抽象的
6-O对通过TLRS表示的树突细胞（DC）成熟活性来检查具有各种长度的脂肪酸链的乙基 - 蛋白二肽（MDP）。从抗TLR MAB /抑制剂抑制分析判断，发现具有单辛烷酰基或硬脂酰脂肪酸链的MDP衍生物在人DCS上活化TLR2和TLR4，尽管完整和二酰基化的MDP表达无活化TLR的能力。通过单酰化的MDP的人DC活化谱基本类似于Calbette-Guérin（BCG）-Cell壁骨架（CWS）和BCG-肽聚糖（PGN）的那些类似于它们的上调的共刺激剂，HLA-DR，β的能力2-microglobulin，和激发MLR。单酰化MDP诱导细胞因子，其具有与BCG-CWS或-PGN相似的曲线，尽管它们诱导TNF-α，IL-12P40和IL-6的效力小于BCG-CWS或-PGN的效力。 MDP衍生物在正常小鼠巨噬细胞中引发了类似的活化，但对TLR2 / 4缺陷或MYD88缺陷小鼠巨噬细胞没有效果。突变 d-isogln到 l - 单酰化MDP中的-ISOGLN没有导致DC成熟活性的损失，表明核苷酸结合寡聚化结构域2的边际参与，如果有的话，如果有的话，在单酰基MDP依赖性DC成熟中。这些结果定义了佐剂活动 6-O-分子水平的酰基MDP化合物。它们靶向TLR2 / TLR4并通过DCS和巨噬细胞的MyD88依赖性途径作用。因此，观察到TLR2和TLR4的不寻常组合激活结核分枝杆菌部分反映在单酰化MDP化合物的功能性质中。这些发现推断了BCG的TLR2 / 4介导的基因TLR2 / 4介导的助剂的基本最小要求位于修饰的MDP内。
微生物具有独特的图案分子，即宿主免疫系统选择性地通过其特异性受体识别。 tlrs（1, 2）在细胞膜和核苷酸结合寡聚域（NOD）上4 family proteins (3）在细胞质中是这种微生物模式识别受体的代表性。它们触发宿主免疫能力细胞中的防御反应。已经检查了每个模式识别受体的配体的最小结构基质，主要是使用合成化合物（4, 5, 6）。它们通常表现出薄弱的受体激活能力，但与母体图案分子相比，保留受体用法和诱导细胞因子谱。我们阐明了Bacillus Calmette-guérin（BCG）的肽聚糖（PGN）结构特异性地激活TLR2和TLR4（7），虽然大多数革兰氏阳性细菌刺激TLR2，但不是TLR4（8, 9）。 BCG组件同时激活TLR2和TLR4的最小必要要求保持不明。本研究的目的是使用合成化合物鉴定TLR2 / 4激活的结构签名。
Muramyldipeptide（Murnac-l-翼-d-isogln; MDP）是在宿主细胞中维持PGN介导的免疫应答的诱导所需的细菌细胞壁骨架（CWS）中的最小结构单元。10）。它被NOD2识别，但不是TLRS，以诱导NF-κB的激活（11）。然而，MDP介导的NF-κB活化效率低下促进了TNF-α蛋白质产生。当TLR信号传导与MDP介导的NF-κB活化相一致时，增加了NF-κB依赖性细胞因子的翻译（12）。因此，即使对于Nod2依赖性细胞因子产生，MyD88依赖性TLR信号传导也至关重要。这些结果在了解佐剂功能和随之而来的有效疫苗开发方面也具有深远的影响。
使用特异性TLR阻断MAb，我们已经表明，TLR2和TLR4是人单核细胞衍生的树突细胞（DC）中BCG-PGN的受体（7）。来自TLR敲除小鼠的巨噬细胞的实验主要支持分析BCG介导的人体细胞的可能施用（7, 13）。 BCG-PGN的受体用法是非典型的，因为大多数细菌PGN被TLR2专门识别（1, 2, 8, 9）。 MDP是BCG-PGN的主要组成部分，但没有能够激活TLR2或TLR4（14）。因此，TLR2或TLR4的识别和配体活性所需的BCG-PGN（MDP的部分以外的部分）中的精确图案和不同的基序（1, 14, 15, 16）仍然不清楚。这些观察结果以及Nod2的已知作用（3）表明DCS的BCG-PGN识别的分子基质更复杂。
BCG-CWS（BCG-PGN）的PGN通过接头区域结合半乳糖链（l-rham-d-gal）和磷酸（17）。这种糖链的推定结合位点是6-O portion of MDP (18）。使用人树突细胞（DCS）的活化标志物，我们研究了通过合成MDP衍生物对DC活化的分子碱。我们发现TLR2和TLR4由MDP衍生物同时激活6-O-octanoyl或硬脂酰酰化。单酰化的MDP用类似于BCG-PGN的轮廓施加DC成熟活性，但是当通过细胞因子诱导判断时通常比BCG-PGN更少。单酰基MDP的DC成熟活性与Nod2识别肽序列无关， l-翼-d-isogln。因此，TLR2 / 4介导的MYD88活化的结构特征应存在于单酰化MDP的分子结构内。
材料和方法
试剂和ABS
