抽象的
TEC是TEC酪氨酸激酶系列的原型成员，在T细胞信号中起着重要作用。我们在本研究中展示了当T细胞接触树突细胞时，TEC转向免疫突触。令人惊讶的是，这种积累的Pleckstrin同源性（pH）域的存在不需要，并且尽管在Synapse的形成期间，尽管3'-磷酸化的磷酸膦酸碱基脂质合成的强烈活化，但TEC pH结构域不会被重新分布到T细胞质膜。相反，我们证明了绝对需要活跃的SRC同源3结构域，强调该部分分子在免疫学突触的募集和/或稳定中的本部分发挥的基本作用。尽管如此，我们的结果表明pH结构域控制体内分子的激酶活性。我们终于证明了两个域是触发AG演示后的转录事件所必需的。这些数据支持一种模型，其中含pH的蛋白质TEC的血浆膜募集不依赖于PI3K的3'-磷酸化的磷酸膦脂质的生产，而是对完整的SRC同源3结构域。
有效的T细胞活化需要T细胞和APC之间的适当相互作用。在Ag识别时，在T Cell-APC界面中发生涉及T细胞刺激的分子的复杂隔间化，称为免疫学突触（是）3 (1, 2）。此外，该分区化伴随着并取决于快速的细胞骨架极化（3, 4）。总的来说，这些事件导致朝向靶细胞的细胞因子的T细胞的极化分泌（5 ）。
许多分子参与了突触形成。例如，甚至在形成成熟突触之前发生的T细胞信号传导的早期事件，例如蛋白酪氨酸激酶（PTKS）的激活（6）。在PTK中，SRC激酶家庭成员在in是（7, 8 ）。
另一个PTK系列，TEC激酶在结构上与SRC激酶相似，但它们由含有Pleckstrin同源性（pH）结构域的独特氨基末端区域，其次是TEC同源域。这个家庭由五名成员组成：TEC，BTK，ITK / EMT，RLK / TXK和BMX / ETK（9）。在功能方面，TEC激酶在通过Ag受体和淋巴细胞发育，分化和细胞凋亡期间发挥着重要作用。10）。然而，尽管有许多关于其调节的数据，但尚未研究免疫突触中的TEC激酶。
TEC激酶的pH结构域识别磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸（PI-3,4,5-P.3 ）（ 11, 12, 13）。该pH结构域涉及血浆膜的TEC激酶的易位（14）。在T细胞-APC缀合物形成期间，PI-3,4,5-P3 在接触区域的T细胞中累积（15, 16）。除了磷酸化事件和膜募集外，这些激酶是通过蛋白质结合结构域的和分子间相互作用强烈调节：SRC同源2（SH2）和3（SH3）结构域（10）。 TEC激酶的三个成员在T细胞中表达：TEC，ITK / EMT和RLK / TXK，但只有TEC和ITK含有pH域。该pH结构域与TCR / CD3复合物涉及TCR / CD3复合物与ABS交联（17, 18）。在这些TEC激酶中，TEC特别活跃以诱导细胞因子基因表达（19）。因此，TEC可以是分析T细胞中TEC激酶的易位和功能的有用模型。
在该研究中，我们在人静息T细胞中使用瞬时转染，证明TEC可以在T细胞和树突细胞（DC）之间形成。此外，我们表明该TEC积累以pH独立的方式发生，而其SH3结构域是必要的。在使用伯T细胞或Jurkat细胞的不同类型的T细胞-APC触点中，TEC以pH独立的方式位于血浆膜。然而，pH结构域的存在对于TEC激酶来诱导功能事件仍然很重要。
最后，这些数据在突触形成的早期事件中致力于TEC，并强调这些事件中pH和SH3域的作用。
材料和方法
质粒构建体
以前描述了表达质粒pcdna3-flag-tec（19）。通过PCDNA3-FLAG-TEC的PCDNA3-FLAG-TEC的PCR扩增使用以下引物，含有缺乏pH结构域的鼠TEC cDNA的表达质粒pCDNA3-Δphtec标志：感觉底漆，5'-ATAAGGGATCCAATATATCATGATAAATAC3' ;反义底漆，5'-ActTaactcGagTcatttgtcatcatcgtccttatagtctcttcaaaagtttcttcaca-3'（包含标志表位）。质粒pCDNA3-TECSH3 *编码TEC蛋白，包括在SH3结构域的残基215和216处的TRP的Leu取代（TEC W215 / 216L或TEC SH3 *）。先前对BTK描述了这些突变（20）。通过重叠延伸PCR引入点突变。所有PCR产物均在1％琼脂糖凝胶中分离，分离出并用核缺点XTRACT套件（Macherey-Nagel，Hoerdt，法国）纯化。
