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TEC Kinase独立于其Pleckstrin同源域迁移到T Cell-APC接口

FABIENGARÇON., 乔治博物馆, 丹尼尔·伊纳德州, 丹尼尔橄榄 和 雅克A.Nunès.
J免疫素 2004年7月15日, 173 (2) 770-775; DOI: //doi.org/10.4049/jimmunol.173.2.770
FABIENGARÇON.
*Institut National De LaSantéetdeLoghercheMédicaleOnetéMileStuteCerneFrche599,Institut du Cancer De Marseille,Equipe La Ligue Nationale Contre Le Cancer,InstitutfédératifdeChercherche137,FédératifdeCercenélance,Marseille,Marseille,Marseille,Marseille;
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乔治博物馆
†DeépartementdeBiologieCellulaire,Institut Cochin,Institut National de LaSantéetdeLoghercheMédicale·梅内斯537,Center National De La Recherche ScientifiqueOcséMiletedeCherche7627,Farensitédenscartes,法国巴黎,法国巴黎;和
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丹尼尔·伊纳德州
‡Atelier de Bio-imagerie,Institut Paoli-Calmettes,法国马赛
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丹尼尔橄榄
*Institut National De LaSantéetdeLoghercheMédicaleOnetéMileStuteCerneFrche599,Institut du Cancer De Marseille,Equipe La Ligue Nationale Contre Le Cancer,InstitutfédératifdeChercherche137,FédératifdeCercenélance,Marseille,Marseille,Marseille,Marseille;
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雅克A.Nunès.
*Institut National De LaSantéetdeLoghercheMédicaleOnetéMileStuteCerneFrche599,Institut du Cancer De Marseille,Equipe La Ligue Nationale Contre Le Cancer,InstitutfédératifdeChercherche137,FédératifdeCercenélance,Marseille,Marseille,Marseille,Marseille;
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抽象的

TEC是TEC酪氨酸激酶系列的原型成员,在T细胞信号中起着重要作用。我们在本研究中展示了当T细胞接触树突细胞时,TEC转向免疫突触。令人惊讶的是,这种积累的Pleckstrin同源性(pH)域的存在不需要,并且尽管在Synapse的形成期间,尽管3'-磷酸化的磷酸膦酸碱基脂质合成的强烈活化,但TEC pH结构域不会被重新分布到T细胞质膜。相反,我们证明了绝对需要活跃的SRC同源3结构域,强调该部分分子在免疫学突触的募集和/或稳定中的本部分发挥的基本作用。尽管如此,我们的结果表明pH结构域控制体内分子的激酶活性。我们终于证明了两个域是触发AG演示后的转录事件所必需的。这些数据支持一种模型,其中含pH的蛋白质TEC的血浆膜募集不依赖于PI3K的3'-磷酸化的磷酸膦脂质的生产,而是对完整的SRC同源3结构域。

有效的T细胞活化需要T细胞和APC之间的适当相互作用。在Ag识别时,在T Cell-APC界面中发生涉及T细胞刺激的分子的复杂隔间化,称为免疫学突触(是)3 (1, 2)。此外,该分区化伴随着并取决于快速的细胞骨架极化(3, 4)。总的来说,这些事件导致朝向靶细胞的细胞因子的T细胞的极化分泌(5 )。

许多分子参与了突触形成。例如,甚至在形成成熟突触之前发生的T细胞信号传导的早期事件,例如蛋白酪氨酸激酶(PTKS)的激活(6)。在PTK中,SRC激酶家庭成员在in是(7, 8 )。

另一个PTK系列,TEC激酶在结构上与SRC激酶相似,但它们由含有Pleckstrin同源性(pH)结构域的独特氨基末端区域,其次是TEC同源域。这个家庭由五名成员组成:TEC,BTK,ITK / EMT,RLK / TXK和BMX / ETK(9)。在功能方面,TEC激酶在通过Ag受体和淋巴细胞发育,分化和细胞凋亡期间发挥着重要作用。10)。然而,尽管有许多关于其调节的数据,但尚未研究免疫突触中的TEC激酶。