FCS是从Biowhittaker获得的; DMEM和RPMI 1640购自Invitrogen Life Technologies; GM-CSF和IL-4是从PEPROTECH EC获得的; LPS（大肠杆菌 从Difco获得了O127：B8）;肽聚糖从 金黄色葡萄球菌 是从Fluka-Chemie获得的; MDP是从Calbiochem购买的; MDP衍生物在S. Kusumoto博士的实验室（大阪大学，日本大阪大学）;从Sigma-Aldrich获得小鼠IG G2B（IgG2B）;抗CD83 MAB购自COSMO BIO;抗CD80 mAb是从免疫教育获得的;抗CD86 mAb是从ACELL获得的;抗HLA-DR（IMMU-357）和抗β2-microglobulin mabs购自Immunotech; Anti-TLR4（HTA125）是K. Miyake博士（东京东京，日本东京大学）的礼物;如前所述，在我们的实验室中产生抗TLR2（TLR2.45）（7, 19）; FITC-CONCUINGATED GOAT抗小鼠IGG F（AB'）2 是从美国Qualex获得的。对于TLR4刺激的LPS良好的拮抗剂（E5531）是Eisai的礼物（20, 21）。
合成MDP衍生物
本研究中使用的MDP衍生物被综合（如前所述）（22, 23, 24）。简而言之，MDP有6-O - 通过Kusumoto等人的方法合成 - 具有长脂肪酸链的方法。 （22, 23, 24）。图。1⇓ 显示所用化合物的化学式。 6-O - 化的MDP l-翼-l-isogln二肽（6ste（ll）-mdp）由S.Kusumoto博士提供（25）。
本研究中使用的合成MDP衍生物的示意图。 R.1 和 R2 MDP被替换如下：6DEC-MDP r1，癸酰渣; R.2， H; 4,6dec-mdp r1，R. 2，癸酰渣; 6STE-MDP r1，Stearoyl残留物; R.2， H; 4,6STE-MDP r1，R.2，硬脂酰渣。
人类未成熟DCS的制备（IDC）
通过甲基纤维素沉降和用Ficoll-hypaque（Amersham Biosciences）的甲基纤维素沉降和密度梯度离心来制备人PBMC。通过使用抗CD14涂覆的微珠（Miltenyi Biotec），用磁性电池分选系统与PBMC分离单核细胞。 IDC是由单核细胞产生的（5×105 细胞/ ml）通过在人GM-CSF（500 IU / mL）和人IL-4（100IU / mL）存在下补充有10％热灭活FCS的RPMI 1640（10mL）中培养6天。 。检查IDCS的制剂是否检查了表面标记CD14−, CD40+, CD83−, CD80低的, CD86低的和cd1a+ before use (13）。
DC成熟
IDC被培养（5×105 在RPMI 1640中含有24小时的细胞/ ml），其含有10％热灭活的FCS，具有GM-CSF（500 IU / mL）和人IL-4（100IU / mL）。然后用LPS（100ng / ml）温育24小时， S.金黄色葡萄球菌-PGN（staph-pgn;15μg/ ml），MDP或其衍生物（1-20μgMDPQ / ml）。通过用含有10mM EDTA的PBS轻轻移液，在4℃下收集细胞。通过测试表面标志物CD80来评估DC成熟 高的, CD86高的, CD83+和cd1a+ (13）。
TLR2，TLR4或MyD88缺乏小鼠巨噬细胞的制备
MyD88缺陷（26）和TLR2 / TLR4缺陷小鼠（27）如前所述产生。如前所述制备小鼠巨噬细胞。简而言之，小鼠（f2 从129 / ola×c57bl / 6中粘连的是i.p.注入2ml 4％的巯基乙醇酸酯培养基（DIFCO）。 72小时后，通过用冰冷的HBSS洗涤，从腹膜腔中分离出腹膜侵入性细胞。粘附的单层细胞被用作腹膜巨噬细胞（26）。
细胞表面AGS的流式细胞术分析
将细胞悬浮在含有0.1％叠氮化钠和0.1％BSA的PBS中，并在4℃下用5μgmAb孵育30分钟。用FITC缀合的山羊抗小鼠IgG F（AB'）洗涤细胞并用晶体染色2 在4°C下30分钟。然后通过流式细胞术（FacScalibur; BD Biosciences）测定荧光强度和平均荧光偏移（13）。
埃莉莎
人类的IDC（5×105 cells/well) were plated in duplicate in 96-well, flat-bottom plates in the presence or the absence of anti-TLR2 mAb (10 μg / ml），抗TLR4 mAb（10μg/ml), or E5531 (10 μM) (7）。在37℃下用多粘菌素B处理的Staph-PGN，多粘菌素B-无LPS（100ng / mL），MDP或其衍生物（15μgMDP等式/ mL）刺激IDC。基于表面标志物的水平测定适当量的这些TLR激动剂，表明DC成熟程度。对于TLR抑制研究，在加入刺激之前，在4℃下将细胞与每个TLR抑制剂一起温育30分钟。如前所述，通过ELISA（Amersham Biosciences）测量培养上清液中的人细胞因子（TNF-α等）的水平（13）。