GFP融合蛋白表达载体，Δphtec-gfp和tecsh3 * -gfp是通过从pcdna3-Δphtec-flag和pcdna3-flag-tecsh3 *的终止密码子移除，并将标记与标志表位的CDNA引入 XHO. 一世/ BAM PEGFP-N3向量（BD Clontech，Palo Alto，CA）的嗨网站。
TEC的标志标记的pH结构域（AA 1-151）从PCDNA3-FLAG-TEC中扩增了以下引物：感觉底漆，5'-caAgctcgagcGGAGATGACTAC-3';反义底漆，5'-ctggctggatccactctcaaaaAg-3'。 PCR产物亚克隆到 XHO. 一世/ BAM PEGFP-N3表达载体的嗨网站。 Phakt-GFP由T. Meyer（斯坦福大学医学院，斯坦福，加利福尼亚州）提供，并用于以前的研究（16）。 TEC-GFP在实验室中由W.-C.杨。磷脂酶C-γ1（PLC-γ1）进入PRK5表达载体是B. Margolis（密歇根大学医疗中心，Ann Arbor，MI）的善意。将质粒转染到COS-7细胞中并通过SDS-PAGE分析，然后通过免疫印迹，用于使用MAb对GFP的GFP融合构建体的存在。通过DNA测序验证所有构建体。
由IL-2启动子组成的启动子测定质粒pIL-2-LUC，与萤火虫荧光素酶报告基因融合，与β-肌动蛋白启动子组成的Pβ-actin-Rluc，融合 Renilla. 先前报道了荧光素酶基因（19 ）。
细胞培养和转染
如前所述分离和制备人PBL-T和DCS（16）。根据制造商的说明，用Amaxa Nucleofector技术（Köln，德国）转染人的原发性T细胞，并在转染后使用18小时（www.amaxa.com）。对于大多数GFP构建体，静止PBL-T的转染百分比达到40-50％。 COS-7细胞维持在补充有10％FC的DMEM培养基中，2毫米 l - 谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠。 Jurkat JA16 T细胞亚克隆（21）raji b细胞淋巴瘤在补充10％fcs的RPMI 1640培养基中生长，2毫米 l - 谷氨酰胺和1mM丙酮酸钠。如前所述，Jurkat T细胞被电穿孔（19），转染后18小时使用。
试剂和ABS
Superigenen（SAG）混合物（葡萄球菌肠毒素A，B，C3和E（参见））购自毒素技术（Sarasota，FL）。 3-氨基丙基三乙氧基硅烷，聚（l-LYSINE）和PMA购自Sigma-Aldrich（圣路易斯，MO）。荧光安装媒体萤石购自Calbiochem（VWR International SAS，Fontenay-Sous-Bois，France）。先前描述了抗TEC兔多克隆抗血清（19）。抗标志MAb（M2）购自Sigma-Aldrich。从细胞信号技术（Beverly，MA）购买抗磷酸-Y783-PLC-γ1和抗PLC-γ1多克隆ABS。如前所述进行细胞裂解物，免疫沉淀和免疫印迹（19 ）。
荧光分析
对于T细胞-DC缀合物分析，将DC在涂有2μg/ ml聚（1μg）的玻璃盖玻片上（l - 含硅）并安装在培养皿上，并在37℃下用10ng / ml SAg混合物温育20分钟。然后将转染的T细胞加入到DC中并孵育20分钟。然后将缀合物固定在PBS中加4％多聚甲醛，并在分析之前在4℃下储存在PBS中。在倒置显微镜（尼康，Melville，NY）上分析T细胞-DC缀合物，配备差动干扰对比（DIC）。 Jurkat T细胞可以用1μg/ ml脉冲的Raji B细胞形成缀合物，参见15分钟（ 22）。将转染的Jurkat细胞以2：1的比例混合，用跷跷板APC混合，然后在37℃下温育20分钟。刺激后，将细胞置于聚 - l - 含碱涂覆的盖玻片，让沉积物3分钟，然后以300rpm离心1分钟。最后，将这些细胞在室温下固定在30分钟，在PBS中具有3.7％多聚甲醛。将载玻片安装有荧光安装介质。使用共聚焦显微镜进行图像（Leica TCS NT Confocal显微镜; Leica Microsystems，Heidelberg，德国）。