TEC激酶的pH结构域识别磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸(PI-3,4,5-P.3 )( 11, 12, 13)。该pH结构域涉及血浆膜的TEC激酶的易位(14)。在T细胞-APC缀合物形成期间,PI-3,4,5-P3 在接触区域的T细胞中累积(15, 16)。除了磷酸化事件和膜募集外,这些激酶是通过蛋白质结合结构域的和分子间相互作用强烈调节:SRC同源2(SH2)和3(SH3)结构域(10)。 TEC激酶的三个成员在T细胞中表达:TEC,ITK / EMT和RLK / TXK,但只有TEC和ITK含有pH域。该pH结构域与TCR / CD3复合物涉及TCR / CD3复合物与ABS交联(17, 18)。在这些TEC激酶中,TEC特别活跃以诱导细胞因子基因表达(19)。因此,TEC可以是分析T细胞中TEC激酶的易位和功能的有用模型。

在该研究中,我们在人静息T细胞中使用瞬时转染,证明TEC可以在T细胞和树突细胞(DC)之间形成。此外,我们表明该TEC积累以pH独立的方式发生,而其SH3结构域是必要的。在使用伯T细胞或Jurkat细胞的不同类型的T细胞-APC触点中,TEC以pH独立的方式位于血浆膜。然而,pH结构域的存在对于TEC激酶来诱导功能事件仍然很重要。

最后,这些数据在突触形成的早期事件中致力于TEC,并强调这些事件中pH和SH3域的作用。

材料和方法

质粒构建体

以前描述了表达质粒pcdna3-flag-tec(19)。通过PCDNA3-FLAG-TEC的PCDNA3-FLAG-TEC的PCR扩增使用以下引物,含有缺乏pH结构域的鼠TEC cDNA的表达质粒pCDNA3-Δphtec标志:感觉底漆,5'-ATAAGGGATCCAATATATCATGATAAATAC3' ;反义底漆,5'-ActTaactcGagTcatttgtcatcatcgtccttatagtctcttcaaaagtttcttcaca-3'(包含标志表位)。质粒pCDNA3-TECSH3 *编码TEC蛋白,包括在SH3结构域的残基215和216处的TRP的Leu取代(TEC W215 / 216L或TEC SH3 *)。先前对BTK描述了这些突变(20)。通过重叠延伸PCR引入点突变。所有PCR产物均在1%琼脂糖凝胶中分离,分离出并用核缺点XTRACT套件(Macherey-Nagel,Hoerdt,法国)纯化。

GFP融合蛋白表达载体,Δphtec-gfp和tecsh3 * -gfp是通过从pcdna3-Δphtec-flag和pcdna3-flag-tecsh3 *的终止密码子移除,并将标记与标志表位的CDNA引入 XHO. 一世/ BAM PEGFP-N3向量(BD Clontech,Palo Alto,CA)的嗨网站。

TEC的标志标记的pH结构域(AA 1-151)从PCDNA3-FLAG-TEC中扩增了以下引物:感觉底漆,5'-caAgctcgagcGGAGATGACTAC-3';反义底漆,5'-ctggctggatccactctcaaaaAg-3'。 PCR产物亚克隆到 XHO. 一世/ BAM PEGFP-N3表达载体的嗨网站。 Phakt-GFP由T. Meyer(斯坦福大学医学院,斯坦福,加利福尼亚州)提供,并用于以前的研究(16)。 TEC-GFP在实验室中由W.-C.杨。磷脂酶C-γ1(PLC-γ1)进入PRK5表达载体是B. Margolis(密歇根大学医疗中心,Ann Arbor,MI)的善意。将质粒转染到COS-7细胞中并通过SDS-PAGE分析,然后通过免疫印迹,用于使用MAb对GFP的GFP融合构建体的存在。通过DNA测序验证所有构建体。

由IL-2启动子组成的启动子测定质粒pIL-2-LUC,与萤火虫荧光素酶报告基因融合,与β-肌动蛋白启动子组成的Pβ-actin-Rluc,融合 Renilla. 先前报道了荧光素酶基因(19 )。

细胞培养和转染

如前所述分离和制备人PBL-T和DCS(16)。根据制造商的说明,用Amaxa Nucleofector技术(Köln,德国)转染人的原发性T细胞,并在转染后使用18小时(www.amaxa.com)。对于大多数GFP构建体,静止PBL-T的转染百分比达到40-50%。 COS-7细胞维持在补充有10%FC的DMEM培养基中,2毫米 l - 谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠。 Jurkat JA16 T细胞亚克隆(21)raji b细胞淋巴瘤在补充10%fcs的RPMI 1640培养基中生长,2毫米 l - 谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠。如前所述,Jurkat T细胞被电穿孔(19),转染后18小时使用。