在小鼠实验中，腹膜巨噬细胞（2.5×105 细胞/ ml）由野生型（C57BL / 6）小鼠和TLR2-，TLR4，TLR2 / 4-或MyD88缺陷小鼠制备（如前所述）制备（ 26, 27）。将细胞在24孔的平底板上重复培养，具有多粘菌素B处理的Staph-PGN（15μg/ mL）或多粘蛋白B无LPS（100ng / ml），MDP及其衍生物（15μgMDP Eq / ml）在37°C时24小时（11, 13）。如前所述，通过ELISA（Amersham Biosciences）重复培养上清液中TNF-α的浓度（13, 28）。
MLR Assay.
对于MLR测定，IDC由人单核细胞产生（5×105 用GM-CSF和IL-4培养6天的细胞/ ml）（13），然后在单独的培养基中孵育24小时，或含有多粘酶B处理的Staph-PGN（15μg/ ml）或MDP及其衍生物（15μgMDP等式/ mL）的培养基。辐照IDC和刺激的DCS（3000 rad; 137CS源）并在100μl的RPMI 1640培养基中培养，含有10％热灭活的FCS的培养基，3天，1×105 同种异体PBMC在96孔，平底板上。通过Celltiter 96非致酰基活性细胞增殖测定试剂盒（Promega）测量培养基中PBMC增殖水平。
结果
MDP衍生物的结构
MDP的四个衍生物如图1所示⇑，如前所述合成具有不同长度的脂肪酸的其他衍生物（22, 23, 24, 25）。使用不同长度链的二酰化和单酰化MDP来测试它们的功能。以前报道了合成方法和这些衍生物的性质（22, 23, 24）。 6-O-octanoyl和 6-O-Searoyl MDPS（6DEC-MDP和6STE-MDP）主要用于以下实验。
MDP衍生物诱导的DC成熟
与先前的报告一致，MDP没有能够上调CD80，CD86或CD83对人单核细胞衍生的DCS（13）。在类似的剂量和条件下，6dec-mdp和较小程度，6ste-mdp上调CD83和DCS上的CD86（图2⇓）。 6DEC-MDP有效上调CD83和CD86。 20微克6dec-MDP的效力与15μg/ ml staph-pgn或0.1μg/ ml LPS相当，分别是TLR2和TLR4的代表性激动剂。这些MDP衍生物还通过这些MDP衍生物巧妙地诱导CD80，但与相同的重量比的LPS突出突出。 6DEC-MDP和6STE-MDP还诱导人类DCS中高水平的MHC I类和II类（图3⇓A）。没有用完整的MDP或二酰基化4,6dec-MDP和4,6Ste-MDP观察到这些功能。因此，合成MDP衍生物，6-O-Monoacyl MDP具有成熟DC的能力。
6dec-或6ste-mdp的直流成熟标记的上调。单核细胞衍生的IDC（5× 105 cells/ml) were stimulated with medium alone (none), Staph-PGN (15 μG / ml），LPS（100ng / ml），MDP，6dec-MDP，4,6dec-MDP，6STE-MDP或4,6天MDP（1–20 μg mdp eq / ml）。 24小时后，收获细胞，通过流式细胞术估计CD80，CD83和CD86的表达水平。显示了三种类似实验中的一种的数据。
用单酰基MDP诱导的人DC成熟。 A，通过单乙酰MDP对MHC I类和DCS中的MHC I类和II类的上调。用培养基，MDP或单酰基MDP（本图中6decmdp）刺激单核细胞衍生的IDCs 24小时。然后洗涤细胞，用同种型匹配的IgG或MAb对抗MHC-DR，β处理2-microglobulin或CD83，然后用FITC标记的第二AB处理并通过流式细胞术分析。通过IgG控制的基础偏移显示为 剩下 （重叠两条细线）。荧光强度显示为 正确的。灰线表示没有刺激的IDC;厚的实线表示单乙酰MDP刺激后的IDC。 MDP不允许上调这些分子（未显示）。显示来自两个捐赠者的样品。 B, Allogeneic MLR using DCs treated with 6Dec-MDP or 6Ste-MDP. The iDCs were cultured for 24 h in medium alone or medium containing Staph-PGN (15 μG / ml）和MDP，6dec-MDP或6STE-MDP（15μg mdp eq / ml）。在24小时后，通过同种异体PBMC照射并培养这些DC，并使用细胞增殖测定试剂盒测量PBMC增殖。显示了三种类似实验中的一种的数据。
