切削刃：IFN-γ低水平的抗炎性质

动物

在6-8周龄时使用C57BL / 6或BALB / C小鼠。所有动物程序都由Weizmann Institute（Rehovot，以色列）的动物研究委员会批准。

细胞

如前所述从小鼠获得脾细胞（12）。使用MACS系统（Miltenyi Biotec，Auburn，CA）来富集T细胞。将脾细胞与抗CD45R（B220）磁性珠，收集CD45阴性细胞。 CD4.⁺ 使用抗CD4磁珠富集T细胞。为了获得Th1和Th2细胞，将T细胞富集的群体与CON A（250μg/ ml; Roche，Basel，瑞士）和IL-12一起温育（3.5 ng / ml; Life Technologies，Rockville，MD）或IL- 4（10.³ U / ml;生命技术）96小时。从IL-12处理细胞收集Th1上清液。

粘附法测定

如前所述进行粘合测定（11）。

Transwell迁移

通过使用先前描述的Transwell室测定趋化性（13）。

跟踪体内细胞

基于具有BCECF-am（分子探针，eugene或）的标记细胞的测定，如前所述进行（ 11）。

ova致敏和挑战

将Balb / c小鼠免疫I.P.在第0,7和14天，如前所述（14）。 ova / ova组是i.p.从第15天（挑战的第一天）注入300μL0.9％NaCl 5天，每次吸入前5分钟。 IFN-γ组是I.P.从第15天（挑战的第一天）5天，在第15天（挑战的第一天）注入鼠IFN-γ（300μl0.9％NaCl; Genentech，South San San San San San San San Francisco，CA）。

气道多动（AHR）测量

如前所述确定AHR（15）通过计算呼气期间在体积描记盒中测量的增强呼气暂停（PENN）（Buxco Electronics，Sharon，CT）。

Bronchoalveolar灌洗（BAL）

如前所述的最后一次AHR评估后，在第19天，4小时进行BAL（14）。

肺组织学

肺部膨胀1ml 10％福尔马林，直至扩张。如前所述制备石蜡切片的样品（14）。如前所述进行免疫组织化学（16）。将该部分用抗CD3（Serotec，牛津，U.K）染色。然后是生物素化抗大鼠IgG AB。使用3,3-二氨基苯甲酸作为基材进行载玻片。

细胞骨架重排

如前所述分析细胞（13）。

多克隆刺激

CD4⁺ 在IFN-γ的存在或不存在的情况下在存在或不存在的情况下在存在或不存在的情况下培养T细胞。通过掺入[含量4天后测定增殖³H]胸苷。

IFN的低水平γ inhibit integrin-mediated adhesion and migration of T cells in vitro

要迁移到LNS或炎症的网站，T细胞必须与ECM的组件相互作用（5）。为了确定低水平的IFN-γ是否对幼稚T细胞归盐，我们将它们的整合蛋白介导的粘附性与主要ECM成分，纤维菌蛋白。 ⁵¹用PMA激活Cr标记的幼稚T细胞，整合蛋白介导的粘合剂的有效激动剂（17）或基质细胞衍生的因子1（SDF-1），效率T细胞化学抑制剂和整联素激动剂（18）在存在或不存在低水平的IFN-γ（0.1u / ml）。在激活后，在纤连蛋白对纤连蛋白的粘附性急剧增加，而在低水平的IFN-γ存在下（图1⇓A）废除了对PMA或这些T细胞的PMA或化学反应剂的整联蛋白介导的粘附响应。

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FIGURE 1.

IFN的低水平γ inhibit adhesion migration and homing of T cells. A, ⁵¹将Cr标记的T细胞重悬于存在或不存在SDF-1或PMA刺激的情况下，在存在或不存在IFN-γ的情况下，分析从TH1细胞收集的上清液和粘附。描绘了一个代表五个的实验。 B, ⁵¹在存在或不存在PMA刺激的情况下重新悬浮CR标记的T细胞在存在或不存在IFN-γ和粘附的情况下进行PMA刺激。 C，在IFN-γ的存在或不存在下，将T细胞置于Transwell平板上。孵育3小时后测量迁移，并通过FACS分析。描绘了三个代表三个的实验。 D，用IFN-γ预处理T细胞30分钟。然后用SDF-1刺激细胞。接下来，将细胞固定，透氧，它们的细胞内F-肌动蛋白染色，用FITC-Phalloidin染色，并被FACS分析。未处理细胞获得的结果被认为是F-Actin的100％聚合。描绘了一个代表五个的实验。 E, CD4⁺ T cells purified from C57BL/6 mice were cultured in the presence of Con A (2.5 μg / ml）在存在或没有升高的IFN浓度的情况下γ。通过添加1来确定增殖μCi of [³H]胸苷在培养的最后18小时。 F，将Th2细胞在Transwell平板上的IFN-γ的存在或不存在中温育。在孵育3小时后测量迁移，BACS分析细胞数。描绘了三个代表三个的实验。 G, T cells labeled with BCECF AM were incubated in the presence or absence of IFN-γ注射到小鼠。 3.5小时后，收集LN并通过FACS分析FITC阳性群。

