外，类似于对照，HCV核心蛋白在纳什患者的PBMC中降低了TLR9触发的IFN-α产生（图8⇓B），表明HCV核心蛋白可以损害PDCS功能。
纳什患者的PDC和e乐彩下载因子产生的频率与对照相当。 A，PDC的频率（BDCA2+CD123+）显示各种对照和纳什患者。水平杆表示手段; ns表示没有重大变化。 B-D.，PBMCS（1×107/样品/ ml）来自正常对照（n = 4）或纳什患者（n 用TLR9配体（HSV，1PFU / CELL）刺激= 6），或者用TLR9配体加HCV核（22,500cm）的组合刺激。分析培养上清液用于IFN-α（B），TNF-α（C）或IL-10（D）特定ELISA的生产;数据显示为平均值±se ng / ml。
最后，我们考虑了假设，即慢性HCV感染患者血液中PDC数量的明显“损失”可能是由于PDC归巢到肝脏，HCV感染的主要部位。我们确定了PDC标记的mRNA的水平（5, 6, 7, 8），CD123（图9⇓A）和BDCA-2（图9⇓B）与无染量对照或纳什患者相比，HCV感染患者的肝脏显着较高，表明慢性HCV感染可能导致PDC舱室化。
HCV感染的患者在肝脏中具有升高的PDC标记CD123和BDCA-2。 CD123的RNA水平编码（A）和BDCA-2（B）通过PCR在肝脏中评估（n = 3），纳什患者（n = 6）和HCV感染，治疗 - 幼稚患者（n = 28）。 *显示 p <0.05与对照相比。
讨论
虽然各种宿主和病毒导出的因素可以在慢性丙型肝炎感染过程中考虑病毒持续性，但免疫缺陷的复杂性和病毒与不同免疫e乐彩下载类型之间的相互作用仍然得到完全理解。在本研究中，我们报告慢性HCV感染患者在体外刺激PDC后产生IFN-α的能力降低。我们的研究划算了这些患者中的IFN-α产生的至少三种原因。首先，由于e乐彩下载凋亡，我们发现循环PDC的损失。其次，减少了现有循环PDC的容量以产生IFN-α。第三，我们鉴定了HCV感染中肝脏的增加的PDC归巢。我们还证明，降低了与HCV核心蛋白的增加的血浆水平相关的循环PDC频率。此外，我们发现在PBMC HCV核心蛋白中触发单核e乐彩下载衍生的IL-10和TNF-α产生。这些e乐彩下载因子反过来导致PDC凋亡和IFN-α的产生受损，从而与在慢性病感染患者中看到的PDC缺陷密切相关。
PDC在病毒感染后产生大量IFN-α（7, 8）。我们发现HCV感染患者的PDC在TLR9刺激用合成配体，CPG-A或天然配体，UV灭活的HSV刺激时减少了IFN-α的生产能力。 6, 7, 8, 14, 15）。这些数据与来自Murakami等人的先前出版物一致。 （23）和Wertheimer等人。 （24），并与Longman等人的报告矛盾。 （25），可能是由于采取了评估PDC的IFN-α的IFN-α的方法的差异。 IFN-α对CD4中IFN-γ的UMN-γ的上调建立先天和自适应免疫之间的有效链接+ 和 CD8+ Te乐彩下载和NKe乐彩下载，调节Te乐彩下载对IL-12诱导的IFN-γ分泌的反应，以及随后的TH1响应驱动（7, 26）。实际上，慢性HCV感染患者已经描述了多种免疫缺陷，其可以与减少的IFN-α产生相关，包括CTL，NKe乐彩下载的低活性的响应不足，并且具有低中和能力的ABS的产生（2, 13, 27, 28, 29）。据报道，IFN-α是PDCS的有效存活因子（30, 31）;因此，IFN-α的内部缺陷可能有利于HCV感染患者中的用于损失PDC的自我破坏性回路。我们的研究结果表明，循环PDC在慢性HCV感染患者中增加了基线和TLR9诱导的e乐彩下载凋亡。慢性HCV与对照组患者报道了循环PDC的绝对数量减少（23, 24, 25）。来自IFN-α介导的抗病毒效应的HCV逃生机制在肝脏中最重要，其中HCV重复和大部分病毒和病毒衍生的蛋白质。在HCV感染的急性期间描述了高IFN-α生产（32, 33）;但是，关于慢性HCV感染的报告是矛盾的（8, 9, 10, 11）。在本研究中，我们确定了PDC标志物，BDCA2和CD123的mRNA水平增加，表明PDC可以募集到慢性HCV感染患者的肝脏中。与此概念一致，CD80+, CD83+和CD86+ 具有DC形态的e乐彩下载在HCV感染患者的肝脏中鉴定出（34）。肝脏中那些PDC的功能能力仍有待评估。虽然我们的数据显示PDC功能障碍，但降低的AG特异性Te乐彩下载活化和髓样和单核e乐彩下载衍生的DCs的Ag呈递能力可能进一步有助于慢性HCV感染中病毒特异性免疫激活的损失（12, 35, 36）。