试剂和ABS

Superigenen(SAG)混合物(葡萄球菌肠毒素A,B,C3和E(参见))购自毒素技术(Sarasota,FL)。 3-氨基丙基三乙氧基硅烷,聚(l-LYSINE)和PMA购自Sigma-Aldrich(圣路易斯,MO)。荧光安装媒体萤石购自Calbiochem(VWR International SAS,Fontenay-Sous-Bois,France)。先前描述了抗TEC兔多克隆抗血清(19)。抗标志MAb(M2)购自Sigma-Aldrich。从细胞信号技术(Beverly,MA)购买抗磷酸-Y783-PLC-γ1和抗PLC-γ1多克隆ABS。如前所述进行细胞裂解物,免疫沉淀和免疫印迹(19 )。

荧光分析

对于T细胞-DC缀合物分析,将DC在涂有2μg/ ml聚(1μg)的玻璃盖玻片上(l - 含硅)并安装在培养皿上,并在37℃下用10ng / ml SAg混合物温育20分钟。然后将转染的T细胞加入到DC中并孵育20分钟。然后将缀合物固定在PBS中加4%多聚甲醛,并在分析之前在4℃下储存在PBS中。在倒置显微镜(尼康,Melville,NY)上分析T细胞-DC缀合物,配备差动干扰对比(DIC)。 Jurkat T细胞可以用1μg/ ml脉冲的Raji B细胞形成缀合物,参见15分钟( 22)。将转染的Jurkat细胞以2:1的比例混合,用跷跷板APC混合,然后在37℃下温育20分钟。刺激后,将细胞置于聚 - l - 含碱涂覆的盖玻片,让沉积物3分钟,然后以300rpm离心1分钟。最后,将这些细胞在室温下固定在30分钟,在PBS中具有3.7%多聚甲醛。将载玻片安装有荧光安装介质。使用共聚焦显微镜进行图像(Leica TCS NT Confocal显微镜; Leica Microsystems,Heidelberg,德国)。

荧光素酶测定

Jurkat细胞(10×106)使用具有10μg的Pl-2-Luc质粒,5μgPβ-肌动蛋白-RLUC和10μg的其他表达质粒,在960μF和250V下电穿孔。用Raji细胞(比率1:1)对APC进行刺激,在37℃下脉冲20分钟,在10ng / ml下看。在细胞裂解后,蛋白质通过Bradford试剂(Bio-rad)定量,然后根据制造商的说明(Promega France Sarl,Charbonnières,法国)进行30μl细胞裂解物。通过标准化的萤火虫荧光素酶的活性校正了结果 Renilla. 荧光素酶和裂解物中蛋白质的定量。

结果

Synapse地层以pH独立的方式诱导接触区的TEC招聘

尚未研究在组建期间的TEC家族激酶募集。使用融合给GFP(TEC-GFP)的野生型TEC分子,首先将其分析在T细胞/ APC缀合物中。 TEC-GFP在人外周血休息T细胞中表达,并且如前所述,将这些细胞与脉冲混合物脉冲脉冲的成熟DCS一起温育(16)。 TEC-GFP在未刺激的T细胞中具有漫射分布(图1⇓A, 上部面板)。在细胞核和细胞质中显着表达分子。在接触DCS的T细胞中,该分布显着修饰。在37℃下20分钟后,百分比细胞(78%)(78%) n = 120),募集大多数TEC-GFP分子在T细胞和DC之间形成(图1⇓A, 下面的面板 )。

图1。
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FIGURE 1.

Synapse地层以pH独立的方式诱导TEC对T Cell-APC接触面积的重新定位。 A 和 B,荧光图像显示TEC-GFP的分布(A)和Δphtec-gfp(B)在分离的人外周血t细胞中(上部面板)与脉冲混合物脉冲的DCs接触T细胞(下面的面板)。这 右手面板 是DIC面板。数据代表三次独立的实验。

之前的Jurkat T细胞的研究表明pH结构域是在通过AB交联的TCR触发时募集TEC激酶家族成员,例如ITK或TEC到血浆膜(17, 18)。因此,我们使用PH删除的TEC(ΔPHTEC-GFP)形式来研究其在IS的观察到的TEC积累中的贡献。在未刺激的细胞中,Δphtec-gfp具有漫射分布,例如TEC-GFP(图1⇑B, 上部面板)。在大多数接触DCS的大多数T细胞中仍然观察到该探针的强烈积累(图1⇑B, 下面的面板)(74%, n = 150)。 TEC-GFP和ΔPHTEC-GFP都显示出相同的积累模式,在整个接触区中具有相对均匀的分布。