接下来，测试了MDP衍生物的DCS的MLR诱导的功能。虽然MDP无法激活DCS，但与以前的报告一致（30），6dec-MDP和6STE-MDP施加有效的直流介导的MLR诱导。始终如一地，淋巴细胞增殖程度类似于Staph-PGN诱导的淋巴细胞增殖程度（图3⇑B）。因此，MDP衍生物似乎通过增强MLR和MHC和共刺激器的表达来赋予单核细胞衍生的DC的成熟。
用MDP衍生物刺激DCS中细胞因子的生产
用各种成熟诱导剂刺激的DCS诱导特异性刺激物的炎症和有效细胞因子。通过ELISA检查用MDP衍生物刺激的DCS中产生的细胞因子的曲线。结果表明TNF-α（>可以在通过单酰基6天或6dec-MDP成熟的DCS上清液中检测600pg / ml）（图4⇓A）。然而，由6天或6dec-MDP诱导的TNF-α的水平比Staph-PGN或LPS诱导的那些小于10倍。其他细胞因子，例如IL-1β，IL-6和IL12P40也是通过DCS产生的，响应于6STE-MDP（未示出）或6dec-MDP;它们的表达概况与BCG-CWS类似（表II⇓），但产生的量小于BCG-CWS刺激的DC。 IL-12P40和TNF-α生产在DCS中以剂量依赖的方式增加（图4⇓B）。虽然细胞因子水平未达到由测试的剂量的BCG-CWS诱导的水平，但是配体密度将是单酰基MDP介导的DCS中细胞因子诱导的重要因素。 MDP衍生物一起诱导DC中的细胞因子作为BCG-CW。 BCG-CWS和MDP衍生物均未诱导IFN诱导蛋白10（IP10），其通过LPS在DC中产生（表II⇓ 和 Fig. 4⇓C）;单酰基MDP以TLR4信号传导的激活方式不同于LPS。
用MDP衍生物治疗人体DC中细胞因子的诱导。 A, The iDC were cultured for 24 h in medium alone, medium containing Staph-PGN, or either MDP or MDP derivatives. After 24 h, the levels of TNF-α在培养上清液中通过ELISA测量。刺激器的数量是：Staph-PGN，15μg/ml (左侧面板 ）;和MDP，6DEC-MDP，4,6DEC-MDP，6STE-MDP和4,6Ste-MDP，15μgMDPeq / ml（右侧面板）。没有检测到的nd。 B, Production of TNF-α通过IDC响应MDP衍生物的IL-12P40。用表明浓度的MDP，6DEC-MDP和6STE-MDP刺激IDC。 TNF-α levels in the supernatants were measured by ELISA. One of the three independent experiments is shown. C, Cytokine profiling induced in ligand-stimulated DCs. The iDCs were cultured for 6 h in medium alone or in medium containing Staph-PGN, BCG-CWS, LPS, or the indicated MDP derivatives. Then the levels of cytokine messages in DCs were assessed by RT-PCR using specific primers. DCs were prepared from three donors. GAPDH and β-Actin用作对照。
直到10小时，用6dec-mdp vs lps刺激的dcs的细胞因子产生没有明显不同（<2倍），除IL-6外（表II⇑），建议缺乏晚期诱导的事件，如内化（13）和/或激活Iκ-Bζ（31）在单酰基MDP中引起较小的细胞因子产生。即使在晚期的后期，IFN-β-和IFN型诱导基因（IP10表示）均仅由MDP衍生物或BCG-CWS（数据未显示）。虽然DCS每种细胞因子的生产水平的供体往助剂差异很大（表II ⇑），通过单酰基MDP在DCS中诱导的总细胞因子谱在供体中类似。通过添加多粘菌素B（未示出），不阻止这些细胞因子的MDP介导的诱导，这排除了污染LPS在细胞因子诱导中的可能性。 MDP和其衍生物都不是具有二酰化的衍生物几乎促进了任何TNF-α的生产。