因为IFN-γ以高水平分泌的（〜350ng / ml，相当于〜35,000u / ml），所以T细胞可能遇到体内高水平的IFN-γ。为了研究这些高水平的IFN-γ对幼稚T细胞的归巢有任何影响，我们在从培养的Th1细胞收集的上清液中检查了幼稚T细胞对纤维菌蛋白的粘附性。如图1所示⇑A，Th1细胞上清液没有改变PMA或SDF-1刺激的T细胞的粘附响应，并且它们能够以类似于未处理的细胞的方式增加它们的粘附反应。此外，在高水平的RIFN-γ（50U / mL）存在下，粘附响应难以影响（图1⇑B）。因为th1细胞分泌~10⁴ IFN-γ水平较高，而不是我们的测定（19, 20）我们的结果表明，虽然IFN-γ的低水平调节细胞的粘附和迁移，但高水平的IFN-γ不同样影响这些过程。

我们进一步分析了低水平IFN-γ对幼稚T细胞Transwell趋化迁移的抑制作用。野生T细胞悬浮，或没有低（0.1u / ml），更高（1和10u / ml）的IFN-γ水平，置于Transwell的上部室中，并且允许朝向SDF-1迁移在下腔室。 IFN-γ的低水平抑制T细胞迁移到SDF-1的〜30％（图1⇑C），而较高剂量的这种细胞因子（1和10u / ml）对细胞的迁移没有抑制作用。

在B细胞中，IFN-γ的抑制信号通过IFN-γ受体透射，其接合导致抑制细胞骨架重排（13）。为了确定IFN-γ是否类似地调节T细胞中的细胞骨骼重排，我们跟随SDF-1-活化的幼稚T细胞的肌动蛋白聚合，其在较低（0.1u / ml）和更高的存在或不存在下预孵育（1U / IFN-γ的mL）水平。如图1所示⇑D，SDF-1刺激诱导肌动蛋白聚合，其通过用0.1U / mL的IFN-γ进行预处理而受到抑制。在这种细胞因子的含量较高的存在下，这种抑制损失。因此，通过低水平的IFN-γ对T细胞的粘附和迁移的抑制与降低的肌动蛋白聚合相关。

直接表明IFN-γ的低水平对细胞无毒，我们分析了CD4⁺ T细胞增殖在存在或不存在IFN-γ的情况下。如图1所示⇑E，IFN-γ不抑制细胞的增殖响应，表明T细胞的粘附性和迁移不会因细胞死亡而导致。

当野生T细胞发现它们的特定AG时，它们会增殖并分化成效应和记忆T细胞。效应器CD4.⁺ T细胞可以细分为两个功能不同的子集，TH1和TH2细胞。因为TH2细胞不分解IFN-γ，所以我们确定了TH2细胞的迁移是否通过低水平的IFN-γ类似地影响。用或没有低水平的IFN-γ预处理的Th2细胞置于Transwurl的上室中，并允许朝向放置在下腔室中的SDF-1迁移。如图1所示⇑F，低剂量IFN-γ抑制了SDF-1激活的TH2细胞的迁移。然而，Th2细胞对IFN-γ具有更宽的剂量反应，并且1U / mL IFN-γ抑制细胞的趋化依赖性迁移，表明幼稚和效应T细胞群对各种IFN-γ浓度的反应不同。

IFN的低水平γ have an anti-inflammatory function in vivo

IFN-γ对T淋巴细胞粘附性和迁移的体外强大抑制作用表明，这种细胞因子可能调节体内T细胞的归巢并用作抗炎化合物。为了确定IFN-γ对幼稚T细胞归巢的体内效果，我们分析了它们进入LNS的进入。洗涤在存在或不存在IFN-γ（0.1或1U / mL）的情况下预孵育的T细胞，用荧光染料标记，并注射了相同数量的IFN处理和 - 次细胞I.V。进入小鼠。注射后3.5小时测定在LN中回收的标记细胞的比例。如图1所示⇑G相比，与对照（中等处理）群体相比，IFN-γ-处理细胞的归还几乎废除。因此，IFN-γ抑制Naive T细胞的迁移到LNS。