这些数据显示在AG识别期间在T Cell-DC接口上有效地调动TEC。它们还表明,TEC的pH结构域是该过程的可分配的。

TEC的pH结构域不会易于免疫突触

已显示TEC pH结构域对PI-3,4,5-P具有亲和力3 在PI3K激活后在血浆膜中产生(18)。但是,我们的数据(图1⇑)表明,在T细胞和DC之间的接触区内没有必要招募TEC。因此,我们直接分析其对接触DCS的T细胞的血浆膜的募集,使用含有熔融的TEC域的分子与GFP融合。作为对照,我们在并行使用AKT / PKB的pH结构域也融合到GFP(Aktph-GFP)。该探针已被证明在由于PI-3,4,5-P由于PI-3,4,5-P而易于T细胞的血浆膜易转移到T细胞的血浆膜3 T细胞活化诱导的增加(15, 16)。两个pH结构域显示出与细胞质和未刺激的T细胞的细胞质相同的弥漫分布(图2⇓, 上面面板)。如前所述(16),在接触Ag脉冲DC的T细胞的血浆膜上积累的Aktph-GFP的最大部分(图2⇓A, 下面的面板)。相比之下,Tecph-GFP仍然是核和细胞质(图2⇓B, 下面的面板)。连同图1所示的结果⇑,这些数据强烈建议,TEC的另一个相互作用域不同于pH域,对于TEC的易位是重要的。

图2。
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FIGURE 2.

人T细胞DC缀合物中TEC pH结构域的分布。 A,与脉冲混合物(0.1μg/ ml)脉冲相互作用的T细胞中PHAKT-GFP的图像。 B,Tecph-GFP在T细胞中的分布形成与DCS的突触。结果来自两个复制实验之一。这 右手面板 是DIC面板。代表性缀合物显示出每实验分析至少70分析。

TEC的SH3领域是在免疫突触招募TEC的必要条件

SH3结构域在血浆膜上靶向信号分子的作用已被重复强调(23),包括TEC激酶家族成员,其中SH3结构域应该在IS(以下)表达的信号体复合物中染成各种蛋白质(10)。这就是为什么要调查其在TEC的募集中的作用的原因,我们通过双残基突变(W215 / 216L)产生了突变的分子(TEC SH3 *),据报道,以灭活TEC激酶家族成员的SH3结构域,btk(20)。该分子与GFP(Tecsh3 * -GFP)融合的该分子不能与TEC SH3结构域的已知合作伙伴相互作用,例如CD28共刺激分子(F.Garçon,未发表的数据)。我们接下来将该构建体转染到T细胞中。与野生型TEC相比,该突变体在细胞质中局部化,在未刺激的T细胞的核中差异差(图3⇓, 上部面板,与图1进行比较。1⇑A)。这些数据与早期的观察结果相适合,如前所述,表明TEC系列成员的一部分通过其SH3结构域与Importinα的结合存在于核中(24)。主要是,我们观察到在大多数T细胞中接触DCS(n = 140),SH3突变体没有明确集中于与TEC和Δphtec相反的(图3⇓, 下面的面板)。在我们的细胞系统中,其中T细胞和DC来自不同供体,在不存在Ag的情况下形成几种稳定的缀合物(图4⇓)。它们最有可能对应于同种异体T细胞反应。在这些缀合物中,我们还观察到TEC和Δphtec的澄清积累,但不是TEC SH3突变体。我们得出结论,职能SH3域是招募TEC的必要条件。

图3。
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FIGURE 3.

TEC的SH3领域是在免疫突触招募TEC的。荧光图像显示分离T细胞中Tecsh3 * -GFP的分布(上部面板)与脉冲混合物脉冲的DCs接触T细胞(下面的面板)。这 右手面板 是DIC面板。数据代表三次独立的实验。

图4。
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FIGURE 4.