RT-PCR.检查其他细胞因子的mRNA水平（图4⇑C）。结果表明，TNF-α，IL-12 P40，IL-23 P19，IL-6和IL-1β，但不是IL-12 P35，IFN-β或IP10，在DCS刺激6dec-或6ste-mdp（图4 ⇑C）。结果与6dec-mdp和bcg-pgn（未示出）类似。同样，Staph-PGN诱导这些细胞因子消息，但未诱导DC中的IL-12P35，IFN-β和IP10。 LPS是TLR4的激动剂，并诱导IL-12P35和IP10。再次不同于LPS，6STE或6DEC-MDP几乎没有引起IP10或IL-12P35，尽管它们是TLR4配体。单酰基MDP的这些性质与BCG-PGN或BCG-CWS共享，表明这些BCG化合物通常通过MYD88激活TLR2 / 4，但不能激活Toll-IL-1R同源域（TIR）概述衔接子分子-1（TICAM-1）/含有TIR域的适配器诱导IFN-β（TRIF） - 依赖性途径（29, 32）。
基于形态变化和激活曲线（CD45RA VS RO），这些化合物中的任何一个都不引起通过直接相互作用（数据未显示的数据）激活任何淋巴细胞群。此外，响应于这些化合物（数据未显示），未在淋巴细胞上诱导IL-18R或IL-12R复合物。这表明DC成熟是这些合成试剂具体诱导的事件。
MDP衍生物介导的直流成熟是TLR2 / 4和依赖于MYD88
使用TNF-α作为标记，我们检查了单酰化MDP是否通过TLRS激活DCS。虽然其他TLR阻断的MAB几乎没有抑制人DCS中的TNF-α产生，但对TLR2或TLR4抑制剂E5531的功能阻断mAb部分（〜50％）抑制TNF-α生产（图5⇓A）。同样，针对TLR4的功能阻断MAb部分抑制了类似于E5531的TNF-α产生（图5⇓B）。用于TLR2 / 4功能阻塞的抗TLR2 mAb和E5531的组合使用导致TNF-α解放的抑制~80％（图5中所示的一些数据）⇓C）。使用TLR2激动剂（Staph-PGN）和TLR4激动剂（LPS）的对照研究表明它们抑制了TNF-α诱导的活性>75 and >分别为95％。因此，我们得出结论，单酰化的MDP与DC表面上的TLR2和TLR4相互作用，导致MAb封闭功能。
生产TNF-α by 6Dec-MDP or 6Ste-MDP in DCs is TLR2 and TLR4 dependent. A, The iDCs were precultured with medium as control (Cont), isotype-matched control IgG (10 μg / ml），抗TLR2 mAb（10μg/ml), or E5531 (10 μM) for 30 min at 4°然后用staph-pgn刺激细胞（15μg / ml），LPS（100 ng / ml），MDP（15μG MDP eq / ml），6dec-mdp（15μg mdp eq / ml），或6ste-mdp（15μg mdp eq / ml）。刺激后二十四小时，TNF-α production was measured by ELISA. ND, not detected. Results from one of two similar experiments are shown. B, The iDCs were pretreated with medium only (None), anti-TLR4 mAb (10 μg hta125），或e5531（10μM) for 40 min at 4°然后用指定的TLR激动剂（上述量）刺激细胞。刺激后二十四小时，TNF-α production was measured by ELISA. ND, not detected. C, The iDCs were pretreated with medium only (None), isotype-matched control IgG (10 μg / ml），抗TLR2 mAb（10μg / ml），抗TLR4 mAb（10μg / ml），或抗TLR2 /抗TLR4 mAbs（10μ每次g / ml）40分钟4°然后刺激细胞24小时，15μg MDP eq/ml 6Ste(LL)-MDP (see the 剩下 方案）。如下所示显示TNF-α水平 B。显示了一个代表性结果。 D，过表达TLR2 Plus TLR1，TLR2 Plus TLR6和TLR4 Plus CD14不响应单酰化的MDP。用明确的质粒组合转染HEK293细胞（见 最佳 每个面板）。二十四小时后，用指示的TLR刺激器刺激细胞（见 右上列面板）。 Twenty-four hours after stimulation, NF-κB荧光素酶测定用这些转染剂进行。使用MALP-2（TLR2加TLR6的配体，PAM3（TLR2加TLR1的配体）和LPS（TLR4的配体）作为阳性对照。虽然未显示数据，但在293个细胞上同时表达TLR2和TLR4 / CD14几乎没有回应6STE-MDP（15μg of MDP eq/ml). MDP was used as a negative control. Of note, TLR4 alone barely responded to LPS as in previous reports (21 ）。相对激活值显示在 y-轴。
