
抽象的
幼稚T和B细胞的激活仅在有组织的淋巴组织的背景下发生。因此,成熟淋巴细胞的连续再循环对于发育对外国AGS的原发性免疫应答至关重要。我们之前已经表明,低水平的IFN-γ抑制B细胞归巢到次级淋巴结器官。在这项研究中,我们证明了类似的IFN-γ下调整联蛋白介导的粘附和幼稚T和TH2细胞的迁移,并且对幼稚T细胞的体内归巢对淋巴结的影响。此外,我们表明这些低剂量的IFN-γ在体内哮喘模型中具有抗炎作用。因此,与IFN-γ以相对高浓度的促炎效果相比,低剂量IFN-γ似乎对T细胞运输产生了全局抑制效果,并且可以具有作为抗炎剂的临床应用。
外国AGS的身体监测是免疫系统的关键功能。淋巴细胞从血液中迁移到组织和次级淋巴结器官中,并通过淋巴血管和胸道返回血液(1)。大多数淋巴细胞能够进行组织选择性贩运(归巢),识别在专用内皮细胞上的器官特异性粘附分子(2)。通过分子事件的组合募集白细胞:血型细胞使用初级粘附分子拴系,并卷在后帕腔静脉的腔壁上,从而遇到并迅速地转化到上调二级粘附分子的信号,然后调解公司逮捕(3, 4)。
天真的T淋巴细胞通过次级淋巴机关的T细胞区域进行流量,以寻找树突细胞呈递的AG(5, 6)。在Ag识别时,特异性T细胞增殖,并且在偏振细胞因子存在下,分化为TH1或TH2细胞,其产生不同的细胞因子模式,并介导各种类型的保护和病理反应(7, 8)。在T细胞分化为Th1或Th2表型,淋巴结(LN) 4 归巢受体受到抑制的,而获得组织归巢受体的表达(9, 10)。
最近,我们证明,防止与Ag过早的遭遇,未成熟的B细胞向下调节它们对细胞外基质(ECM)的完全介导的粘附性。该抑制由IFN-γ介导,IFN-γ通过未成熟的B细胞转录并分泌,以按自分泌方式向下调节其对LNS的迁移。此外,发现这些低水平的IFN-γ显着影响成熟B细胞的归巢至次级淋巴机器官( 11)。 IFN-γ对体外和体内B淋巴细胞粘附性的强烈抑制作用LED指示我们认为这种细胞因子可能是免疫应答的更通用调节剂,并对免疫系统的其他亚群有影响。因此,在本研究中,我们分析了低水平IFN-γ的能力来调节体外和体内T细胞的迁移。我们的研究结果表明,低水平的IFN-γ在体外防止幼稚T和TH2细胞的粘附和迁移,并在体内哮喘模型中具有抗炎作用。
材料和方法
动物
在6-8周龄时使用C57BL / 6或BALB / C小鼠。所有动物程序都由Weizmann Institute(Rehovot,以色列)的动物研究委员会批准。
细胞
如前所述从小鼠获得脾细胞(12)。使用MACS系统(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)来富集T细胞。将脾细胞与抗CD45R(B220)磁性珠,收集CD45阴性细胞。 CD4.+ 使用抗CD4磁珠富集T细胞。为了获得Th1和Th2细胞,将T细胞富集的群体与CON A(250μg/ ml; Roche,Basel,瑞士)和IL-12一起温育(3.5 ng / ml; Life Technologies,Rockville,MD)或IL- 4(10.3 U / ml;生命技术)96小时。从IL-12处理细胞收集Th1上清液。
粘附法测定
如前所述进行粘合测定(11)。
Transwell迁移
通过使用先前描述的Transwell室测定趋化性(13)。
跟踪体内细胞
基于具有BCECF-am(分子探针,eugene或)的标记细胞的测定,如前所述进行( 11)。
ova致敏和挑战
将Balb / c小鼠免疫I.P.在第0,7和14天,如前所述(14)。 ova / ova组是i.p.从第15天(挑战的第一天)注入300μL0.9%NaCl 5天,每次吸入前5分钟。 IFN-γ组是I.P.从第15天(挑战的第一天)5天,在第15天(挑战的第一天)注入鼠IFN-γ(300μl0.9%NaCl; Genentech,South San San San San San San San Francisco,CA)。