荧光素酶测定
Jurkat细胞（10×106）使用具有10μg的Pl-2-Luc质粒，5μgPβ-肌动蛋白-RLUC和10μg的其他表达质粒，在960μF和250V下电穿孔。用Raji细胞（比率1：1）对APC进行刺激，在37℃下脉冲20分钟，在10ng / ml下看。在细胞裂解后，蛋白质通过Bradford试剂（Bio-rad）定量，然后根据制造商的说明（Promega France Sarl，Charbonnières，法国）进行30μl细胞裂解物。通过标准化的萤火虫荧光素酶的活性校正了结果 Renilla. 荧光素酶和裂解物中蛋白质的定量。
结果
Synapse地层以pH独立的方式诱导接触区的TEC招聘
尚未研究在组建期间的TEC家族激酶募集。使用融合给GFP（TEC-GFP）的野生型TEC分子，首先将其分析在T细胞/ APC缀合物中。 TEC-GFP在人外周血休息T细胞中表达，并且如前所述，将这些细胞与脉冲混合物脉冲脉冲的成熟DCS一起温育（16）。 TEC-GFP在未刺激的T细胞中具有漫射分布（图1⇓A, 上部面板）。在细胞核和细胞质中显着表达分子。在接触DCS的T细胞中，该分布显着修饰。在37℃下20分钟后，百分比细胞（78％）（78％） n = 120），募集大多数TEC-GFP分子在T细胞和DC之间形成（图1⇓A, 下面的面板 ）。
FIGURE 1.
Synapse地层以pH独立的方式诱导TEC对T Cell-APC接触面积的重新定位。 A 和 B，荧光图像显示TEC-GFP的分布（A）和Δphtec-gfp（B）在分离的人外周血t细胞中（上部面板）与脉冲混合物脉冲的DCs接触T细胞（下面的面板）。这 右手面板 是DIC面板。数据代表三次独立的实验。
之前的Jurkat T细胞的研究表明pH结构域是在通过AB交联的TCR触发时募集TEC激酶家族成员，例如ITK或TEC到血浆膜（17, 18）。因此，我们使用PH删除的TEC（ΔPHTEC-GFP）形式来研究其在IS的观察到的TEC积累中的贡献。在未刺激的细胞中，Δphtec-gfp具有漫射分布，例如TEC-GFP（图1⇑B, 上部面板）。在大多数接触DCS的大多数T细胞中仍然观察到该探针的强烈积累（图1⇑B, 下面的面板）（74％， n = 150）。 TEC-GFP和ΔPHTEC-GFP都显示出相同的积累模式，在整个接触区中具有相对均匀的分布。
这些数据显示在AG识别期间在T Cell-DC接口上有效地调动TEC。它们还表明，TEC的pH结构域是该过程的可分配的。
TEC的pH结构域不会易于免疫突触
已显示TEC pH结构域对PI-3,4,5-P具有亲和力3 在PI3K激活后在血浆膜中产生（18）。但是，我们的数据（图1⇑）表明，在T细胞和DC之间的接触区内没有必要招募TEC。因此，我们直接分析其对接触DCS的T细胞的血浆膜的募集，使用含有熔融的TEC域的分子与GFP融合。作为对照，我们在并行使用AKT / PKB的pH结构域也融合到GFP（Aktph-GFP）。该探针已被证明在由于PI-3,4,5-P由于PI-3,4,5-P而易于T细胞的血浆膜易转移到T细胞的血浆膜3 T细胞活化诱导的增加（15, 16）。两个pH结构域显示出与细胞质和未刺激的T细胞的细胞质相同的弥漫分布（图2⇓, 上面面板）。如前所述（16），在接触Ag脉冲DC的T细胞的血浆膜上积累的Aktph-GFP的最大部分（图2⇓A, 下面的面板）。相比之下，Tecph-GFP仍然是核和细胞质（图2⇓B, 下面的面板）。连同图1所示的结果⇑，这些数据强烈建议，TEC的另一个相互作用域不同于pH域，对于TEC的易位是重要的。
FIGURE 2.