NOD2被鉴定为MDP的二肽部分的细胞质传感器（l-翼-d-isogln）（11）。为了测试单乙酰MDPS是否激活NOD2信号传导，我们合成模拟配体至NOD2，6STE-MDP l-翼-l-isogln二肽（6ste（ll）-mdp）。我们确定其诱导TNF-α的能力和TLR2 / 4阻断mAb的抑制程度（图5⇑C）。 d-isogln含和 l-Sogln的6Ste-MDP在DCS中诱导几乎相同的TNF-α水平。 TLR2和TLR4阻滞剂在6STE（LL）-MDP依赖性TNF-α诱导上赋予相似的抑制性曲线。因此，如果有的话，NOD2略微影响我们使用单酰基MDP的系统中的DC成熟。
我们测试TLR2是否与TLR1，TLR6或TLR4结合CD14可以识别单酰化MDP（图5⇑D）。在过表达研究中，任何这些组合未能在HEK293细胞中以单独的单酰化MDP在HEK293细胞中激活NF-κB启动子以上（图5⇑D）。因此，在HEK293细胞上与TLR2的其他TLR的偶联不仅仅在DCS中反射单酰化的MDP识别。 TLR4仅在MD-2和CD14的存在下识别LPS，在这些条件下，TLR4复合物几乎识别单酰化MDP（图5⇑D）。同时表达TLR2和TLR4再次未能响应HEK293细胞中的MDP衍生物（数据未显示）。因此，MDP衍生物未能激活相关的TLR表达的HEK293细胞中的记者，这与我们的期望相反。当我们使用BCG-CWS和PGN作为TLR刺激器时，这些结果与之前的意外结果一致（7, 13）。可能，在DCS中表达的未识别分子，但不是HEK293细胞，在BCG组成介导的NF-κB活化中起重要作用。实际上，对于PGN（例如肽聚糖识别蛋白（PGRP）或Intelectin）的捕获受体是PGN的内化和随后的一些细胞系统中的NF-κB活化必需的（2, 33）。我们推动了NF-κB的单酰基MDP介导的活化中是真实的。
最后，使用由基因破坏小鼠制备的TLR2-，TLR4和MyD88缺乏巨噬细胞来确认通过MyD88依赖性途径的TLR2 / TLR4受体使用和信号选择（图6⇓）。结果表明，6dec-or 6ds-mdp允许在野生型小鼠巨噬细胞中产生TNF-α，但不是MyD88 - / - macrophages (Fig. 6⇓A）。 Staph-PGN介导的TNF-α生产也在MyD88中完全终止 - / - DCs (Fig. 6⇓A）但LPS介导的TNF-α生产仍然是MYD88 - / - 巨噬细胞到最小程度。 6dec-mdp-和6shemdp介导的tnf-α-在缺乏tlr2或tlr4的小鼠巨噬细胞中部分受损部分（图6⇓B）。在缺乏TLR2和TLR4的小鼠巨噬细胞中，超过95％的单酰基MDP依赖性TNF-α产生（图6⇓B）。因此，单酰化的MDP通过MyD88依赖性途径将小鼠巨噬细胞与TLR2和TLR4一起激活。再次观察到与BCG-CW相比，对小鼠巨噬细胞的低诱导小鼠巨噬细胞的TNF-α。如果培养间隔超过6小时（数据未显示），这种趋势突出。
TNF- α induced by 6Dec-MDP or 6Ste-MDP in mouse macrophages. A，如前所述制备小鼠腹膜巨噬细胞（26 ,27 ）。腹膜巨噬细胞（2.5×105 将来自野生型和MyD88缺陷小鼠的细胞/ ml用培养基（无）或含有staph-pgn（15μg/ ml）或LPS（100ng / ml; 左侧面板 ）。培养相同许多巨噬细胞24小时，具有15μgMDPeq / ml MDP，6dec-MDP或6STE-MDP（右侧面板）。通过ELISA测量培养上清液中的小鼠TNF-α水平。显示了三种类似的实验中的一种。没有检测到的nd。 B，小鼠巨噬细胞（2.5×105 来自野生型和TLR2，TLR4-或TLR2 / 4双缺乏小鼠的细胞/ ml）培养24小时（无），staph-pgn（15μg/ ml）或LPS（100ng / ml; 左侧面板 ）。与15μgMDPeq / ml MDP，6dec-MDP或6STE-MDP相同培养相同的巨噬细胞24小时培养24小时（右侧面板）。如图所示，显示了TNF-α水平 A.