气道多动(AHR)测量
如前所述确定AHR(15)通过计算呼气期间在体积描记盒中测量的增强呼气暂停(PENN)(Buxco Electronics,Sharon,CT)。
Bronchoalveolar灌洗(BAL)
如前所述的最后一次AHR评估后,在第19天,4小时进行BAL(14)。
肺组织学
肺部膨胀1ml 10%福尔马林,直至扩张。如前所述制备石蜡切片的样品(14)。如前所述进行免疫组织化学(16)。将该部分用抗CD3(Serotec,牛津,U.K)染色。然后是生物素化抗大鼠IgG AB。使用3,3-二氨基苯甲酸作为基材进行载玻片。
细胞骨架重排
如前所述分析细胞(13)。
多克隆刺激
CD4+ 在IFN-γ的存在或不存在的情况下在存在或不存在的情况下在存在或不存在的情况下培养T细胞。通过掺入[含量4天后测定增殖3H]胸苷。
结果
IFN的低水平γ inhibit integrin-mediated adhesion and migration of T cells in vitro
要迁移到LNS或炎症的网站,T细胞必须与ECM的组件相互作用(5)。为了确定低水平的IFN-γ是否对幼稚T细胞归盐,我们将它们的整合蛋白介导的粘附性与主要ECM成分,纤维菌蛋白。 51用PMA激活Cr标记的幼稚T细胞,整合蛋白介导的粘合剂的有效激动剂(17)或基质细胞衍生的因子1(SDF-1),效率T细胞化学抑制剂和整联素激动剂(18)在存在或不存在低水平的IFN-γ(0.1u / ml)。在激活后,在纤连蛋白对纤连蛋白的粘附性急剧增加,而在低水平的IFN-γ存在下(图1⇓A)废除了对PMA或这些T细胞的PMA或化学反应剂的整联蛋白介导的粘附响应。
FIGURE 1.
IFN的低水平γ inhibit adhesion migration and homing of T cells. A, 51将Cr标记的T细胞重悬于存在或不存在SDF-1或PMA刺激的情况下,在存在或不存在IFN-γ的情况下,分析从TH1细胞收集的上清液和粘附。描绘了一个代表五个的实验。 B, 51在存在或不存在PMA刺激的情况下重新悬浮CR标记的T细胞在存在或不存在IFN-γ和粘附的情况下进行PMA刺激。 C,在IFN-γ的存在或不存在下,将T细胞置于Transwell平板上。孵育3小时后测量迁移,并通过FACS分析。描绘了三个代表三个的实验。 D,用IFN-γ预处理T细胞30分钟。然后用SDF-1刺激细胞。接下来,将细胞固定,透氧,它们的细胞内F-肌动蛋白染色,用FITC-Phalloidin染色,并被FACS分析。未处理细胞获得的结果被认为是F-Actin的100%聚合。描绘了一个代表五个的实验。 E, CD4+ T cells purified from C57BL/6 mice were cultured in the presence of Con A (2.5 μg / ml)在存在或没有升高的IFN浓度的情况下γ。通过添加1来确定增殖μCi of [3H]胸苷在培养的最后18小时。 F,将Th2细胞在Transwell平板上的IFN-γ的存在或不存在中温育。在孵育3小时后测量迁移,BACS分析细胞数。描绘了三个代表三个的实验。 G, T cells labeled with BCECF AM were incubated in the presence or absence of IFN-γ注射到小鼠。 3.5小时后,收集LN并通过FACS分析FITC阳性群。