人T细胞DC缀合物中TEC pH结构域的分布。 A，与脉冲混合物（0.1μg/ ml）脉冲相互作用的T细胞中PHAKT-GFP的图像。 B，Tecph-GFP在T细胞中的分布形成与DCS的突触。结果来自两个复制实验之一。这 右手面板 是DIC面板。代表性缀合物显示出每实验分析至少70分析。
TEC的SH3领域是在免疫突触招募TEC的必要条件
SH3结构域在血浆膜上靶向信号分子的作用已被重复强调（23），包括TEC激酶家族成员，其中SH3结构域应该在IS（以下）表达的信号体复合物中染成各种蛋白质（10）。这就是为什么要调查其在TEC的募集中的作用的原因，我们通过双残基突变（W215 / 216L）产生了突变的分子（TEC SH3 *），据报道，以灭活TEC激酶家族成员的SH3结构域，btk（20）。该分子与GFP（Tecsh3 * -GFP）融合的该分子不能与TEC SH3结构域的已知合作伙伴相互作用，例如CD28共刺激分子（F.Garçon，未发表的数据）。我们接下来将该构建体转染到T细胞中。与野生型TEC相比，该突变体在细胞质中局部化，在未刺激的T细胞的核中差异差（图3⇓, 上部面板，与图1进行比较。1⇑A）。这些数据与早期的观察结果相适合，如前所述，表明TEC系列成员的一部分通过其SH3结构域与Importinα的结合存在于核中（24）。主要是，我们观察到在大多数T细胞中接触DCS（n = 140），SH3突变体没有明确集中于与TEC和Δphtec相反的（图3⇓, 下面的面板）。在我们的细胞系统中，其中T细胞和DC来自不同供体，在不存在Ag的情况下形成几种稳定的缀合物（图4⇓）。它们最有可能对应于同种异体T细胞反应。在这些缀合物中，我们还观察到TEC和Δphtec的澄清积累，但不是TEC SH3突变体。我们得出结论，职能SH3域是招募TEC的必要条件。
FIGURE 3.
TEC的SH3领域是在免疫突触招募TEC的。荧光图像显示分离T细胞中Tecsh3 * -GFP的分布（上部面板）与脉冲混合物脉冲的DCs接触T细胞（下面的面板）。这 右手面板 是DIC面板。数据代表三次独立的实验。
FIGURE 4.