TEC招聘需要其SH3结构域,但不是没有凹陷的pH结构域。 A-C. ,dic图像(正确的)在20分钟的相互作用而没有凸起刺激后显示T细胞-DC缀合物。荧光图像(剩下 )显示TEC的亚细胞定位(A),Δphtec(B)和tecsh3 *(C)分子。数据代表两个实验。

TEC及其突变体的功能分析

为了分析在形成期间的TEC活化,我们接下来使用基因报告分析(19)探讨TEC及其突变体对AG呈递诱导的IL-2启动子活性的影响。由于这种测定需要多次转染,因此我们使用由See-Pulsed Raji B细胞作为APCS激活的Jurkat T细胞。我们首先在转染后检查Jurkat中不同TEC-GFP分子的细胞内分布。观察到在TEC和Δphtec的正常静息T细胞中发现的相同醒目差异,并且另一方面是另一方面的TEC-SH3 *。 SH3突变体大大排除在核之外,与整个细胞中TEC和Δphtec的宽分布对比(图5⇓A)。 AG呈现后,TEC和Δphtec,但不是TEC-SH3 *,强烈易于偶联于大多数缀合物,再次展示分子SH3结构域的关键作用以其对IS的再分配(图5⇓B)。接下来研究了不同TEC分子的表达如何改变未刺激的T细胞中的IL-2启动子活性或Ag识别后。在不存在Ag,TEC,但不是Δphtec或tec-sh3 *,诱导低于用空载体获得的对照值的低但重要的IL-2启动子活性。 AG介绍在Jurkat细胞中诱导IL-2启动子活性的强烈增加。通过TEC野生型进一步增强该活性,但不通过Δphtec或tec-sh3 *,其无法触发对照之上的IL-2活性(图5⇓C)。在用ABS刺激CD3 / TCR络合物(数据未显示)刺激Jurkat细胞后获得类似的结果。还使用异源COS-7细胞系统探索TEC活性,其中通过PLC-γ1,众所周知的TEC家族衬底配制不同的TEC突变体(25)。在免疫沉淀后分析PLC-γ1磷酸化并用PLC-γ1PY783特异性AB进行印迹。并行测量不同TEC突变体的表达。结果表明,TEC和较小程度的TEC-SH3 *磷酸盐PLC-γ1。相反,Δphtec完全效率低下(图5⇓D)。总之,这些数据表明pH结构域,尽管TEC的膜定位不需要,显然是其活性,而SH3结构域主要控制激酶的定位。

图5。
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FIGURE 5.

TEC功能需要pH和SH3域。 A,荧光图像显示用TEC-GFP,ΔPHTEC-GFP或TECSH3 * -GFP电穿孔的Jurkat T细胞。 B, Fluorescence images show Jurkat T cells, electroporated with Tec-GFP, ΔPHTEC-GFP,或TECSH3 * -GFP,并用HEEPI突出的RAJI细胞孵育20分钟(1μg/ml). C, Jurkat T cells, electroporated with vector alone; pCDNA3; or indicated Tec constructs, pCDNA3-Tec (TecWT), pCDNA3-ΔPHTec (Δphtec)和pcdna3-tecsh3 *(tecsh3 *),用pil-2-luc和picrobrectβactinR-Luc. After 24-h recovery, cells were left unstimulated (NS) or stimulated for 8 h with an equivalent number of Raji cells or Raji cells pulsed with SEE (10 ng/ml). 插入,相当国旗表达激酶在抗标旗免疫沉淀后的表达,其次是抗TEC ImmnoBlots。所示的数据代表三个实验±SD。 D, COS-7 cells, transfected with the different versions of Tec, were cotransfected with PLC-γ1. PLC-γ1被免疫沉淀并分析磷酸酪氨酸含量。剥离后,用抗PLC重塑膜 - γ1 Abs. Expression level of the different forms of Tec, in the whole cell lysates, is controlled by an anti-Tec Western blot (较低的面板)。数据代表两个实验。

讨论

TEC激酶在导致IL-2生产的T细胞激活中起着重要作用(18, 26)。血浆膜关联参与了许多细胞溶胶激酶的激活。 TEC激酶激活的当前模型涉及它们的pH结构域。在通过可溶性配体交联期间,在细胞表面受体交联期间,将TEC激酶的pH结构域易刻到血浆膜(14, 17, 18, 27)。然而,TEC的定位尚未在生理条件下进行研究,其中T细胞与APC接触。在这项研究中,我们评估了TEC的pH结构域在其上积累的贡献,我们证明TEC的另一个相互作用领域对血浆膜的募集是重要的。