我们观察，只有患有可检测的HCV水平，而不是持续的响应者或纳什患者，遇到PDC的损失和IFN-α生产能力受损的患者表明，在PDC的损失和功能损害中对病毒的直接作用。 HCV编码长的多蛋白，其裂入至少10个已知的蛋白质（37）。核心蛋白质，首先从病毒聚丙烯切割，具有不同的免疫调节能力。同意以前的研究（18, 38），我们发现在所有分析的HCV感染患者的外周血中发现HCV核心蛋白。此外，我们鉴定了慢性HCV感染患者血浆核心蛋白水平与循环PDC频率之间的反比关系。我们的研究表明，HCV核心蛋白诱导单核e乐彩下载中的IL-10和TNF-α产生，这些e乐彩下载因子又导致PDC凋亡和PDC的容量损伤以产生IFN-α。
HCV核心蛋白可以与多种e乐彩下载因子相互作用;调节e乐彩下载基因的表达和控制信号传导途径在不同e乐彩下载类型中，包括DCS（在refs中审查。 17 and 37）。我们先前已经报道，单核e乐彩下载通过TLR2识别HCV核心蛋白，TLR2激活触发e乐彩下载内信号传导途径诱导TNF-α（20）。最近，TLR4也涉及通过HCV核心蛋白质的e乐彩下载活化（21）。在本研究中，我们发现抗TLR2但不是抗TLR4，ABS部分地阻止了HCV核心蛋白对TLR9触发的IFN-α产生的抑制作用，从而暗示核心蛋白，通过TLR2起作用调制PDC功能。我们之前已经显示过，通过HCV核心触发的e乐彩下载内信号传导途径涉及的NF-κB，AP-1和诱导IL-10和TNF-α的MAPK（20）。 HCV核心蛋白在巨噬e乐彩下载中诱导IL-10和TNF-α的产生，其浓度与HCV感染的个体血清中发现的HCV核心蛋白水平相当。肝脏中的巨噬e乐彩下载和单核e乐彩下载也可能暴露于比循环水平高的HCV核心蛋白甚至更高的HCV核心蛋白。此外，慢性HCV感染患者的单核e乐彩下载产生了更高水平的IL-10和TNF-α，并在HCV感染患者中血浆中报告了这些e乐彩下载因子的增加的水平，与对照组（39, 40）。在本研究中，我们证明AB中和IL-10和TNF-α在TLR9加HCV核心刺激的PBMC中恢复了IFN-α的产生。此外，RIL-10和TNF-α以剂量依赖性方式抑制TLR9诱导的IFN-α产生和PDC凋亡。该观察结果与先前的出版物一致，表明微环境，包括e乐彩下载因子和趋化因子的存在，对于PDC功能至关重要（19, 41, 42, 43）。 ILS 3,4,7和15促进病毒感染e乐彩下载的IFN-α产生，而TNF-α和IL-10抑制它（19）。我们确定了CD14+ 单核e乐彩下载是HCV核心的主要目标。虽然在各种研究中报告了具有特异性IL-10和/或TNF-α的特异性CD4和CD8 Te乐彩下载（44, 45），我们的共有植物实验表明，IFN-α仅在PDC /单核e乐彩下载中受到影响，但不在PDC / Te乐彩下载共培养中受到影响。这可能与核心蛋白的TLR2识别有关，因为单核e乐彩下载的TLR2具有独立识别和刺激功能，而在Te乐彩下载中，TLR2需要TCR刺激e乐彩下载激活（46, 47）。
在正常情况下，通过活化的PDC在分离病毒感染期间，TNF-α和IL-10限制IFN-α的过度生产（19）。我们的数据表明，HCV可以通过在单核e乐彩下载中诱导TNF-α和IL-10来窃取这种保护机制以实现对PDC的破坏性影响。此前提出了IL-10可以减少PDC活力，但IL-10诱导的PDC死亡的机制迄今为止未知（41）。解释了IL-10-和TNF-α诱导的PDC死亡的机制，发现IL-10和TNF-α诱导的PDC凋亡。虽然这种效果预计TNF-α，但是在不同e乐彩下载类型中的凋亡的已知触发，观察到IL-10的PDC凋亡诱导是新的。最近Marra等人的报道。 （48）显示IL-10通过膜形式的TNF-α的上调诱导调节性Te乐彩下载凋亡。因此，我们发现通过PDC功能的抗IL-10加抗TNF-αABS的添加剂保护并不令人惊讶。