讨论
在这项研究中，我们合成了MDP衍生物 6-O 酰化，如4-N - 乙酰杂胺 - l - alanyl-d-isoglutaminyl-6-O-----10），并证明单酰化MDP衍生物6Ste-and 6dec-MDP活化与BCG-PGN佐剂类似的单核细胞衍生的DC。 MDP衍生物的TLR2和TLR4的激动活性对DC成熟负责。甚至在高剂量下，没有改性和二酰基化MDP衍生物的MDP也没有表现出直流成熟的活性。单酰化MDP的NOD2未宣传突变体仍然保留了DC成熟活性。因此，BCG-CWS的MyD88依赖性辅助活性的最小结构要求（13）和bcg-pgn（7）反映在MDP中，单一延伸6-O - 化。 DCS中的这种独特的TLR激活曲线可能是CFA的体内助剂的效率的基础 结核分枝杆菌 (14）。
与BCG-CWS相比，用单酰化MDP刺激的DCS中细胞因子产生的效力相对较低。在早期点，两种刺激器之间的细胞因子水平的差异不是很明显。可能，单酰基MDP是与BCG-CWS相比的短作用刺激器，其可以通过MDP衍生物解释100倍的TNF-α诱导而不是通过BCG-CWS。突出的结构差异是MDP是单体，而BCG-CWS由具有糖链网络的多聚体MDP组成（17）。额外的结构部分维持MDP的多元化对于BCG-CWS诱导的鲁棒免疫应答至关重要。
意外地，在HEK293表达系统中未复制单酰基MDP的TLR2 / TLR4使用。在先前的研究中，BCG-CWS和BCG-PGN未能激活类似的过表达系统中的TLR2 / TLR4。我们的解释是，有效的NF-κB活化需要，在DCS，但不是293个细胞中存在的BCG-PGN的额外捕获受体是必需的（13）。然而，转染质粒表达PGRPS（肽聚糖识别蛋白）（34），DC标志（35）或dectin-1（36）没有导致恢复293个细胞中单酰基MDP的功能（数据未显示）。识别单酰化MDP所需的分子碱需要进一步研究。
根据先前的报道，TLR2更有效地响应与TLR6或TRRR1或TRRR1（PAM3）的二酰脂肽（MALP-2）（37, 38, 39, 40）。 TLR5可以与TLR4结合识别鞭毛，以诱导I IFN（41）。必须进一步阐明最大化对单酰基MDP的反应的受体络合物。 TLR2和TLR4似乎单独地参与MDP衍生物的识别，因为封堵了一个仅部分抑制了TNF-α的生产。 TLR10与TLR2结合不是诱导对MDP衍生物有效响应的候选者（J.Fehori和T.Seya，未发表的观察）。总之，HEK293细胞上的TLR2和/或TLR4 / MD-2 / CD14的简单过表达未导致MDP衍生物介导的NF-κB活化。
最近的报道表明，细胞质中的NOD2用作细胞内受体 l-翼-d-ISogln肽MDP和NOD1的PGN二氨基菊酯部分（3, 10, 11, 42, 43）。 BCG-CWS的MDP具有这些结构签名。然而，我们赞成解释NOD2活化没有用单酰化的MDP产生。首先，阻断TLR2和TLR4的试剂抑制单酰基MDP介导的TNF-α产生。其次，通过单乙酰MDP产生的TNF-α是依赖于MYD88的，支持TLR-MYD88途径在单酰基MDP依赖性DC成熟中的参与。第三，6dec-and 6ste-mdps诱导的细胞因子谱与Bcg-cws和bcg-pgn的细胞因子分布几乎相同。 Intact MDP由Nod2识别（ 11），但不是TLR2或CO表达TLR2和TLR1或TLR2和TLR6。最后，NOD2-未兴奋突变体6STE（LL）-MDP表现出足够的TNF-α诱导活性。 MDP-NOD2介导的NF-κB活化从酰基MDP诱导的TLR2 / 4-衍生的响应中不同。
硬脂酰基赖氨酸MDP衍生物用作佐剂，其表现出生物活性，例如对动物的各种细菌，真菌和病毒感染的保护（44, 45）。它似乎是一种用于针对微生物剂的疫苗接种的有用的免疫谐腾。此外，硬脂酰基赖氨酸MDP衍生物通过在小鼠中引出肿瘤免疫来抑制肿瘤转移。它还诱导IL-1β，IL-6，TNF-α和GM-CSF（45）。硬脂酰基赖氨酸MDP的这些功能性曲线使BCG-CWS的免疫谐腾性能提出（46）。然而，BCG-CWS和硬脂酰基赖氨酸MDP衍生物不太可能在DCS中共享活化途径，因为硬脂酰基赖氨酸MDP不会激活任何TLR（45）或适配器（44）。因此，我们证明了合成的单酰化MDP在功能上与硬脂酰基赖氨酸MDP不同。