为了评估AG呈递后血浆膜的TEC募集,我们使用了一种实验方法,其中可以用不同的TEC-GFP构建体转染休息的原发性人T细胞,并且可以可视化T细胞和DC之间的细胞缀合物(16)。在AG介绍之后,我们证明TEC被募集到T细胞和DC之间形成。然而,我们的结果还表明,这种募集不需要对pH结构域的存在,因为缺乏pH结构域的TEC分子也非常有效地转移到IS中。这种易位不依赖于TEC的pH域,而是在完整的SH3域上。该结果特别重要,因为TEC激酶易位中pH结构域的必要性是接受的教条。

为了强调这一点,分离的TEC pH结构域在接触成熟DC的T细胞的血浆膜上没有显着积聚。然而,我们从最近的报告中使用AKT的pH域知道,在DC的AG呈现期间,在血浆膜中存在3'-磷酸化的磷酸膦脂质的3'-磷酸化磷酸膦酸脂质的脂质(16)。此外,Akt或TEC的两个pH结构域的细胞内定位在染色体10(PTEN)突变的Jurkat T细胞系上缺失的3'-磷酸酶和张素同源物中不同。如前所述,分离的AKT pH结构域主要定位,并在Jurkat T细胞中的血浆膜中构成思考( 28)。然而,TEC pH结构域恰好恰好在质膜(数据未示出)处于部分地位。这些观察结果支持AKT的pH结构域和TEC激酶的pH结构域可以对PI3K产品的结合性质不同,例如磷脂酰肌醇3,4-双磷酸盐(PI-3,4-P.2)和pi-3,4,5-p3。在TEC激酶家族的成员中,BTK的pH结构域具有很好的表征,并与AKT的pH结构域进行了比较。与肌醇复合物中AKT或BTK pH结构域的两个结构的比较(1, 3, 4, 5)--takishisphophate显示他们的交互方式的关键差异(29, 30, 31)。实际上,D5磷酸盐显示出与Akt的pH结构域上的任何残留物无明显相互作用,与基于该磷酸盐的BTK的pH结构域的识别相反。这解释了为什么AKT与PI-3,4,5-P类似的亲和力相互作用 3 和 PI-3,4-P2,但不是TEC激酶的pH结构域,这不能与PI-3,4-p相互作用2。然而,在AG呈现后T细胞血浆膜产生的主要PI3K产品是PI-3,4,5-P.3 (16)。总的来说,这些观察结果表明,体内PI-3,4,5-p3-NING pH域的性质似乎高于TEC pH结构域的特性。此外,PI3K(P85α)敲除(KO)B细胞显示出AKT的活化受损,但不具有TEC激酶成员,BTK(32)。总之,我们的实验表明,TEC pH结构域既不是必要的,也不足以在Ag呈现后募集到血浆膜的全长蛋白质。

B细胞中最近的研究表明,活化的BTK与血浆膜的募集不受PI3K抑制剂或PI3K(P85α)KO B细胞的影响(32)。对于TECT细胞的TEC,我们的数据还表明,将该激酶附着在膜中需要与pH结构域不同的相互作用结构域。在TEC的不同互动域中,我们将注意力集中在SH3领域。通过与淋巴细胞活化的阳性或负调节剂相互作用,该SH3结构域的存在可以在TEC激酶活化的调节中发挥关键作用(9)。 ITK的SH3点突变体破坏其与SH3结构域的配体结合能力,不能在衍生自ITK-NULL小鼠的T细胞中重建功能事件(33)。在TEC上使用相同种类的SH3点突变体,我们表明SH3结构域至少需要在TEC活化的早期步骤中,例如初级T细胞和Jurkat T细胞中的血浆膜靶向。本招聘的机制仍然未知。在可以定位的TEC SH3结构域的许多合作伙伴中,我们可以建议将TEC激酶通过其SH3结构域附着到质膜:细胞表面受体(如CD28的共刺激分子)(19),参与所述信号组形成的分子作为衔接子SRC同源2结构域的白细胞磷蛋白为76kDa(34)或控制肌动蛋白聚合为Wiskott-Aldrich综合征蛋白的分子( 35)。最近,已经证明另一个TEC激酶,ITK涉及actin聚合的调节是(36)。虽然ITK的SH3结构域的重要性已经在TCR交联通过ABS交联时评估了actin依赖性细胞骨骼事件(37),在突触形成的背景下重新审视这一点将是有趣的。在我们的研究中,我们表明SH3领域可以参与TEC到膜的招募;然而,我们不能排除其他域,例如SH2结构域涉及TEC到质膜的募集(18)。对TEC SH2域的作用的分析需要进一步调查。