我们表明，慢性HCV感染诱导e乐彩下载因子的变化，并通过IFN-α产生和e乐彩下载凋亡测量的PDC功能障碍;因此，人们可能怀疑HCV可能会诱导全球免疫抑制。为了支持这一概念，最近来自El-Sarag等人的数据。 （49从一个病例对照研究表明，HCV患者的患者对其他血型病毒感染的患病率显着更高，包括艾滋病毒，乙型肝炎，CMV，以及穴形e乐彩下载，结核病和性传播疾病。这表明慢性HCV感染的患者可能确实具有免疫抑制的迹象，导致其他感染的速率增加。实际上，IFN-α的产量受损，PDC的生产和耗尽在病毒感染中是常见的，包括艾滋病毒，人体Te乐彩下载白血病病毒1型和乙型肝炎病毒（50, 51, 52, 53, 54）;然而，在所有病毒感染中，PDC耗竭的机制可能在所有病毒感染中可能不相同。虽然对PDC的直接e乐彩下载溶解作用是可以进行逆转录病毒（HIV-1和人Te乐彩下载白血病病毒类型1），但对于HBV和黄病毒如HCV等HBV和黄病毒（如HCV）不太可能。用HIV-1单独，HCV或HIV-1 / HCV辛凝集感染的患者描述了IFN-α生产的明显模式（ 54），建议不同机制占PDC功能损伤。符合此，我们发现与HCV核心蛋白不同，HIV P24或HBV核心蛋白在PBMCs中没有抑制IFN-α产生（数据未显示）。我们发现HCV通过在单核e乐彩下载上作用并通过单核e乐彩下载衍生的介质间接影响PDC来使用替代策略。虽然我们的结果提供了通过单核e乐彩下载介导的e乐彩下载因子产生的HCV诱导的PDCe乐彩下载凋亡的机制解释，但我们不能排除慢性HCV感染患者PDC中发现的基线凋亡增加的可能性是由于病毒的直接作用在PDC上。最近的报告显示HCV复制脱胸部的存在，包括PDC（55）。有趣的是，在HSV的体内感染中导致PDC对随后的体外重新检查（56）。因此，我们不能排除HCV可能直接影响体内PDC的可能性，导致它们的e乐彩下载凋亡和对在体外随后的TLR挑战中的凋亡，如我们实验所发现的那样。
总之，我们证明慢性感染HCV的患者在PDC频率和IFN-α生产能力中具有深远的缺陷。我们的研究结果表明，HCV患者的PDC在体内用于e乐彩下载凋亡，并减少IFN-α产生的能力。我们鉴定了HCV核心诱导的IL-10和TNF-α介导这些PDC缺陷，并且即使在HCV核心蛋白的存在下，也可以去除产生e乐彩下载因子的单核e乐彩下载标准化的PDC IFN-α产生。我们的研究表明，PDC损失和IFN-α生产缺陷的病毒诱导机制可能有助于慢性病毒持久性，并且可以为HCV感染中IFN-α的治疗益处提供机械解释。
致谢
我们感谢拯救魔法博士，劳顿·德拉克博士，苏丹博士，罗纳，R.N.，Donna Giansiracusa，R.N.，Joanne Thomas，R.N.，Donna d'Agostino，N.P.和Kathy Coleman，N.P.，他们的帮助招募患者。大学患者和献血者的合作非常感谢。感谢Raymond Welsh博士（Massachusetts Medical School大学）为HSV Kos-1股票，Gunther Hartmann博士（慕尼黑大学），有用讨论，以及umass流式e乐彩下载术核心设施，具有流式e乐彩下载仪的优异支持。
披露
作者没有财务利益冲突。
脚注
本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此，本文必须明白 广告 按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
↵1 该研究得到了国家卫生研究院授予R01 AA14372（G.S.）的支持。
↵2 地址通信和转载对马萨诸塞大学医学院，医学院，MA 01605的MASACHUSTETS MECTRACH SCHINE，MASSACHUSTTS MECTRACH SCHICE，MADE，MA 01605的364街364街。电子邮件地址： gyongyi.szabo {at} umassmed.edu
↵3 本文使用的缩写：HCV，丙型肝炎病毒; PDC，血浆骨质特性e乐彩下载;纳什，非酒精性脂肪肝炎; PI，碘化丙锭; CT，比较阈值。
- 已收到 2006年2月8日。
- 公认 2006年8月30日。
- 版权© 2006 by The 美国免疫学家协会