为了进一步研究IFN-γ的体内效应，我们分析了哮喘模型中对效应Th2细胞的影响。哮喘是气道的慢性炎症疾病，其特征在于气道阻塞和喘息的间歇性发作。哮喘的特征在于可变气流阻塞，AHR和气道炎症。虽然哮喘是多因素的原产地，但已经表明T淋巴细胞，特别是CD4⁺ T细胞产生Th2的细胞因子模式，对该疾病的发病机制具有突出的效果（16, 21）。为了检查低剂量IFN-γ对过敏气道反应性的可能抗炎作用，我们使用了I.P的治疗方案。在OVA吸入的第一天开始注射IFN-γ的6U /天（0.25 U / g）。如图2所示⇓A，吸入雾化OVA导致嗜酸性粒细胞渗透（48.9％OVA / OVA对0.3％对照; p = 0.0026）和淋巴细胞（14.5％OVA / OVA与3.4％对照）进入OVA敏化小鼠的BAL中，而低剂量的IFN-γ显着抑制了Ag诱导的嗜酸性粒细胞（16.8％IFN-γ与48.9％OVA / ova; p = 0.01）和淋巴细胞（8.7％IFN-γ与14.5％OVA / OVA）募集到BAL中。此外，低水平的IFN-γ显着抑制淋巴细胞归巢到肺部LNS（图2⇓B）。

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FIGURE 2.

IFN的低水平γ显着抑制过敏反应。对照（未处理）ova-primed小鼠（OVA / OVA）和ova-丙啶小鼠I.P.注射IFN-γ were analyzed for (A) BAL cell recovery in mice after treatment with IFN-γ. Percentage of eosinophils and lymphocytes recovery in BAL fluids from control。值代表九只动物的平均值。 B，淋巴细胞的数量达到肺部。值代表四只动物的平均值。 C, Airway responsiveness was assessed on day 15. Values shown represent ΔPENN，通过在临时或早期AG挑战之后从PENN测量开始之前减去控制PENN测量来计算。基线PENN水平在未处理的对照，OVA-灌注小鼠和用IFN处理的ova-priped小鼠之间进行了相当的相当。γ。值代表九只动物的平均值。

在卵巢吸入（早期反应）后立即在基线（第0天）和OVA吸入后24小时（晚期反应），在基线（第0天）评估AHR。 ova / ova攻击的小鼠对早期的Ag挑战（ΔPenn用于早期反应的ΔPenn为0.93;基线0.092 vs / ova 0.185的ΔPenn; p = 0.0002）。此外，OVA / OVA挑战小鼠的气道反应性显着增强到后期AG挑战（ΔPenn0.52）。然而，在对照（非挑城）小鼠的早期反应（ΔPenn0.04）或后反应（ΔPenn0.02）中没有观察到AHR。用低剂量IFN-γ治疗OVA / OVA挑战小鼠显着降低AHR（OVA / OVA 0.185 VS IFN-γ0.113; p = 0.000028）。对于早期反应的ΔPenn显着降低79％（ΔPenn早期反应OVA 0.93VsδPenn早期反应IFN-γ0.2）。另外，IFN-γ在OVA攻击小鼠中减少了后期的AHR（OVA / OVA 0.14 Vs IFN-γ0.11; p = 0.03）。 δPenn用于晚期反应显着降低59％（ΔPenn晚期反应OVA 0.48VsδPenn后反应IFN-γ0.2）（图2⇑C）。

来自OVA小鼠的肺组织的组织病理学检查揭示了由嗜酸性粒细胞，淋巴细胞，巨噬细胞和对照小鼠中未见的嗜酸性粒细胞，淋巴细胞，巨噬细胞和中性粒细胞的血管血管浸润物（图3⇓）。通过两个不同的观众赋予血频和血管外炎症浸润的炎症评分为1和4。与对照动物相比，OVA / OVA处理的小鼠中的炎症浸润显着增加（OVA / OVA 3±0.86 Vs对照0.11±0.33; p = 7 × 10⁻⁸）。低剂量IFN-γ-处理小鼠的肺组织学变化几乎无法检测到，有证据表明炎性细胞周围的炎性细胞略微积聚。这些IFN-γ处理的小鼠（IFN-γ0.88±0.54 Vs ova / OVA 3±0.86，血浆电气炎症渗透性显着降低; p = 0.000013).

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FIGURE 3.

在接受IFN-γ处理的小鼠中肺组织学。用IFN-γ（OVA / OVA + IFN）处理的控制OVA引发（OVA / OVA）和OVA引发的组织学特征。 A1-3，×10; B1-3，×60; C1-3，BAL×100; D1-3×20 CD3细胞。

肺组织的免疫组织化学染色在OVA / OVA小鼠中显示出增加的T细胞数量（CD3阳性细胞）。低剂量IFN-γ的小鼠的治疗显着降低了该T细胞浸润（图3⇑）。