TEC招聘需要其SH3结构域，但不是没有凹陷的pH结构域。 A-C. ，dic图像（正确的）在20分钟的相互作用而没有凸起刺激后显示T细胞-DC缀合物。荧光图像（剩下 ）显示TEC的亚细胞定位（A），Δphtec（B）和tecsh3 *（C）分子。数据代表两个实验。
TEC及其突变体的功能分析
为了分析在形成期间的TEC活化，我们接下来使用基因报告分析（19）探讨TEC及其突变体对AG呈递诱导的IL-2启动子活性的影响。由于这种测定需要多次转染，因此我们使用由See-Pulsed Raji B细胞作为APCS激活的Jurkat T细胞。我们首先在转染后检查Jurkat中不同TEC-GFP分子的细胞内分布。观察到在TEC和Δphtec的正常静息T细胞中发现的相同醒目差异，并且另一方面是另一方面的TEC-SH3 *。 SH3突变体大大排除在核之外，与整个细胞中TEC和Δphtec的宽分布对比（图5⇓A）。 AG呈现后，TEC和Δphtec，但不是TEC-SH3 *，强烈易于偶联于大多数缀合物，再次展示分子SH3结构域的关键作用以其对IS的再分配（图5⇓B）。接下来研究了不同TEC分子的表达如何改变未刺激的T细胞中的IL-2启动子活性或Ag识别后。在不存在Ag，TEC，但不是Δphtec或tec-sh3 *，诱导低于用空载体获得的对照值的低但重要的IL-2启动子活性。 AG介绍在Jurkat细胞中诱导IL-2启动子活性的强烈增加。通过TEC野生型进一步增强该活性，但不通过Δphtec或tec-sh3 *，其无法触发对照之上的IL-2活性（图5⇓C）。在用ABS刺激CD3 / TCR络合物（数据未显示）刺激Jurkat细胞后获得类似的结果。还使用异源COS-7细胞系统探索TEC活性，其中通过PLC-γ1，众所周知的TEC家族衬底配制不同的TEC突变体（25）。在免疫沉淀后分析PLC-γ1磷酸化并用PLC-γ1PY783特异性AB进行印迹。并行测量不同TEC突变体的表达。结果表明，TEC和较小程度的TEC-SH3 *磷酸盐PLC-γ1。相反，Δphtec完全效率低下（图5⇓D）。总之，这些数据表明pH结构域，尽管TEC的膜定位不需要，显然是其活性，而SH3结构域主要控制激酶的定位。
FIGURE 5.
TEC功能需要pH和SH3域。 A，荧光图像显示用TEC-GFP，ΔPHTEC-GFP或TECSH3 * -GFP电穿孔的Jurkat T细胞。 B, Fluorescence images show Jurkat T cells, electroporated with Tec-GFP, ΔPHTEC-GFP，或TECSH3 * -GFP，并用HEEPI突出的RAJI细胞孵育20分钟（1μg/ml). C, Jurkat T cells, electroporated with vector alone; pCDNA3; or indicated Tec constructs, pCDNA3-Tec (TecWT), pCDNA3-ΔPHTec (Δphtec）和pcdna3-tecsh3 *（tecsh3 *），用pil-2-luc和picrobrectβactinR-Luc. After 24-h recovery, cells were left unstimulated (NS) or stimulated for 8 h with an equivalent number of Raji cells or Raji cells pulsed with SEE (10 ng/ml). 插入，相当国旗表达激酶在抗标旗免疫沉淀后的表达，其次是抗TEC ImmnoBlots。所示的数据代表三个实验±SD。 D, COS-7 cells, transfected with the different versions of Tec, were cotransfected with PLC-γ1. PLC-γ1被免疫沉淀并分析磷酸酪氨酸含量。剥离后，用抗PLC重塑膜 - γ1 Abs. Expression level of the different forms of Tec, in the whole cell lysates, is controlled by an anti-Tec Western blot (较低的面板）。数据代表两个实验。
讨论