因为IFN-γ以高水平分泌的(〜350ng / ml,相当于〜35,000u / ml),所以T细胞可能遇到体内高水平的IFN-γ。为了研究这些高水平的IFN-γ对幼稚T细胞的归巢有任何影响,我们在从培养的Th1细胞收集的上清液中检查了幼稚T细胞对纤维菌蛋白的粘附性。如图1所示⇑A,Th1细胞上清液没有改变PMA或SDF-1刺激的T细胞的粘附响应,并且它们能够以类似于未处理的细胞的方式增加它们的粘附反应。此外,在高水平的RIFN-γ(50U / mL)存在下,粘附响应难以影响(图1⇑B)。因为th1细胞分泌~104 IFN-γ水平较高,而不是我们的测定(19, 20)我们的结果表明,虽然IFN-γ的低水平调节细胞的粘附和迁移,但高水平的IFN-γ不同样影响这些过程。
我们进一步分析了低水平IFN-γ对幼稚T细胞Transwell趋化迁移的抑制作用。野生T细胞悬浮,或没有低(0.1u / ml),更高(1和10u / ml)的IFN-γ水平,置于Transwell的上部室中,并且允许朝向SDF-1迁移在下腔室。 IFN-γ的低水平抑制T细胞迁移到SDF-1的〜30%(图1⇑C),而较高剂量的这种细胞因子(1和10u / ml)对细胞的迁移没有抑制作用。
在B细胞中,IFN-γ的抑制信号通过IFN-γ受体透射,其接合导致抑制细胞骨架重排(13)。为了确定IFN-γ是否类似地调节T细胞中的细胞骨骼重排,我们跟随SDF-1-活化的幼稚T细胞的肌动蛋白聚合,其在较低(0.1u / ml)和更高的存在或不存在下预孵育(1U / IFN-γ的mL)水平。如图1所示⇑D,SDF-1刺激诱导肌动蛋白聚合,其通过用0.1U / mL的IFN-γ进行预处理而受到抑制。在这种细胞因子的含量较高的存在下,这种抑制损失。因此,通过低水平的IFN-γ对T细胞的粘附和迁移的抑制与降低的肌动蛋白聚合相关。
直接表明IFN-γ的低水平对细胞无毒,我们分析了CD4+ T细胞增殖在存在或不存在IFN-γ的情况下。如图1所示⇑E,IFN-γ不抑制细胞的增殖响应,表明T细胞的粘附性和迁移不会因细胞死亡而导致。
当野生T细胞发现它们的特定AG时,它们会增殖并分化成效应和记忆T细胞。效应器CD4.+ T细胞可以细分为两个功能不同的子集,TH1和TH2细胞。因为TH2细胞不分解IFN-γ,所以我们确定了TH2细胞的迁移是否通过低水平的IFN-γ类似地影响。用或没有低水平的IFN-γ预处理的Th2细胞置于Transwurl的上室中,并允许朝向放置在下腔室中的SDF-1迁移。如图1所示⇑F,低剂量IFN-γ抑制了SDF-1激活的TH2细胞的迁移。然而,Th2细胞对IFN-γ具有更宽的剂量反应,并且1U / mL IFN-γ抑制细胞的趋化依赖性迁移,表明幼稚和效应T细胞群对各种IFN-γ浓度的反应不同。
IFN的低水平γ have an anti-inflammatory function in vivo
IFN-γ对T淋巴细胞粘附性和迁移的体外强大抑制作用表明,这种细胞因子可能调节体内T细胞的归巢并用作抗炎化合物。为了确定IFN-γ对幼稚T细胞归巢的体内效果,我们分析了它们进入LNS的进入。洗涤在存在或不存在IFN-γ(0.1或1U / mL)的情况下预孵育的T细胞,用荧光染料标记,并注射了相同数量的IFN处理和 - 次细胞I.V。进入小鼠。注射后3.5小时测定在LN中回收的标记细胞的比例。如图1所示⇑G相比,与对照(中等处理)群体相比,IFN-γ-处理细胞的归还几乎废除。因此,IFN-γ抑制Naive T细胞的迁移到LNS。