为了评估T细胞中的TEC功能,通常根据来自TEC家族 - 零小鼠的T细胞的表型使用两种互补方法。例如,来自ITK KO和RLK / ITK双KO小鼠的T细胞在信令和开发中具有缺陷(38)。因此,对ITK激酶进行结构/功能研究的更代表性的实验将尝试用来自ITK-NULL小鼠的T细胞中的不同突变体恢复ITK功能。来自Tec Ko的T细胞显然不会在信号或发育中呈现可检测的缺陷(39)。在这种情况下,难以使用相同的TEC策略。因此,随着TEC过表达能够在Jurkat细胞中激活或增强IL-2启动子活性(19, 26),这种细胞模型已被用于评估pH结构域对细胞相互作用期间TEC诱导的IL-2启动子活性的重要性。如原发性人T细胞所示,TEC及其pH缺失的突变体同样能够在Jurkat T细胞之间的接触期间移动到免疫突触,并看到脉冲Raji B细胞。尽管节省了TEC激活(靶向)的第一种事件,但似乎需要TEC的pH结构域来增加通过与下垂脉冲Raji细胞接触诱导的IL-2启动子活性。已经提出了其他信号分子,例如PLC-γ1,其pP-γ1对等离子体膜的初始易位不需要其pH结构域,但它稳定在膜中较长的时间(40)。我们的动态研究表明,在T细胞和APC的初始相互作用后,TEC Reorientation发生在3到5分钟之间,并且在接触后持续到20分钟(数据未显示)。使用TEC pH缺失的突变体检测类似的膜结合动力学。这些实验不能完全排除pH结构域可以参与维持TEC激酶在细胞接触后的较长时间点(>20分钟)。但是,我们需要考虑另一种可能性。 TEC家族激酶在T细胞的PLC-γ1激活中起重要作用(26, 41)。 PH域缺失完全通过TEC至磷酸酯PLC-γ1的能力,这可以根据类似的缺失突变体在TCR交联时不超全磷酸化( 18)。因此,TEC pH结构域可以具有除血浆膜靶向以外的功能。 pH结构域可以诱导构象变化,其使得SRC家族激酶或减少对下降调节磷酸酶更易于获得的TEC。

TEC活化的功能研究表明,pH和SH3结构域涉及该PTK的调节。在所有这些方面,评价pH结构域对TEC催化活性的作用以及TEC的SH3合作伙伴的鉴定是有趣的进一步调查问题。

请注意证明。

在审查此手稿的过程中,Tomlinson等。 (42)显示TEC可以在AG呈递上累积在T细胞克隆的免疫突触中。

致谢

我们感谢Ben Margolis提供PLC-γ1表达载体,以及文钦博士在实验室中产生一些初始试剂。我们感谢Yves Collette博士,Bernard PayraStre博士,以及AndrèsAlcover博士,有用的讨论;来自Hulkette Design(www.hulkette.com)的Anne-paule tomasi为彩色艺术设计;和Marie-Claire和Peter Gerhards修正了稿件。

脚注

  • ↵1 来自Institut National de LaSantéet·埃德拉·赫尔赫·麦克契·梅迪卡特和Ligue Nationale Contre Le Cancer(EquipeLabellisée2001)的补助金提供支持。 F.G.来自Ligue Nationale Contre Le癌症的团契支持。

  • ↵2 地址通信和重印jacquesA.Nunès的请求,Institut NuniTaltutal De LaSantéet de La RechercheMédicaleOneréMiledeFacherche599,Institut du Cancer De Marseille,27 BDLeïRoure,13009马赛,法国。电子邮件地址: nunes {marseille.inserm.fr

  • ↵3 本文使用的缩写:是免疫突触; DC,树突细胞; DIC,差分干扰对比; GFP,绿色荧光蛋白; ko,淘汰赛; pH,Pleckstrin同源性; pi-3,4-p2,磷脂酰肌醇3,4-双磷酸盐; pi-3,4,5-p3,磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸盐; PTK,蛋白酪氨酸激酶; sag,superigenen;看,葡萄球菌肠毒素e; SH,SRC同源性; Th,Tec同源性。

  • 已收到 2003年2月19日。
  • 公认 2004年5月6日。
  • 版权© 2004 by The 美国免疫学家协会

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法比恩 格拉森, 乔治 铋, 丹尼尔 Isnardon., 丹尼尔 橄榄, 雅克A. 尼姑
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