TEC激酶在导致IL-2生产的T细胞激活中起着重要作用（18, 26）。血浆膜关联参与了许多细胞溶胶激酶的激活。 TEC激酶激活的当前模型涉及它们的pH结构域。在通过可溶性配体交联期间，在细胞表面受体交联期间，将TEC激酶的pH结构域易刻到血浆膜（14, 17, 18, 27）。然而，TEC的定位尚未在生理条件下进行研究，其中T细胞与APC接触。在这项研究中，我们评估了TEC的pH结构域在其上积累的贡献，我们证明TEC的另一个相互作用领域对血浆膜的募集是重要的。
为了评估AG呈递后血浆膜的TEC募集，我们使用了一种实验方法，其中可以用不同的TEC-GFP构建体转染休息的原发性人T细胞，并且可以可视化T细胞和DC之间的细胞缀合物（16）。在AG介绍之后，我们证明TEC被募集到T细胞和DC之间形成。然而，我们的结果还表明，这种募集不需要对pH结构域的存在，因为缺乏pH结构域的TEC分子也非常有效地转移到IS中。这种易位不依赖于TEC的pH域，而是在完整的SH3域上。该结果特别重要，因为TEC激酶易位中pH结构域的必要性是接受的教条。
为了强调这一点，分离的TEC pH结构域在接触成熟DC的T细胞的血浆膜上没有显着积聚。然而，我们从最近的报告中使用AKT的pH域知道，在DC的AG呈现期间，在血浆膜中存在3'-磷酸化的磷酸膦脂质的3'-磷酸化磷酸膦酸脂质的脂质（16）。此外，Akt或TEC的两个pH结构域的细胞内定位在染色体10（PTEN）突变的Jurkat T细胞系上缺失的3'-磷酸酶和张素同源物中不同。如前所述，分离的AKT pH结构域主要定位，并在Jurkat T细胞中的血浆膜中构成思考（ 28）。然而，TEC pH结构域恰好恰好在质膜（数据未示出）处于部分地位。这些观察结果支持AKT的pH结构域和TEC激酶的pH结构域可以对PI3K产品的结合性质不同，例如磷脂酰肌醇3,4-双磷酸盐（PI-3,4-P.2）和pi-3,4,5-p3。在TEC激酶家族的成员中，BTK的pH结构域具有很好的表征，并与AKT的pH结构域进行了比较。与肌醇复合物中AKT或BTK pH结构域的两个结构的比较（1, 3, 4, 5）--takishisphophate显示他们的交互方式的关键差异（29, 30, 31）。实际上，D5磷酸盐显示出与Akt的pH结构域上的任何残留物无明显相互作用，与基于该磷酸盐的BTK的pH结构域的识别相反。这解释了为什么AKT与PI-3,4,5-P类似的亲和力相互作用 3 和 PI-3,4-P2，但不是TEC激酶的pH结构域，这不能与PI-3,4-p相互作用2。然而，在AG呈现后T细胞血浆膜产生的主要PI3K产品是PI-3,4,5-P.3 (16）。总的来说，这些观察结果表明，体内PI-3,4,5-p3-NING pH域的性质似乎高于TEC pH结构域的特性。此外，PI3K（P85α）敲除（KO）B细胞显示出AKT的活化受损，但不具有TEC激酶成员，BTK（32）。总之，我们的实验表明，TEC pH结构域既不是必要的，也不足以在Ag呈现后募集到血浆膜的全长蛋白质。
B细胞中最近的研究表明，活化的BTK与血浆膜的募集不受PI3K抑制剂或PI3K（P85α）KO B细胞的影响（32）。对于TECT细胞的TEC，我们的数据还表明，将该激酶附着在膜中需要与pH结构域不同的相互作用结构域。在TEC的不同互动域中，我们将注意力集中在SH3领域。通过与淋巴细胞活化的阳性或负调节剂相互作用，该SH3结构域的存在可以在TEC激酶活化的调节中发挥关键作用（9）。 ITK的SH3点突变体破坏其与SH3结构域的配体结合能力，不能在衍生自ITK-NULL小鼠的T细胞中重建功能事件（33）。在TEC上使用相同种类的SH3点突变体，我们表明SH3结构域至少需要在TEC活化的早期步骤中，例如初级T细胞和Jurkat T细胞中的血浆膜靶向。本招聘的机制仍然未知。在可以定位的TEC SH3结构域的许多合作伙伴中，我们可以建议将TEC激酶通过其SH3结构域附着到质膜：细胞表面受体（如CD28的共刺激分子）（19），参与所述信号组形成的分子作为衔接子SRC同源2结构域的白细胞磷蛋白为76kDa（34）或控制肌动蛋白聚合为Wiskott-Aldrich综合征蛋白的分子（ 35）。最近，已经证明另一个TEC激酶，ITK涉及actin聚合的调节是（36）。虽然ITK的SH3结构域的重要性已经在TCR交联通过ABS交联时评估了actin依赖性细胞骨骼事件（37），在突触形成的背景下重新审视这一点将是有趣的。在我们的研究中，我们表明SH3领域可以参与TEC到膜的招募;然而，我们不能排除其他域，例如SH2结构域涉及TEC到质膜的募集（18）。对TEC SH2域的作用的分析需要进一步调查。