为了进一步研究IFN-γ的体内效应,我们分析了哮喘模型中对效应Th2细胞的影响。哮喘是气道的慢性炎症疾病,其特征在于气道阻塞和喘息的间歇性发作。哮喘的特征在于可变气流阻塞,AHR和气道炎症。虽然哮喘是多因素的原产地,但已经表明T淋巴细胞,特别是CD4+ T细胞产生Th2的细胞因子模式,对该疾病的发病机制具有突出的效果(16, 21)。为了检查低剂量IFN-γ对过敏气道反应性的可能抗炎作用,我们使用了I.P的治疗方案。在OVA吸入的第一天开始注射IFN-γ的6U /天(0.25 U / g)。如图2所示⇓A,吸入雾化OVA导致嗜酸性粒细胞渗透(48.9%OVA / OVA对0.3%对照; p = 0.0026)和淋巴细胞(14.5%OVA / OVA与3.4%对照)进入OVA敏化小鼠的BAL中,而低剂量的IFN-γ显着抑制了Ag诱导的嗜酸性粒细胞(16.8%IFN-γ与48.9%OVA / ova; p = 0.01)和淋巴细胞(8.7%IFN-γ与14.5%OVA / OVA)募集到BAL中。此外,低水平的IFN-γ显着抑制淋巴细胞归巢到肺部LNS(图2⇓B)。
FIGURE 2.
IFN的低水平γ显着抑制过敏反应。对照(未处理)ova-primed小鼠(OVA / OVA)和ova-丙啶小鼠I.P.注射IFN-γ were analyzed for (A) BAL cell recovery in mice after treatment with IFN-γ. Percentage of eosinophils and lymphocytes recovery in BAL fluids from control。值代表九只动物的平均值。 B,淋巴细胞的数量达到肺部。值代表四只动物的平均值。 C, Airway responsiveness was assessed on day 15. Values shown represent ΔPENN,通过在临时或早期AG挑战之后从PENN测量开始之前减去控制PENN测量来计算。基线PENN水平在未处理的对照,OVA-灌注小鼠和用IFN处理的ova-priped小鼠之间进行了相当的相当。γ。值代表九只动物的平均值。
在卵巢吸入(早期反应)后立即在基线(第0天)和OVA吸入后24小时(晚期反应),在基线(第0天)评估AHR。 ova / ova攻击的小鼠对早期的Ag挑战(ΔPenn用于早期反应的ΔPenn为0.93;基线0.092 vs / ova 0.185的ΔPenn; p = 0.0002)。此外,OVA / OVA挑战小鼠的气道反应性显着增强到后期AG挑战(ΔPenn0.52)。然而,在对照(非挑城)小鼠的早期反应(ΔPenn0.04)或后反应(ΔPenn0.02)中没有观察到AHR。用低剂量IFN-γ治疗OVA / OVA挑战小鼠显着降低AHR(OVA / OVA 0.185 VS IFN-γ0.113; p = 0.000028)。对于早期反应的ΔPenn显着降低79%(ΔPenn早期反应OVA 0.93VsδPenn早期反应IFN-γ0.2)。另外,IFN-γ在OVA攻击小鼠中减少了后期的AHR(OVA / OVA 0.14 Vs IFN-γ0.11; p = 0.03)。 δPenn用于晚期反应显着降低59%(ΔPenn晚期反应OVA 0.48VsδPenn后反应IFN-γ0.2)(图2⇑C)。
来自OVA小鼠的肺组织的组织病理学检查揭示了由嗜酸性粒细胞,淋巴细胞,巨噬细胞和对照小鼠中未见的嗜酸性粒细胞,淋巴细胞,巨噬细胞和中性粒细胞的血管血管浸润物(图3⇓)。通过两个不同的观众赋予血频和血管外炎症浸润的炎症评分为1和4。与对照动物相比,OVA / OVA处理的小鼠中的炎症浸润显着增加(OVA / OVA 3±0.86 Vs对照0.11±0.33; p = 7 × 10−8)。低剂量IFN-γ-处理小鼠的肺组织学变化几乎无法检测到,有证据表明炎性细胞周围的炎性细胞略微积聚。这些IFN-γ处理的小鼠(IFN-γ0.88±0.54 Vs ova / OVA 3±0.86,血浆电气炎症渗透性显着降低; p = 0.000013).