kusumoto.等。 （22, 23, 24）自20世纪70年代以来研究了合成MDP衍生物的功能性谱。这些化合物作为佐剂活性剂，用于引发豚鼠和小鼠中的细胞介导的免疫应答，但在ABS的产生方面不太活跃，而不是BCG-CWS（10）。特别是，这些化合物几乎没有呕吐的大多数植入肿瘤的能力很少30, 47, 48）。然而，当关于佐剂和TLR的靶细胞知识没有得到很好的了解，对这些早期的研究进行了。我们的研究是首先使用以外的实验和人单核细胞衍生的DC中的TLR功能阻断系统表征这些MDP衍生物的佐剂活性作为单酰基MDP的靶标。该合成化合物诱导DC成熟，增强细胞因子产生和共刺激剂表达。因此，维持BCG-CWS助剂的活性中心可以包含修改的MDP。
单酰基化的MDP触发了与人单核细胞衍生的巨噬细胞中BCG-CWS类似的基因诱导程序; 185个基因是BCG特异性（K.Ishii和T.Seya，未发表的观察）。单酰化MDP的基因调节曲线类似于BCG-CWS（49）。在任一情况下没有发现IFN诱导基因的释放（未显示数据），表明无涉及TRIF / TICAM-1途径（29, 31）。因为BCG-CW已用于癌症免疫疗法（46, 50），具有高直流成熟潜力的合成MDP衍生物可以作为良好的候选者和临床有用的佐剂，可清除良好的制造实践标准，并以低成本承诺高质量的生命。不幸的是，在先前的报道中，单酰基MDP不能在肿瘤植入小鼠模型中发挥足够的助剂（30, 48）。我们现在有了解BCG-CWS及其化合物功能如何在免疫系统中出院肿瘤（51）。设计具有高辅助活动的新衍生物将极大地帮助促进癌症免疫疗法的癌症。
致谢
我们很感激博士。 K. Miyake（东京大学，东京，日本）和R.Dziarski（印第安纳大学，加里，进）分别用于针对人TLR4和PGRP cDNA质粒提供功能阻断MAB。我们感谢Drs。 H.Ishii，M. Tanabe，Na Begum，以及Nooue（大阪医疗中心，日本大阪，日本）为宝贵的讨论，以及V.Kumar博士（圣路易斯大学，圣路易斯，MO）为批评阅读手稿。
披露
作者没有财务利益冲突。
脚注
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本文的出版费用部分按付款方式部分支付。因此，本文必须明白 广告 按照18 U.S.C.第1734节仅表明这一事实。
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↵1 这项工作是由工程，科学和技术的核心研究支持的部分支持;日本技术学会;来自教育部，科学和文化部的补助金（指定的高级研究项目）;日本卫生和福利部; Naito Memorial Foundation（至下午）;和高松公主癌症基础。
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↵2 目前的地址：日本大阪618-8503，Shimamoto-Cho，Shimamoto-Cho，Shimamoto-Cho，Shimamoto-cho，Shimamoto-cho，Shimamato-Cho Suntory Sourceitute。
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↵3 地址通信和转载对Tsukasa Seya博士，微生物学和免疫学，医学研究生院，Kita-15，Nishi-7，Kita-Ku，札幌060-8638，札幌060-8638。电子邮件地址： seya-tu {at} med.hokudai.ac.jp
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↵4 本文中使用的缩写：NOD，核苷酸结合寡聚域; BCG，Bacillus Calmette-Guérin; CWS，细胞壁骨架; DC，树突细胞; IDC，未成熟的DC; IP10，IFN诱导蛋白10; MDP，Muramyl二肽; PGN，肽聚糖; PGRP，肽聚糖识别蛋白; Staph-PGN， 金黄色葡萄球菌-pgn; TIR，Toll / IL-1R血液结构域。
- 已收到 2004年10月28日。
- 公认 2005年3月17日。
- 版权© 2005 by The 美国免疫学家协会