为了评估T细胞中的TEC功能，通常根据来自TEC家族 - 零小鼠的T细胞的表型使用两种互补方法。例如，来自ITK KO和RLK / ITK双KO小鼠的T细胞在信令和开发中具有缺陷（38）。因此，对ITK激酶进行结构/功能研究的更代表性的实验将尝试用来自ITK-NULL小鼠的T细胞中的不同突变体恢复ITK功能。来自Tec Ko的T细胞显然不会在信号或发育中呈现可检测的缺陷（39）。在这种情况下，难以使用相同的TEC策略。因此，随着TEC过表达能够在Jurkat细胞中激活或增强IL-2启动子活性（19, 26），这种细胞模型已被用于评估pH结构域对细胞相互作用期间TEC诱导的IL-2启动子活性的重要性。如原发性人T细胞所示，TEC及其pH缺失的突变体同样能够在Jurkat T细胞之间的接触期间移动到免疫突触，并看到脉冲Raji B细胞。尽管节省了TEC激活（靶向）的第一种事件，但似乎需要TEC的pH结构域来增加通过与下垂脉冲Raji细胞接触诱导的IL-2启动子活性。已经提出了其他信号分子，例如PLC-γ1，其pP-γ1对等离子体膜的初始易位不需要其pH结构域，但它稳定在膜中较长的时间（40）。我们的动态研究表明，在T细胞和APC的初始相互作用后，TEC Reorientation发生在3到5分钟之间，并且在接触后持续到20分钟（数据未显示）。使用TEC pH缺失的突变体检测类似的膜结合动力学。这些实验不能完全排除pH结构域可以参与维持TEC激酶在细胞接触后的较长时间点（>20分钟）。但是，我们需要考虑另一种可能性。 TEC家族激酶在T细胞的PLC-γ1激活中起重要作用（26, 41）。 PH域缺失完全通过TEC至磷酸酯PLC-γ1的能力，这可以根据类似的缺失突变体在TCR交联时不超全磷酸化（ 18）。因此，TEC pH结构域可以具有除血浆膜靶向以外的功能。 pH结构域可以诱导构象变化，其使得SRC家族激酶或减少对下降调节磷酸酶更易于获得的TEC。
TEC活化的功能研究表明，pH和SH3结构域涉及该PTK的调节。在所有这些方面，评价pH结构域对TEC催化活性的作用以及TEC的SH3合作伙伴的鉴定是有趣的进一步调查问题。
请注意证明。
在审查此手稿的过程中，Tomlinson等。 （42）显示TEC可以在AG呈递上累积在T细胞克隆的免疫突触中。
致谢
我们感谢Ben Margolis提供PLC-γ1表达载体，以及文钦博士在实验室中产生一些初始试剂。我们感谢Yves Collette博士，Bernard PayraStre博士，以及AndrèsAlcover博士，有用的讨论;来自Hulkette Design（www.hulkette.com）的Anne-paule tomasi为彩色艺术设计;和Marie-Claire和Peter Gerhards修正了稿件。
脚注
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↵1 来自Institut National de LaSantéet·埃德拉·赫尔赫·麦克契·梅迪卡特和Ligue Nationale Contre Le Cancer（EquipeLabellisée2001）的补助金提供支持。 F.G.来自Ligue Nationale Contre Le癌症的团契支持。
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↵2 地址通信和重印jacquesA.Nunès的请求，Institut NuniTaltutal De LaSantéet de La RechercheMédicaleOneréMiledeFacherche599，Institut du Cancer De Marseille，27 BDLeïRoure，13009马赛，法国。电子邮件地址： nunes {marseille.inserm.fr
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↵3 本文使用的缩写：是免疫突触; DC，树突细胞; DIC，差分干扰对比; GFP，绿色荧光蛋白; ko，淘汰赛; pH，Pleckstrin同源性; pi-3,4-p2，磷脂酰肌醇3,4-双磷酸盐; pi-3,4,5-p3，磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸盐; PTK，蛋白酪氨酸激酶; sag，superigenen;看，葡萄球菌肠毒素e; SH，SRC同源性; Th，Tec同源性。
- 已收到 2003年2月19日。
- 公认 2004年5月6日。
- 版权© 2004 by The 美国免疫学家协会