FIGURE 3.
在接受IFN-γ处理的小鼠中肺组织学。用IFN-γ(OVA / OVA + IFN)处理的控制OVA引发(OVA / OVA)和OVA引发的组织学特征。 A1-3,×10; B1-3,×60; C1-3,BAL×100; D1-3×20 CD3细胞。
肺组织的免疫组织化学染色在OVA / OVA小鼠中显示出增加的T细胞数量(CD3阳性细胞)。低剂量IFN-γ的小鼠的治疗显着降低了该T细胞浸润(图3⇑)。
讨论
IFNS最初被描述为诱导的一组相关分子,以介导对病毒感染的即时防御反应。 II型IFN或IFN-γ最初基于其抗病毒活动鉴定,现在已知将其作为促炎性分子的重要作用(22)。以前,我们表明,低水平的IFN-γ向下调节B细胞归巢,但不是脾脏(11)。本研究中呈现的数据表明,低水平的IFN-γ抑制了T细胞的类似过程,因此下调TH2炎症反应。
低剂量IFN-γ抑制野生T细胞和体外Th2细胞的粘附性和翻转迁移。 IFN-γ对幼稚T细胞的影响是浓度依赖性,其最大抑制迁移和细胞骨架重排在0.1u / ml时。此外,我们的结果证明了IFN-γ低水平的体内效应的抑制作用。低水平的这种细胞因子抑制标记的幼稚细胞对LNS的迁移,并降低了哮喘TH2模型中的支气管气道的AHR,气道炎症和嗜酸性粒细胞募集。因此,IFN-γ除了用作局部促炎细胞因子之外,可以在特定条件下发挥对抗细胞的反应炎症作用。血液中的循环效应细胞暴露在血液中或脾脏到低水平的IFN-γ可以用于抑制它们的迁移能力。我们建议在体内模型中观察到的深远抑制可能是由于IFN-γ对各种T细胞群体的综合影响。这些低水平的IFN-γ向下调节幼稚T细胞的归位,从而减少将这些T细胞暴露于Ag,因此防止了它们的活化。此外,这些低水平的IFN-γ显着抑制效应子Th2细胞的归巢至它们施加其功能的炎症部位。因此,IFN-γ在哮喘模型中具有双重功能,既是敏化和效应阶段,这导致对炎症反应的急剧抑制。
先前,几项研究分析了IFN-γ对哮喘的影响。针对IFN-γ受体基因的靶向破坏导致延长的气道嗜酸性粒细胞率为过敏原( 23)。此外,I.P. RIFN-γ的施用以一种剂量依赖性方式降低了OVA诱导的嗜酸性粒细胞浸润,在600 u /日具有显着的最小效果,并且在高于20,000 /天的剂量下几乎完全抑制( 24)。这些相对高剂量的IFN-γ被认为在从TH2至Th1细胞的转变中起作用,可以提高其他促炎介质的效果。我们的研究结果表明,如果适当靶向,则低水平的IFN-γ可能具有临床应用作为抗炎剂。
致谢
我们谢谢林德,罗恩·阿隆和迈克尔施瓦茨;和Shachar实验室的成员有用的讨论和想法和审查这份手稿。
脚注
- 已收到 2002年1月15日。
- 公认 2002年2月25日。
- 版权© 2002 by The 美国免疫学家协会